Name: フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 学ぼう、フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の迅速検出法。遠赤色蛍光プローブと二重マーカー染色により、化学療法誘導性老化細胞の高精度同定と濃縮を実現する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

シカゴ大学のサイトメトリーおよび抗体コアファシリティには、フローサイトメトリー機器のサポートに感謝します。シカゴ大学の動物研究センターは動物の住居を提供しました。

<ol><li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li>
<li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells+in+cancer+therapy%3A+friends+or+foes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li>
<li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+senescence%3A+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li>
<li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Topics+in+Gerontology+and+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li>
<li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer%3A+from+mechanisms+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li>
<li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501(2019).</li>
<li>Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+senescence-associated+%CE%B2+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Tung, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+%CE%B2-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li>
<li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li>
<li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li>
<li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li>
<li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li>
<li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).</li>
<li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li>
<li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).</li>
<li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+SENESCopedia%3A+A+delineation+of+cancer+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441(2021).</li>
<li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677(2019).</li>
<li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li>
<li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li>
<li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism%2C+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).</li>
<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
<li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+exhibiting+strong+p16+%28INK4a%29+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li>
<li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li>
<li>Baek, K. -H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li>
<li>González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

著者らは、この研究のために宣言する利益相反はありません。

過去10年ほどで、フローサイトメトリーは、腫瘍免疫学の人気の高まり、低コストのフローサイトメーターの開発、および学術機関での共有機器施設の改善により、癌研究においてより一般的なアッセイプラットフォームになりました。マルチカラーアッセイは現在標準であり、ほとんどの新しい機器には紫、青緑、赤から遠赤色の光学アレイが装備されています。したがって、このDDAOGプロトコルは、幅広いフローサイトメーターと互換性がある可能性があります。もちろん、どのフローサイトメーターもユーザーが評価する必要があります。蛍光色素(蛍光、コンジュゲート抗体など)をDDAOGアッセイに追加する場合は、特に注意が必要です。チャンネル間の蛍光色素クロストークの評価は、他のすべての関連チャンネルで可視化された単一染色コントロールを使用して実施する必要があります。オーバーラップが観察される場合、スペクトル補償は、典型的な方法に従って補正のために20 行うことができる。
ここに示されている知見は、DDAOGフローサイトメトリーアッセイが、細胞または腫瘍における化学療法薬によっ...

老化細胞は通常、通常の生物学的老化の間に何年にもわたって生物に蓄積しますが、放射線や化学療法を含むさまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞で急速に発達することもあります。もはや増殖しないが、治療誘発老化(TIS)腫瘍細胞は治療抵抗性に寄与し、再発を引き起こす可能性がある1,2,3。TIS細胞によって分泌される因子は、免疫回避または転移を促進することにより、腫瘍の悪性腫瘍を悪化させる可能性があります4,5。TIS細胞は、複雑な状況特異的な表現型、変化した代謝プロファイル、および独自の免疫応答を発達させます6,7,8。したがって、さまざまな癌治療アプローチによって誘導されるTIS腫瘍細胞の同定と特性評価は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。
TIS腫瘍細胞を検出するために、従来の老化アッセイが広く用いられており、主として老化マーカー酵素であるリソソームβ-ガラクトシダーゼGLB19の活性の増加を検出することに基づいている。(酸性ではなく)中性に近いリソソームpHでの検出により、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)10を特異的に検出できます。数十年にわたって使用されてきた標準的なSA-β-Galアッセイは、青色発色ベータガラクトシダーゼ基質であるX-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を使用して、光学顕微鏡によって固定細胞中のSA-β-Galを検出します11。X-Galアッセイは、一般的に入手可能な試薬や実験装置を利用してTISを定性的に視覚的に確認することができます。基本的な透過光顕微鏡は、青色色原体の存在を評価するために必要な唯一の機器です。ただし、X-Gal染色手順は感度に欠ける可能性があり、色が発色するまでに24時間以上かかる場合があります。染色に続いて、光学顕微鏡下で青色色原体のある程度の強度を示す細胞をカウントすることに基づいて、個々の老化細胞の低スループットの主観的スコアリングが行われます。X-Galは細胞不透過性であるため、このアッセイには溶媒固定細胞が必要であり、ダウンストリーム分析のために回収することはできません。動物や患者からの限られたサンプルを扱う場合、これは大きな欠点になる可能性があります。
C 12-FDG(5-ドデカノイルアミノフルオレセインジβ-D-ガラクトピラノシド、緑色)およびDDAOG(9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)β-D-ガラクトピラノシド、遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光酵素基質を用いた改良されたSA-β-Galアッセイは、文献12,13,14,15にすでに登場しています。DDAOGの化学プローブの構造と光学特性を補足図S1に示します。これらの細胞透過性プローブは(固定ではなく)生細胞の分析を可能にし、発色プローブではなく蛍光プローブは、ハイコンテントスクリーニング装置やフローサイトメーターなどの高速ハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用を容易にします。ソーティングフローサイトメーターを使用すると、細胞培養物や腫瘍から濃縮された老化細胞の集団を回収して、ダウンストリーム分析(ウェスタンブロッティング、ELISA、オミクスなど)を行うことができます。蛍光分析は定量的シグナルも提供し、特定のサンプル内の老化細胞の割合をより正確に決定できるようにします。生存率プローブや蛍光色素標識抗体などの蛍光プローブも容易に追加でき、SA-β-Gal以外のターゲットのマルチプレックス解析が可能です。
DDAOGと同様に、C12-FDGはSA-β-Galの蛍光プローブですが、その緑色の蛍光発光は、細胞16にリポフスチン凝集体が蓄積するために老化中に生じる固有の細胞AFと重なります。遠赤色DDAOGプローブを利用することにより、緑色セルラーAFを老化17を確認するための二次パラメータとして使用できます。これにより、老化18の単一マーカーとして信頼性が低いことが多いSA-β-Galに加えて、2番目のマーカーを使用することでアッセイの信頼性が向上します。老化細胞における内因性AFの検出はラベルフリーのアプローチであるため、DDADOGベースのアッセイの特異性を拡大するための迅速かつ簡単な方法です。
このプロトコルでは、 in vitro 培養から、またはマウスで確立された薬物治療腫瘍から単離された生存可能なTIS腫瘍細胞を同定するための迅速なデュアルパラメータフローサイトメトリーアッセイとしてDDAOGおよびAFを使用する方法を示します(図1)。このプロトコルは、市販の幅広い標準的なフローサイトメトリー分析装置およびソーターと互換性のある蛍光色素を使用しています(表1)。標準的なフローサイトメトリー分析を用いた生細胞の割合の定量が可能です。所望により、任意の免疫標識ステップを実施して、老化と同時に目的の細胞表面抗原を評価してもよい。同定された老化細胞は、標準的な蛍光活性化セルソーティング(FACS)方法論を使用して濃縮することもできます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> 図1:実験ワークフロー。 DDAOGアッセイの要点をまとめた概略図。(A)哺乳類培養細胞にTIS誘導薬を添加するか、担がんマウスに投与する。その後、TISの発症に時間が与えられます:細胞の場合、治療後4日。マウスの場合、合計22日間、5日ごとに3回の治療と7日間の回復。細胞を採取するか、腫瘍を解離して懸濁液にします。(B)サンプルをBafで処理して、SA-β-Galを検出するためにリソソームpHを30分間調整します。次に、DDAOGプローブを60分間追加して、SA-β-Galを検出します。サンプルをPBSで2回洗浄し、生存率染色剤を短時間加えます(15分)。オプションで、サンプルをオープン蛍光チャネルで蛍光抗体で染色したり、後で分析するために固定したりすることができます。(C)サンプルは、標準のフローサイトメーターを使用して分析されます。生細胞は、赤色のDDAOG(SA-β-Galを示す)と緑色の自家蛍光(リポフスチン)を示すドットプロットで視覚化されます。TIS細胞の割合を決定するためのゲートは、未処理の対照試料(図示せず)に基づいて確立される。ソーティングサイトメーター(FACS)を使用する場合、TIS細胞を回収して培養液に戻してin vitro アッセイを行ったり、分子生物学的アッセイのために溶解して処理したりすることができます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;TIS =治療誘発性老化;FL-Ab = 蛍光色素標識抗体;Baf = バフィロマイシンA1;SA-β-Gal=老化関連β-ガラクトシダーゼ;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;FACS = 蛍光活性化細胞選別。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>フルオロフォア</td>
			<td>検出</td>
			<td>例/エム (ナノメートル)</td>
			<td>サイトメーターレーザー(nm)</td>
			<td>サイトメーター検出器/バンドパスフィルター(nm)</td>
		</tr><tr><td>ダオグ</td>
			<td>サβガル</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>リポフスチン</td>
			<td>&lt; 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>生存 率</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>ペ</td>
			<td>抗体/表面マーカー</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>表1:蛍光色素およびサイトメーターの光学仕様。 このプロトコルで使用されるサイトメーターの仕様は、合計4つのレーザーと15の発光検出器を備えた機器についてリストされています。645/660 nmで検出されたDDAOGは、SA-β-Gal1によって切断されたプローブの形態です。切断されたDDAOGは、460/610 nmで低レベルの蛍光を示す可能性がありますが、プロトコルの洗浄ステップによって除去されます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;AF =自家蛍光;PE =フィコエリスリン;SA-β-Gal =老化関連β-ガラクトシダーゼ。

<table><tbody><tr><td>バフィロマイシンA1</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>ブレオマイシン硫酸塩&nbsp;</td><td>ケイマン</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM 生存率色素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4 抗体、PE コンジュゲート</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>137803</td><td>クローン H194-112</td></tr><tr><td>細胞株: A549 ヒト肺腺癌</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>細胞株:B16-F10マウスメラノーマ</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>コーニング</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、100&マイクロ;m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-Galactoside</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン、塩酸塩注射 (USP)</td><td>ファイザー</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン、PEG化リポソーム(USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide&nbsp;</td><td>ケイマン</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>オメガ&nbsp;</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc受容体ブロッキング試薬</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>抗マウス CD16/32</td></tr><tr><td>フローサイトメーター (細胞分析装置)</td><td>ベクトン・ディキンソン (BD)</td><td>各種</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>フローサイトメーター (細胞ソーター)</td><td>ベクトン・ディキンソン (BD)</td><td>各種</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ロンザ</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼTL</td><td>シグマ</td><td>5401020001</td><td>ロシュ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%</td><td>電子顕微鏡</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x</td><td>コーニング</td><td>MT21031CV</td><td>ダルベッコのPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)</td></tr><tr><td>レインボーキャリブレーション粒子、ウルトラキット</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3.5-3.9 & マイクロ;m, 2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム 0.9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>サイトメーターデータ取得用ソフトウェア, "FACSDiva"</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>該当なし</td><td>BDライセンス用</td></tr><tr><td>サイトメーターデータ解析用ソフトウェア, "FlowJo"</td><td>TreeStar</td><td>該当なし</td><td>ライセンスTreeStarに連絡する</td></tr>トリ<tr><td>プシン-EDTA 0.25%</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ25200-114</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

細胞老化は、生物学的損傷によって誘発される増殖性停止の状態であり、通常は老化した細胞で何年にもわたって発生しますが、さまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞に急速に現れることもあります。老化細胞は死に抵抗性になり、腫瘍の悪性度と治療抵抗性を悪化させながら腫瘍の寛解をブロックするため、腫瘍細胞の老化は一般的に望ましくないと考えられています。したがって、老化した腫瘍細胞の同定は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。様々な老化アッセイが存在し、その多くは、よく知られている老化マーカーである老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−Gal)の活性に基づいている。 
典型的には、SA-β-Galアッセイは、固定細胞上の発色基質(X-Gal)を用いて行われ、光学顕微鏡による「青色」老化細胞のゆっくりとした主観的な列挙が行われる。C12-FDG(緑色)およびDDAO-ガラクトシド(DDAOG;遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光SA-β-Gal基質を使用した改良されたアッセイにより、生細胞の分析が可能になり、フローサイトメーターを含むハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用が可能になりました。C12-FDGはSA-β-Galのプローブとして十分に文書化されていますが、その緑色蛍光発光は、リポフスチン凝集体の蓄積により老化中に生じる固有の細胞自家蛍光(AF)と重複しています。遠赤色のSA-β-GalプローブDDAOGを利用することにより、緑色の細胞自家蛍光を老化を確認するための二次パラメータとして使用でき、アッセイの信頼性が向上します。残りの蛍光チャネルは、細胞生存率染色またはオプションの蛍光免疫標識に使用できます。
フローサイトメトリーを使用して、老化した腫瘍細胞を同定するためのデュアルパラメーターアッセイとしてDDAOGとリポフスチン自家蛍光の使用を実証します。生細胞の割合の定量が行われる。所望により、目的の細胞表面抗原を評価するための任意の免疫標識ステップが含まれていてもよい。同定された老化細胞は、フローサイトメトリーで選別し、ダウンストリーム分析のために収集することもできます。集められた老化細胞は、直ちに溶解(例えば、イムノアッセイまたは'オミクス分析のために)またはさらに培養することができる。

SA-β-Galによる老化の検出について、DDAOGとX-GalおよびC12-FDGの比較可能性を実証するために、いくつかの実験が行われました。まず、X-Galを用いて、ETOにより誘導された老化性B16-F10メラノーマ細胞を染色した(図2A)。ETO処理細胞のサブセットでは濃い青色が発達しましたが、他の細胞はそれほど強くない青色染色を示しました。形態は、ほとんどのETO処理細胞で拡大した。ETO処理した細胞を蛍光SA-β-Gal基質C12-FDG(緑)またはDDAOG(遠赤色)で染色すると、X-Galと同等の染色パターンと強度の変動が示されました(図2B)。しかし、緑色のC12-FDG発光は細胞AFと重なり合い(図2C)、老化細胞17に蓄積することが知られている。対照的に、AFはDDAOGの遠赤色発光範囲では無視できる程度であった。
<...

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

当社のマルチパラメーターフローサイトメトリープロトコルは、がん生物学および治療において進行中の研究条件である腫瘍細胞における治療誘発老化の迅速かつ改善された検出を可能にします。当社のフローサイトメトリー老化アッセイは、既存の顕微鏡ベースのアッセイよりも迅速です。老化細胞を同定するために、1つではなく2つのマーカーを使用し、アッセイの信頼性を向上させます。細胞を蛍光抗体と共染色して、目的の追加のターゲットを検出することができます。フローサイトメトリーソーティングは、下流分析のために老化細胞の集団を濃縮するために使用できます。このアッセイは、培養がん細胞株、または穏やかな解離後の腫瘍サンプル全体の老化細胞を検出できます。この手法を試す前に、使用するフローサイトメーターの一般的な操作手順に精通していることが重要です。推奨フローサイトメーターの仕様については、本文を参照してください。薬物による老化誘導の前日に、0.25%トリプシンEDTAで癌細胞株培養物を回収する。細胞を摂氏37度で5分間置き、トリプシンを活性化し、細胞単層を剥離します。単層が目に見えて剥離したら、等量の完全培養培地を加えてトリプシンを中和します。細胞懸濁液を滅菌円錐管に移す。標準的な血球計算法を用いて細胞をカウントし、ミリリットル当たりの細胞を記録します。平板細胞は、標準的な6ウェルプラスチック培養プレートで1平方センチメートルあたり10〜3〜10倍で10〜3番目の細胞である。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします二酸化炭素と湿度。翌日、エトポシドなどの目的の老化誘導剤で細胞を処理します。その後、老化の開始を可能にするために4日間インキュベートします。光学顕微鏡で細胞を毎日調べて、予想される形態変化を調べます。老化の開始後、摂氏37度で5分間トリプシンEDTAを加えて細胞を収穫します。細胞が懸濁液に解離したら、等量の完全培地でトリプシンを中和します。細胞懸濁液の各ウェルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞を再度カウントし、サンプルごとに同数の細胞を新しいチューブセットに分注します。チューブを摂氏4度で1, 000 gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。まず、1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度で細胞ペレットにDMEM中の1マイクロモルのバフィロマイシンAの溶液を添加して培養細胞サンプルのリソソームpHを調整し、ピペットで混合する。ローテーター上で摂氏37度で30分間低速でインキュベートします。次に、老化関連β-ガラクトシダーゼを染色するために、洗浄せずにDDAOGストック溶液を1ミリリットルあたり10マイクログラムでサンプルに加えます。直射日光から保護されたローテーターに60分間置きます。前と同様に、チューブを遠心分離し、上清を除去し、PBS中の1ミリリットルの氷冷0.5%BSAでペレットを洗浄します。次に、300マイクロリットルの希釈カルセインバイオレット450 AM溶液を洗浄したセルペレットに加えます。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。細胞サンプルをフローサイトメトリー機器対応チューブに移します。データ集録ソフトウェアで、紫チャンネルヒストグラムと遠赤チャンネル対緑チャンネルのドットプロットを開きます。低い吸気速度でサイトメーターのデータ取得を開始し、DDAOGで染色されたポジティブコントロールサンプルを吸気ポートに置きます。サンプルデータの取得を開始します。各プロット内に90%以上のイベントが含まれるようにチャンネル電圧を調整します。すべての設定が最適になったら、サンプルごとに10, 000イベントを記録します。DDAOGで染色された車両専用コントロールサンプルを吸気ポートに置きます。データ収集を開始し、サンプルあたり 10 、 000 イベントを記録します。自家蛍光(AF)およびDDAO-ガラクトシドシグナルの増加をポジティブコントロールと比較して探してください。サンプルデータをfcsファイル形式で保存し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを備えたワークステーションコンピュータにエクスポートします。サイトメトリーデータ解析ソフトウェアを使用して、取得したすべてのサンプルのfcsデータファイルをロードします。まず、生細胞をゲートするには、車両専用コントロールのサンプルデータをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。データをバイオレット チャネル ヒストグラムとして視覚化します。CV 450によって染色された生細胞は、死細胞よりも明るい蛍光に基づいています。シングルゲートヒストグラムツールを使用してゲートを描画し、生細胞のみを含めます。ゲートに実行可能という名前を付けます。次に、Viable ゲートをサンプルレイアウトウィンドウから他のセルサンプルにドラッグして、ゲートを均一に適用します。[レイアウト] ウィンドウを開きます。レイアウトウィンドウで、すべてのサンプルをバイオレットチャンネルヒストグラムとして視覚化します。生細胞ゲーティングがサンプル間で適切であることを確認します。そうでない場合は、必要に応じて調整します。次に、老化細胞をゲートするには、車両専用コントロールのゲートされた生残細胞データをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。次に、遠赤チャネルと緑チャネルのドットプロットとしてデータを視覚化します。[矩形ゲーティング] ツールを使用してゲートを描画し、右上の象限から DDAO 陽性セルと AF 陽性セルを 5% 未満含めます。ゲートに「老化」という名前を付けます。次に、老化ゲートをサンプルレイアウトウィンドウからすべてのサンプルの実行可能なサブセットにドラッグして、ゲートを均一に適用します。レイアウトウィンドウに、すべての実行可能なセルゲートサブセットをドラッグアンドドロップします。すべての生存サンプルを遠赤対緑のチャネルドットプロットとして視覚化し、結果を観察します。老化ゲートがすべてのプロットに表示され、車両のみのコントロールのゲートが5%未満の老化セルを示すことを確認します。これで分析は完了です。データは、必要に応じてグラフ形式および表形式でエクスポートできるようになりました。エトポシドによって誘導された老化B16-F10メラノーマ細胞は、未処理細胞と比較して、老化関連β-ガラクトシダーゼの上昇によるX-galの切断により、形態の拡大と青色染色を示しました。エトポシド処理細胞を蛍光C12FDG(DDAOG)で染色したところ、X-galと同等の染色パターンと強度変動が示されました。しかし、緑色のC12FDG発光と重なる細胞自家蛍光は、染色されていない老化細胞に蓄積することが示された。対照的に、自家蛍光は、DDAOGの遠赤色発光範囲では典型的には無視できる程度であった。散布図用のフローサイトメーターデータ収集セットアップ、市販のレインボー蛍光キャリブレーションミクロスフェアの5ピーク、および染色細胞からのシングルチャンネル蛍光データを以下に示します。B16-F10メラノーマ細胞のDDADOGフローサイトメーター老化アッセイデータは、エトポシドによって誘導される治療誘発老化(TIS)が生細胞の35%で発生し、老化細胞除去剤ABT-263がTIS細胞をほぼ排除することを示しました。A549肺癌細胞では、生細胞の66%およびABT-263におけるブレオマイシン誘発TISの割合が15に減少した。ABT-263単独では、未処理の増殖細胞に対して毒性がなかった。抗体共染色アッセイでは、PEチャネルデータのヒストグラムは、エトポシド処理細胞の42%が老化マーカーDPPP4陽性に対して陽性であることを示しました。さらに、2次元ドットプロットによる可視化では、エトポシド処理細胞の44%がDDAOGとDPP4でダブルポジティブであったのに対し、ビヒクルのみの細胞では4%であることが示されました。次にDDAOG染色細胞の固定を評価した。固定されていない対照サンプルと比較して、固定サンプルは未処理細胞でわずかに高いバックグラウンドを示し、BLM処理細胞では老化としてスコアを付ける細胞の割合が高かった。この効果は、一晩、および摂氏4度で1週間保存された固定サンプルでも観察されました。フローサイトメトリーの分類および形態および増殖マーカーによる濃縮老化細胞集団の検証が示されている。選別された老化細胞は、予想通り拡大形態を示し、アクチンを蛍光ファロイジンで染色することによって視覚化した。増殖マーカーKi67のシグナルの減少も免疫蛍光染色によって観察された。最後に、化学療法薬で治療された腫瘍の老化の定量化が評価されました。組織におけるX-gal染色は比較的弱かったが、ドキソルビシンまたはペグ化リポソームドキソルビシンで治療された腫瘍、特にDDAO-ガラクトシドフローアッセイによって老化のスコアが陽性であった腫瘍では、青色染色が明らかであった。予想通り、生理食塩水のみの腫瘍はごくわずかな老化を示した。ここでは、他の生細胞アッセイと同様に、プロトコルステップは効率的かつ穏やかに実行する必要があります。長時間の染色手順、または言及された時間を超えるインキュベーションは避けてください。老化細胞をフローサイトメトリーでソーティングすると、イムノアッセイのために培養液に戻すか、溶解し、トランスクリプトミクスやプロテオミクスなどのオミクス解析のために処理することができます。この技術により、私たちの研究室や他の人々は、DNA損傷、タンパク質発現、代謝の変化の定量化など、老化腫瘍細胞の新しい特徴を特定することができました。

far-red-fluorescent-senescence-associated-galactosidase-probe-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、治療によって誘発される老化がん細胞を二重老化マーカーで定量するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを示しています。老化細胞の検出と定量には、β-ガラクトシダーゼ基質の使用が含まれます。基質は老化細胞内の活性リソソームβ-ガラクトシダーゼによって切断され、自己蛍光リポフスチン顆粒と結合して老化癌細胞をマークする蛍光産物を産生します。...

フローサイトメトリーによる治療誘発性老化がん細胞の定量化

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。...

老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

細胞内 ROS は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすに示されています。ここでは、細胞の老化にともなう ROS レベルを定量化するための敏感な試金について述べる。伝えられる様々...

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

細胞老化は、慢性加齢病理の発症における重要な因子である。老化細胞を標的とする治療薬の同定は、健康な老化を延長する約束を示す。ここでは、単一細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の測定に基づくセノセラピューティクスの同定をスクリーニングするための新規アッセイを提示する。...

セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。...

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

本プロトコルは、ヒト脂肪組織から分離された間質血管画分における老化関連ベータガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性を客観的に単細胞検出するために、反射光共焦点顕微鏡法を提示します。この方法は免疫細胞化学と互換性があり、定量評価のためのpHコントロールを組み込み、さらに従来のSA-β-gal染色よりも感度が高く主観的でない代替手段を提供します。...

脂肪間隙血管分数における反射光を用いた老化検出

本記事では、IMR-90ヒト線維芽細胞における老化期のリソソーム再構築を測定するための生細胞LysoTrackerプロトコルを紹介します。...

ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS...

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

学ぼう、フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の迅速検出法。遠赤色蛍光プローブと二重マーカー染色により、化学療法誘導性老化細胞の高精度同定と濃縮を実現する手法です。

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

さらに動画を探す