Name: ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ ウェスタンブロッティングを用いた神経細胞K-Cl共輸送体KCC2のリン酸化解析法。HEK293細胞を用いてKCC2の活性調節メカニズムを評価し、神経シグナル伝達における生理機能を解明するための信頼性の高い手法です。

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この研究は、英国王立協会(助成金番号IEC\NSFC\201094)、および連邦博士号奨学金によってサポートされました。

注:このプロトコルでは、目的の特定のタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング法について説明しています。
1. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>細胞培養手順の前に、すべての試薬をビーズバス(37°C)で温めます。10%ウシ胎児血清、各1%2mM L-グルタミン1%、非必須アミノ酸100x、ピルビン酸ナトリウム100 mM、およびペニシリン-ストレプトマイシン100単位を添加した培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を準備します。</li>
	<li>ヒト胚性腎臓293細胞(HEK293rnKCC2b)18 をビーズバス(37°C)中で安定にトランスフェクトしたラットKCC2bを完全に解凍する。細胞をクライオバイアルチューブから5 mLの新鮮な培地を含む遠沈管に移します。セルを1200 ×gで3〜5分間回転させます。</li>
	<li>アスピレーターピペット(真空ポンプに固定)を使用して上清を吸引し、10 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を10cmのディッシュプレートに移す。</li>
	<li>皿をインキュベーターに入れ、加湿した5%CO2 雰囲気中で37°Cで48時間増殖させます。健康な細胞増殖を確実にするために潜伏期間を監視します。インキュベーション期間後に90%以上のコンフルエントに達した細胞をさらに分割します。</li>
	<li>細胞皿から古い培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗い流します。2 mLのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベートします。</li>
	<li>2 mLの完全培地を使用して、ディッシュ内のトリプシン処理細胞を穏やかに洗浄します。9 mLの新鮮な培地を新しい皿に加え、古い皿から1 mLの溶液を新しい皿のそれぞれに加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間戻し、90%のコンフルエンシーを達成≥。</li>
	<li>細胞を溶解バッファーで回収する前に、コントロールとしてジメチルスルホキシド(DMSO)、8 μMスタウロスポリン、または0.5 mM N-エチルマレイミド(NEM)のいずれかで15分間処理します。</li>
</ol>2. 細胞ライセートの調製とサンプルのローディング
<ol><li>培養皿上の培地を吸引します(トランスフェクション手順から)。細胞培養物を氷上に置き、氷冷したPBSで細胞を洗浄します。</li>
	<li>PBSを吸引し、50 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)、1 mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50 mMフッ化ナトリウム、5 mMピロリン酸ナトリウム、10 mMナトリウム-β-グリセロリン酸、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%(w / v)トリトンX-100、0.27 Mスクロースを含む1 mLの氷冷溶解バッファーを加えます。 1 mMベンザミン、0.1%(v / v)2-メルカプトエタノール、および2 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)をディッシュに。 注:細胞回収時の溶解バッファーの容量はディッシュのサイズによって異なりますが、例えば、1 x 107 セル/100 mmディッシュ/150 cm2 フラスコあたり1 mLの溶解バッファーが適しており、5 x 106 セル/60 mmディッシュ/75 cm2 フラスコあたり0.5 mLが適しています。</li>
	<li>冷たいプラスチック製のセルスクレーパーを使用して皿の底から細胞をこすり落とし、次にピペットを静かに使用して、細胞懸濁液をすでに氷上にあるマイクロ遠心チューブに移します。チューブを4°Cで30分間絶えず攪拌します。</li>
	<li>細胞溶解物を16,000 x g の冷たい遠心分離機(4°C)で20分間回転させ、チューブを遠心分離機からそっと取り出して氷上に置きます。上清を予冷した新鮮なチューブに集め、ペレットを廃棄します。 注:細胞の種類によっては、遠心分離力と時間を変える必要がある場合があります。ただし、一般的なガイドラインでは、16,000 x g で20分間遠心分離することを推奨しています。ただし、これは実験ごとに決定する必要があります。たとえば、白血球のような繊細な細胞には、非常に軽い遠心分離速度が必要です。</li>
</ol>3. 細胞溶解液からの免疫沈降剤の調製
<ol><li>300 μLのタンパク質-G-セファロースをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。</li>
	<li>500 μLのPBSを加え、溶液をよくボルテックスします。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。この手順を繰り返します。</li>
	<li>1 mgの抗KCC2 Thr906および抗KCC2 Thr1007抗体を200 μLのタンパク質G-セファロースビーズと混合し、PBSで500 μLの容量に構成します。振動プラットフォームまたは回転ホイールで4°Cで2時間振とうします。 PBSで2回洗浄します。</li>
	<li>細胞ライセート全体に対してタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1 mgの細胞ライセートを加えます。エンドツーエンドのローテーターで4°Cで2時間穏やかにインキュベートします。 ビーズをスピンダウンし、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)を含むPBSで3回洗浄します。</li>
	<li>免疫沈降剤(ビーズ)を200 μLのPBSで3回洗浄します。最終ペレットを100 μLの1xドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファーに再懸濁します。</li>
	<li>チューブをローターシェーカーで室温で5分間振とうし、75°Cの加熱ブロックで10分間インキュベートします。ローディングサンプルを11,000 x g で2分間遠心分離し、上清をゲルローディングに使用します。</li>
</ol>4. ウェスタンブロットの実行
<ol><li>キャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲル(レシピ/準備については 表1 を参照)を注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2cmのスペースを確保してゲルをキャストします。200 μLの無水イソプロパノールをセットアップに加え、室温で60分間放置します。 注:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のポリアクリルアミドゲルレシピは、目的のタンパク質のサイズによって異なります(表2)。したがって、目的のゲルパーセンテージを決定する前に、タンパク質のサイズをメモしてください。</li>
	<li>ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200μLの蒸留水でゲルを注意深くすすぎます。新しく準備した6%スタッキングジェル(レシピ/準備については 表1 を参照)を追加して、キャスティングセットアップの約2cmのスペースを埋めます。ウェルコームにそっとはめ込み、室温で30分間放置します。</li>
	<li>キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。</li>
	<li>トリス塩基30.3 g、グリシン144.1 g、SDS10 gを蒸留水1000 mLに溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。10 mLの10%SDSと100 mLの10xトランスファーバッファーを890 mLの蒸留水に加えて、1xランニングバッファーを調製します。</li>
	<li>1xランニングバッファーをタンクに注ぎます。5 μLの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします(使用するコームサイズに応じて18〜30 μL)。空のウェルを1x LDSで満たし、120 Vで約90〜120分間ゲルを実行します。</li>
	<li>58.2 gのトリス塩基と29.3 gのグリシンを1000 mLの蒸留水に溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。20%メタノールを含む1xトランスファーバッファーでニトロセルロースメンブレンを活性化します。ゲルとメンブレンをトランスファーバッファーですすぎ、準備スタックに静かに広げます。 注:ランニングバッファーとトランスファーバッファーのpHは、必要な最適なpHにする必要があるため、調整する必要はありません。また、時間を節約するために、実験の前にこれらのバッファーを準備して室温で保存することをお勧めします。</li>
	<li>転写するサンドイッチを、負極(黒枠/端)-サンドイッチフォーム-ろ紙-すすぎSDS-PAGEゲル-すすぎニトロセルロースメンブレン-ろ紙-サンドイッチフォーム-正極(赤枠)の順に並べます。組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90Vで90分間、または30Vで360分間運転します。</li>
</ol>5. 抗体染色と画像現像
<ol><li>膜を取り外して乾かします。0.1%の1x Tween 20(1x TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%スキムミルクから作られたブロッキングバッファーを使用して、室温で1時間メンブレンをブロックします。</li>
	<li>一次抗体8,15,19およびβ-アクチン(ローディングコントロール)の適切な希釈液を用いてメンブレンをブロッキングバッファー中で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBS-Tの3回の洗浄でメンブレンをそれぞれ5分間洗浄します。 注:β-アクチン、α-チューブリン、またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ抗体などのローディングコントロールを使用した個別のメンブレンのインキュベーションは、その後の定量中に他のウェスタンブロッティング結果を正規化することです。各一次抗体の推奨希釈率は、メーカーのマニュアルに記載されています。</li>
	<li>洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで5000倍に希釈した二次抗体とともに室温で60分間インキュベートします。再度、メンブレンを1x TBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄します。 注:二次抗体は、一次抗体が産生される種に対して産生させることを強くお勧めします。例えば、総KCC2の一次抗体がマウス抗KCC2である場合、抗マウスの二次抗体を使用する必要があります。</li>
	<li>洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。各増強化学発光(ECL)試薬を等量混合し、混合溶液をメンブレン上に穏やかに広げてシグナルを発生させます。</li>
</ol>6. イメージングシステムによる画像取得とデータ定量化
<ol><li>イメージングボードをイメージングシステムの適切なコンパートメントに移してイメージングします。画像処理のためにコンピュータ上のイメージングソフトウェアを開きます。</li>
	<li>ツール バーで、[新しいプロトコル] をクリックし、[シングル チャネル] を選択します。ゲルイメージング/アプリケーションダイアログボックスで選択をクリックし、ブロットまでスクロールして、ケミハイ感度またはケミハイ解像度のいずれかを選択します。次に、[信号蓄積設定]をクリックして、取得する画像の持続時間と数を設定します。</li>
	<li>プロトコル設定の下にある Position Gel をクリックし、必要に応じてイメージングシステムでゲルを調整します。[ プロトコルの実行 ] をクリックしてイメージを取得します。</li>
	<li>イメージングカタログボックスの下にある集録画像の1つを右クリックして、画像をコンピュータに保存します。目的の画像に移動し、[実行]ダイアログボックスの[ 画像の選択と続行 ]をクリックします。</li>
	<li>画像変換アイコンをクリックして、画像のコントラストとピクセル彩度を調整します。一般ツールバーのスクリーンショットアイコンをクリックして、目的の画像形式に応じて画像をコンピューターに保存します。</li>
	<li>ImageJソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、適切な統計ツールを使用して分析します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

KCC2を含むニューロンで発現されるCCCのSLC12の活性を測定するために多くの方法が用いられてきた。これらの技術の多くは、これらのトランスポーターの機能的関連性と、さまざまな疾患関連変異におけるそれらの構造機能パターンの分析に関する科学的知識を強化することが証明されています。重要なことに、さまざまな方法21には利点と注意点があります。しかし、上記のプロトコルでは、KCC2の機能と活性の研究に役立つウェスタンブロットを使用して、キナーゼ調節部位であるThr906およびThr1007でのKCC2リン酸化を評価する方法を概説しています。
KCC2の調節は、重要なセリン/スレオニン残基1でのリン酸化および脱リン酸化によって起こります。ウェスタンブロッティングは、Thr906およびThr1007のキナーゼ調節部位におけるKCC2リン酸化を調べるために使用できる効率的な技術です。原則として、KCC2のリン酸化の変化は、目的のイムノブロットサンプル/タンパク質のリン酸化ペプチドに対するリン酸化特異...

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl-恒常性の適切な機能、およびその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です1,2,3,4。KCC2による4-6 mMの低神経内Cl-濃度([Cl-]i)の維持は、脳および脊髄におけるγ-アミノ酪酸(GABA)/グリシンの過分極およびシナプス阻害を促進する5。KCC2の適切な調節の失敗は、てんかん4を含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。さらに、KCC2を介したCl-押し出しの減少、および過分極GABAAおよび/またはグリシン受容体媒介電流の障害は、てんかん、神経因性疼痛、および痙縮に関係しています6,7。ニューロンKCC2は、リジンなし(WNK)-STE20/SPS1関連プロリン/アラニンリッチ(SPAK)/酸化ストレス応答性(OSR)キナーゼシグナル伝達複合体1によるC末端細胞内ドメイン内の主要な調節残基のリン酸化を介して負に調節され、未熟ニューロンにおける脱分極GABA活性の維持を促進します2,8,9.WNK-SPAK/OSR1は、スレオニン残基906および1007(Thr906/Thr1007)をリン酸化し、続いてKCC2のmRNA遺伝子発現を下方制御し、その結果、その生理学的機能を低下させます8,10。しかし、さらに重要なことに、WNK-SPAK/OSR1キナーゼ複合体がKCC2発現をリン酸化および阻害することが知られており1,2,4,11,12、およびThr906/Thr1007をリン酸化するキナーゼ複合体シグナル伝達経路の阻害がKCC2 mRNA遺伝子の発現増加と関連していることはすでに事実です13,14,15。.タンパク質リン酸化を介したニューロンKCC2およびNa+-K+-2Cl-共輸送体1(NKCC1)発現の調節は、同時に、逆のパターンで機能することに注意することが重要です1,4,16。
KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関しては、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定された、一貫したかなりの進歩がありました。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここで紹介するプロトコルは、キナーゼ調節部位Thr906/1007での共輸送体のリン酸化を調べることにより、ニューロンK+-Cl- 共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の応用を強調しています。
ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC1 のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC3 Thr991/Thr1048リン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤を同定するために使用されています17。このプロトコルに従うことにより、細胞/組織溶解物から総リン酸化KCC2を特異的に検出することができます。原理的には、本手法によるタンパク質結合抗体の検出は、KCC2のリン酸化部位における協同活性の理解に役立ち、その生理制御に関わる分子機構の解明に大いに役立ちます。全タンパク質発現の定量分析は、KCC2の機能と活性を代表するものです。KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法、例えばルビジウムイオンおよびタリウムイオン取り込みアッセイがある。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。

<table><tbody><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2917</td><td>SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614</td><td>SDS-PAGE用の分離およびスタッキングゲルの製造に使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>抗pSPAK</td><td>ダンディー大学</td><td>S670B</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗KCC2</td>の一次抗体として使用 <td>ダンディー大学</td><td>S700C</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr>抗KCC2の一次抗体として使用 <tr><td>pSer940</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-95678</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr>抗KCC2の一次抗体として使用 <tr><td>pThr1007</td><td>ダンディー大学</td><td>S961C</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗KCC2 pThr906</td><td>ダンディー大学</td><td>S959C</td><td>ウェスタンブロッティング抗マウスの一次抗体として使用</td></tr><tr><td></td><td>Cell Signalling technology</td><td>66002</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗NKCC1</td>の二次抗体として使用 <td>ダンディー大学</td><td>S841B</td> ウェスタンブロッティング抗NKCC1<td>の一次抗体として使用</td></tr><tr><td>pThr203/207/212</td><td>ダンディー大学</td><td>S763B</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗ウサギ</td>細胞<td>シグナル技術</td>の一次抗体として使用 <td>C29F4</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>抗ヒツジ</td>の二次抗体として使用 <td>abcam</td><td>ab6900</td><td>ウェスタンブロッティング抗SPAKの二次抗体として使用</td></tr><tr><td></td><td>ダンディー大学</td><td>S669D</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>の一次抗体として使用抗β;-Tubulin III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8578</td><td>ウェスタンブロッティングの一次抗体として使用</td></tr><tr><td>ベンザミン</td><td>Merck UK</td><td>135828</td><td>溶解バッファーの成分として使用</td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ローディングバッファーおよび溶解バッファーの成分として使用</td></tr><tr><td>Bradford Coomasie</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td>ライセートタンパク質の定量に使用</td></tr><tr><td>鋳造装置</td><td>アト&nbsp;</td><td>WSE-1165W</td><td>SDSページ電気泳動の実行に使用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804</td><td>ライセート調製に使用</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機 VWR</td><td>MicroStar 17R</td><td>サンプルの紡糸に使用</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>細胞培養実験に使用</td></tr><tr><td>乾燥スキムミルク</td><td>マーベル</td><td>N/A</td><td>ブロッキングに使用バッファー</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム-高グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>に使用 ECL試薬</td><td>Perkin Elmer</td><td>ORTT755/2655</td><td>ウェスタンブロッティングのイメージ開発に使用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D/0700/53</td><td>溶解バッファーEGTAの成分として使用</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>e4378</td><td>溶解の成分として使用バッファ</td></tr><tr><td>電気泳動電源</td><td>BioRad</td><td>PowerPAC HC</td><td>SDSページ電気泳動を実行するための電源を供給するため</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーE/0650DF/17</td><td>滅菌機器と環境の準備に使用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 -&nbsp; 熱不活性化</td><td>メルクライフサイエンスUK</td><td>F9665</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>フュームフード</td><td>ウォーカー</td><td>A7277</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>ゲルブロッティング - Whatman</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>10426981</td><td>ウェスタンブロッティングでトランスファーサンドイッチを作るために使用</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15527</td><td>バッファーを作るために使用</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc., USA</td><td>Version 6.0</td><td>のグラフのプロットとデータの分析に使用 &nbsp; ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Acros Organics</td><td>10647282</td><td>SDS-PAGE用のセパレーションゲルとスタッキングゲルを作るために使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>グラント</td><td>QBT1</td><td>WBローディングサンプルの加熱に使用</td></tr><tr><td>HEK293細胞</td><td>メルク UK</td><td>12022001-1VL</td><td>培養実験用細胞株</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Wayne Rasband and Contributors;NIH、米国&nbsp;</td><td>ImageJ 1.53e</td><td>ウェスタンブロッティング画像からバンド強度の測定に使用</td></tr><tr><td>イメージングシステム</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td>ウェスタンブロッティング画像の取得に使用</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td>LEEC LEEC 精密 190D</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>ハネウェル</td><td>24137</td><td>電気泳動用キャスティングゲルに使用</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸リチウム(LDS)</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>ウェスタンブロッティングMEM用ローディングバッファーとして使用</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>M7145</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td> WBマイクロプレートリーダーの<td>ライセート調製に使用</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>iMark</td><td>ライセートタンパク質濃度の読み出しに使用</td></tr><tr><td>Microsoft Powerpoint</td><td>Microsoft, USA</td><td>PowerPoint2016</td><td>ウェスタンブロッティング画像の編集に使用</td></tr><tr><td>分子量マーカー</td><td>バイオラッド</td><td>1610373</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23030</td><td>細胞培養実験に使用</td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>45004091</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>・セブンコンパクトs210</td><td>緩衝液のpHのモニターに使用</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>溶解緩衝液の成分として使用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>細胞培養に</td></tr><tr><td>使用 PKC&delta; pThr505</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9374</td><td>ウェスタンブロッティングの一次抗体として使用</td></tr> セ<tr><td>ファロースプロテイン G</td><td>ジェネロン</td><td>PG50-00-0002</td><td>免疫沈降に使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>洗浄バッファーの成分として使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>TBS-Tバッファーの調製に使用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5750</td><td>SDS-PAGEのセパレーションおよびスタッキングゲルの製造に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>溶解緩衝液の成分として使用</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>ナトリウム-&β;-グリセロリン酸</td><td>メルクUK</td><td>G9422</td><td>溶解緩衝液の成分として使用</td></tr><tr><td>スタウロスポリン(Streptomyces sp.)</td><td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td><td>S4400-1MG</td><td>細胞培養実験に使用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Scientifc Laboratory Supplies</td><td>S0389</td><td>溶解バッファーの成分として使用</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024</td><td>SDS-PAGEの分離およびスタッキングゲルの製造に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>トランスファーチャンバー</td><td>BioRad</td><td>1658005EDU</td><td>ウェスタンブロッティングでメンブレン上のタンパク質を転写するために使用されます</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>溶解バッファーの成分として使用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>T4049</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3179</td><td>TBS-Tバッファーとして使用</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>チャールズ・オースティン</td><td>・ダイマックス5</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>ボルテック</td><td>ス・サイエンティフィック・インダストリー</td><td>ズK-550-GE</td><td>サンプル調製に使用</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Scientific Industries Ltd</td><td>Vortex-Genie&nbsp;K-550-GE</td><td>分離した試料の混合に使用</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>グラントインスツルメンツ株式会社(JBアカデミー)</td><td>JBA5</td><td>溶液のインキュベーションに使用</td></tr></tbody></table>

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンk-cl共輸送体kcc2の機能と活性の研究

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl- 恒常性の適切な機能とその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です。KCC2の適切な調節の失敗は有害であり、てんかんを含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関してはかなりの進歩があり、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定されています。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここでは、キナーゼ調節部位(Thr906およびThr1007)でのKCC2リン酸化をウェスタンブロッティング技術を使用して調べる方法を強調しています。ルビジウムイオンやタリウムイオン取り込みアッセイなど、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。これらの追加のテクニックのいくつかについては、この原稿で簡単に説明します。

ここでは、図1に示す代表的な結果を、ウェスタンブロッティング技術を用いて、KCC2b(HEK rnKCC2b)18を安定発現するHEK293細胞株におけるWNK-SPAK/OSR1を介したKCC2およびNKCC1のリン酸化に対するスタウロスポリンおよびNEMの影響を調査した。代表的な結果に関する包括的な詳細は、Zhang et al.15で議論されている。NEMと同様に、スタウロスポリンは、KCC2輸送活性を増強し、NKCC1活性を阻害することができる広範なキナーゼ阻害剤である15,20。HEK293細胞をスタウロスポリンおよびNEMで処理すると、SPAK標的部位(Tループキナーゼドメインに位置するThr233およびhsSPAKのSループリン酸化部位Ser373)でのリン酸化が低下しました。したがって、両方の化合物は、前述のSP...

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による キナーゼ調節部位Thr906/1007でのKCC2リン酸化の調査について説明しています。また、KCC2活性を確認するための追加の方法は、このテキストで簡単に強調されています。

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

このプロトコルは、キナーゼの分子サイズのリン酸化を直接評価することにより、KCC2の制御に関与するメカニズムを理解するのに役立ち、その生理学的機能と活性に光を当てます。タンパク質発現が非常に微量であっても、関連分子の複雑な混合物から目的のタンパク質などの分子を同定し、特性評価するために使用できます。この技術は、複雑なシステムのタンパク質分析と、異常な組織機能や疾患の根底にある潜在的なメカニズムを特定するために不可欠なツールです。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるサンデーソロモンジョサイアです。摂氏37度のビーズバスですべての試薬を事前に武装させ、安定に切断されたラットKCC2bヒト胚性腎臓293細胞をビーズバスで完全に解凍することから始めます。次に、細胞をクライオバイアルチューブから5ミリリットルの新鮮な培地を含む遠心分離管に移し、細胞を1, 200 Gで3〜5分間遠心分離します。真空ポンプに固定したアスピレーターピペットを用いて上清を吸引した後、細胞を10ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁する。懸濁液を10センチメートルの皿プレートに移し、摂氏37度の温度と5%の二酸化炭素を有するインキュベーター内で48時間増殖させる。細胞が90%コンフルエントに達したら、古い培地を吸引し、2ミリリットルのPBSですすぐことによって細胞を分割します。2ミリリットルのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベートします。2ミリリットルの完全培地を使用してトリプシン処理細胞を洗浄します。新しい皿に9ミリリットルの新鮮な培地を加えます。次に、古い皿から新しい皿に1ミリリットルの溶液を加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間移し、90%以上のコンフルエンシーを達成します。細胞をジメチルスルホキシド、8マイクロモルのスタウロスポリン、または0.5ミリモルのN-エチルマレイミドで15分間処理してから、溶解バッファーで回収します。トランスセクトした培養皿から培地を吸引し、培養皿を氷上に置き、氷冷PBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引し、1.0ミリリットルの氷冷溶解バッファーを皿に加えます。冷たいプラスチックセルスクレーパーを使用して皿の底から細胞をこすった後、細胞懸濁液を氷上に置いた微量遠心チューブに移し、続いて摂氏4度で30分間絶えず攪拌した。細胞溶解物を冷たい遠心分離機で遠心分離した後、氷の上に置きます。上清を予冷した新鮮なチューブに集め、ペレットを廃棄します。300マイクロリットルのプロテインGセファロースをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。次に、溶液を500 Gで2分間遠心分離します。上清を捨てた後、500マイクロリットルのPBSとボルテックスをよく加えます。遠心分離後の上清を捨て、工程を繰り返す。次に、1ミリグラムの抗KCC2スレオニン906および抗KCC2スレオニン1007抗体を200マイクロリットルのプロテインGセファロースビーズと混合してから、PBSで容量を500マイクロリットルにします。振動するプラットフォームまたは回転ホイールで摂氏4度で2時間振った後、PBSで2回の洗浄を繰り返します。細胞ライセートでタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1ミリグラムの細胞ライセートを加え、スピンダウンする前にエンドツーエンドのローテーターでインキュベートします。150ミリモルの塩化ナトリウムを含むPBSで3回洗浄し、続いて200マイクロリットルのPBSで3回洗浄してから、最終ペレットを100マイクロリットルのLDSサンプルバッファーに再懸濁します。ローターシェーカーでチューブを室温で5分間振とうします。それらを加熱ブロックでインキュベートし、遠心分離してから、上清をゲルローディングに使用します。ウェスタンブロットキャスティング装置を組み立て、準備したばかりの8%分離ゲルを注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2センチメートルのスペースを確保してゲルをキャストします。200マイクロリットルの絶対イソプロパノールをセットアップに追加し、室温で60分間放置します。ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200マイクロリットルの蒸留水でゲルを注意深くすすいでください。新しく調製した6%スタッキングゲルをキャスティングセットアップに加えた後、ウェルコームにそっとはめ込み、室温で30分間放置します。次に、キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。ランニングバッファーをタンクに注いだ後、5マイクロリットルの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします。空のウェルをLDSで満たし、120ボルトで約90〜120分間ゲルを実行します。ニトロセルロースメンブレンを20%メタノールを含むトランスファーバッファーで再水和します。ゲルとメンブレンをトランスファーバッファーですすぎ、準備スタックに静かに広げます。負極、サンドイッチフォーム、ろ紙すすぎSDS-PAGEゲル、すすぎ硝化硝化膜、ろ紙、サンドイッチフォーム、正極の順に転写するサンドイッチを配置します。完了したら、組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90ボルトで90分間、または30ボルトで360分間運転します。ブロッキングバッファーを使用して室温で1時間乾燥膜をブロッキングします。一次抗体とβ-アクチンをブロッキングバッファーで適切な希釈液でメンブレンを室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、TBSTをそれぞれ5分間3回洗浄します。洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで希釈した二次抗体で60分間インキュベートし、TBSTの洗浄を3回繰り返します。完了したら、洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。シグナルを発生させるには、イメージングボードをイメージングシステムに移してイメージングする前に、各増強化学発光試薬を等量の混合した溶液をメンブレン上に広げてイメージングします。HEK293細胞をスタウロスポリンとN-エチルマレイミドまたはNEMで処理すると、SPAK標的部位、Tループキナーゼドメインに位置するスレオニン233、および内因性発現SPAKのSループリン酸化部位セリン373でリン酸化が低下しました。スタウロスポリンは、KCC2bを安定に発現するHEK294細胞においてセリン940のリン酸化を低下させたが、NEMはそのリン酸化を有意に増加させた。さらに、スタウロスポリンはスレオニン505部位でのリン酸化を減少させるが、NEMは同じ部位でのリン酸化のわずかな増加を引き起こした。スレオニン505部位のプロテインキナーゼCとセリン940部位のKCC2bのリン酸化に対する両化合物の異なる効果はよく相関しています。代表的な結果はまた、NEMが総KCC2量の発現の有意な増加を引き起こしたのに対し、両方の化合物で処理した場合、総NKCC1およびSPAKの発現は有意に変化しないことを示しました。さらに、2つの化合物はスレオニン233およびセリン373部位でSPAKのリン酸化の低下を引き起こし、これはスレオニン906/1007およびスレオニン203/207/212およびNKCC1の内在的に発現する短縮リン酸化と相関した。さらに、スタウロスポリンおよびNEMは、それぞれセリン940部位のプロテインキナーゼCのリン酸化を減少および増加させ、KCC2bを安定に発現し、スタウロスポリンおよびNEM処理時にそれぞれスレオニン505部位のプロテインキナーゼCデルタのリン酸化の減少および増加と相関した。不適切な一次抗体または二次抗体を使用した場合、イメージング中にバンドは見られません。また、低濃度の抗体を使用するとシグナルが見えない場合があります。この技術は、タンパク質の定量分析に関連するツールであり、効果的な早期診断ツールを含む、多くの科学的およびリソース目的での使用を可能にしています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

出典:Josiah, S. S., et al.ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究。 J. Vis.

ウェスタンブロッティングによるリン酸化ニューロン塩化カリウム共輸送体2の検出

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ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

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フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2...

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

学ぶ ウェスタンブロッティングを用いた神経細胞K-Cl共輸送体KCC2のリン酸化解析法。HEK293細胞を用いてKCC2の活性調節メカニズムを評価し、神経シグナル伝達における生理機能を解明するための信頼性の高い手法です。

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

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