Name: マウスの頭蓋窓手術のためのロボットドリル開頭術による熱損傷の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶロボットドリル開頭術によるマウスの頭蓋窓手術における熱損傷評価法。パルスポイントバイポイント法が水平法やポイントバイポイント法と比較して脳の加熱を有意に低減し、血管損傷を最小化する。

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この研究は、メリットレビュー賞GRANT12418820(カパドナ)およびGRANTI01RX003420(ショフストール/カパドナ)、および米国(US)退役軍人省リハビリテーション研究開発サービスの研究キャリア科学者賞#GRANT12635707(カパドナ)によって部分的にサポートされました。さらに、この研究は、国立衛生研究所、国立神経障害および脳卒中研究所GRANT12635723(カパドナ)、および国立生物医学画像および生物工学研究所、T32EB004314(Capadona/Kirsch)によっても部分的にサポートされました。この資料は、助成金番号GRANT12635723の下で国立科学財団大学院研究フェローシップによってサポートされている研究に基づいています。この資料に記載されている意見、調査結果、結論または推奨事項は、著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

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<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Augustinaite, S., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signal+imaging+and+targeted+injections+through+a+chronic+cranial+window+of+a+head-fixed+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+skull-removed+chronic+cranial+window+for+ultrasound+and+photoacoustic+imaging+of+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 673740(2021).</li>
<li>Wang, Y., Xi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+window+for+photoacoustic+imaging%3A+a+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Computing+for+Industry%2C+Biomedicine%2C+and+Art%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review.</a> Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15(2021).</li>
<li>Augustinaite, S., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+window+for+imaging+cortical+activity+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100194(2020).</li>
<li>Kunori, N., Takashima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+cranial+window+using+a+collagen+membrane+for+chronic+voltage-sensitive+dye+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging.</a> Micromachines. 10 (11), 789(2019).</li>
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<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818(2016).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Sundaram, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+brain+permeant+fluorescent+molecule+and+visualization+of+Abeta+parenchymal+plaques%2C+using+real-time+multiphoton+imaging+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice.</a> Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).</li>
<li>Spires, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+abnormalities+in+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice+demonstrated+by+gene+transfer+and+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).</li>
<li>Price, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+large-scale+mosaic+imaging+using+multiphoton+microscopy+to+characterize+transgenic+mouse+models+of+human+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders.</a> Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).</li>
<li>Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebral+amyloid+angiopathy+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+using+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).</li>
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<li>Korzhova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+aberrant+neuronal+activity+in+awake+Alzheimer%27s+disease+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice.</a> Communications Biology. 4 (1), 1368(2021).</li>
<li>Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cell+function+through+optical+imaging%3A+a+review+highlighting+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models.</a> Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).</li>
<li>Courtin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+mechanism+for+motivational+control+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A neuronal mechanism for motivational control of behavior.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
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<li>Goss-Varley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+implantation+in+motor+cortex+causes+fine+motor+deficit%3A+Implications+on+potential+considerations+to+Brain+Computer+Interfacing+and+Human+Augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15254(2017).</li>
<li>Oomoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cortical-wide+field-of-view+two-photon+imaging+with+quick+neonatal+adeno-associated+virus+injection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection.</a> STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).</li>
<li>Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+transgenesis+in+a+single+locus+with+independent+regulation+for+multiple+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores.</a> PLoS One. 7 (7), 40511(2012).</li>
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<li>Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+blood-brain+barrier+depends+on+brain+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature.</a> Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).</li>
<li>Eriksson, A. R., Albrektsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+threshold+levels+for+heat-induced+bone+tissue+injury%3A+a+vital-microscopic+study+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Prosthetic+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit.</a> The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).</li>
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<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e52642(2017).</li>
</ol>

著者には、報告する利益相反はありません。内容は、米国退役軍人省、国立衛生研究所、または米国政府の見解を表すものではありません。

EB色素とイメージングの使用は簡単で迅速であり、新しい方法や技術のために脳の血管損傷を評価するのに役立ちます。手術ロボットを使用する場合でも、現在ラボで行われている方法を確認する場合でも、実験的治療の効果と外科的影響を分離し、動物福祉を改善するために、外科的方法を検証することが重要です。熱電対のセットアップは、加熱が発生しないことを確認するための穴あけ方法を評価するのにも役立ちます。骨穿孔による温度の上昇は組織損傷を引き起こすことが知られており、5°Cの上昇でさえ脳に大きな血管損傷を引き起こすのに十分である32、33、34、35、36。実験室および外科的技術を改善するために、ここで詳述された方法を利用することをお勧めします。
熱電対の評価は評価に役立ちますが、...

頭蓋窓は、生きている動物の皮質の直接視覚化とイメージングを可能にするために、神経科学、神経工学、および生物学の分野で広く使用されるようになりました1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 .トランスジェニックマウスと多光子イメージングの強力な組み合わせは、in vivo脳における回路活性および他の生物学的洞察に関する非常に貴重な洞察を提供した12、13、14、15、16、17、18。頭蓋骨に取り付けられた小型顕微鏡は、これらの機能をさらに拡張して、目覚めた、自由に動く動物の記録を可能にしました19。頭蓋窓を作成するプロセスでは、皮蓋骨を薄くするか完全に除去して、皮質20の上に透明なガラス片を固定するのに十分な大きさの開頭術を生成するためのパワードリルが必要です。ポリジメチルシロキサン(PDMS)および他のポリマーも頭蓋窓材料として試験されている9、21。最終的に、理想的な頭蓋窓は、その下の正常な内因性活動を変化または妨害しないものです。しかし、頭蓋窓の穿孔は下にある組織を悪化させ、脳の損傷、環境の混乱、および多光子イメージングの深さを閉塞する点まで髄膜に影響を与えることが一般に認められています22。結果として生じる神経炎症は、血液脳関門(BBB)の透過性から、インプラント部位23周辺のグリア細胞の活性化および動員に至るまで、幅広い効果を有する。したがって、より安全で再現性の高い頭蓋窓掘削法の特性評価は、一貫した画像品質と交絡因子の低減に不可欠です。
下にある組織への外傷を最小限に抑えるように注意が払われていますが、骨を掘削する行為は、脳に熱的および機械的摂動の両方を引き起こす可能性があります24,25。硬膜への偶発的なドリルの侵入による機械的外傷は、様々な程度の皮質損傷をさらに誘発し得る24。Shoffstallらによる研究では25、骨掘削による熱は、脳実質25にエバンスブルー(EB)染料が存在することによって示されるように、BBB透過性の増加をもたらしました。静脈内注射されたEB色素は、血流中の循環アルブミンに結合するため、通常、かなりの濃度で健康なBBBを通過しません。その結果、EB色素はBBB透過性26、27の感度マーカーとして一般的に使用されている。彼らの研究は、研究中のその後の生物学的後遺症に対するBBB透過性の影響を直接測定していませんでしたが、以前の研究では、BBB透過性を慢性的に埋め込まれた微小電極に対する神経炎症反応の増加および運動機能の変化と相関させています28。
研究の目的によっては、熱的および機械的損傷の大きさが実験誤差の原因となり、研究の厳密さと再現性に悪影響を与える可能性があります。頭蓋窓を製造するための引用された方法は数十あり、それぞれが異なる掘削装置、速度、技術、およびユーザーを使用しています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。Shoffstall et al.25は、加熱結果の観察された変動は、手で掘削する場合には制御できない他の側面の中でも、ドリルの適用力、送り速度、および適用角度の変動に起因すると報告しました25。自動掘削システムやその他の定位固定装置が再現性と結果の一貫性を向上させることができるという信念がありますが、公表された方法研究では、結果の1つとして温度またはBBB透過性を厳密に評価していません。したがって、頭蓋窓を生成するためのより再現性が高く一貫して適用される方法、および頭蓋窓の穴あけが下にある神経組織に与える影響を評価するために厳密に適用される方法が必要です。
この研究の焦点は、頭蓋窓の一貫した安全な掘削方法を決定および開発することです。頭蓋窓設置のための開頭術のサイズは、脳移植微小電極のための標準的な開頭術よりも有意に大きい。このような開頭術は、標準装置を使用する場合、単一のバリ穴で完了することができず、それによって、手作業で行う場合により多くの外科医間の技術のばらつきを導入する20。外科用掘削ロボットが現場に導入されていますが、広く採用されていません1,6,29。穴あけの自動化は、観察された試験間の変動に寄与する変数の制御を提供し、装置の使用が外科医間および外科医内の影響を減らすことができることを示唆しています。これは、頭蓋窓の配置に必要なより大きな開頭術の追加の困難を考えると、特に興味深いものです。掘削を自動化することによって提供される制御には明らかな利点があると考えることができますが、これらの機器の実装についてはほとんど評価されていません。目に見える病変は認められていないが5、EBを用いたより高感度な試験が望まれている。
ここで、BBB透過性は、定位固定装置座標のプログラミング、開頭術の計画/マッピング、およびドリルビットのルーティングされた経路を参照する掘削スタイルの選択(「ポイントごと」対「水平」)を可能にする、対応するソフトウェアを備えた市販の外科用穴あけロボットを使用して測定されます。最初に、8つの「シード」ポイントがドリルされ(図1A)、頭蓋窓の輪郭が描かれます。ここから、シード間のスペースは、「ポイントバイポイント」または「水平」ドリル法のいずれかを使用して切り取られます。「ポイントバイポイント」は垂直パイロットホールカット(CNCドリルプレスと同様)を実行し、「水平」は穴の輪郭を描く頭蓋窓の円周に沿って水平カットを実行します(CNCルーターに似ています)。両方の方法の結果は、頭蓋骨窓を明らかにするために取り除くことができる頭蓋骨の一部です。穴あけによる損傷を隔離するために、追加の損傷を避けるために、頭蓋窓は物理的に取り外されません。EB色素と蛍光イメージングの組み合わせを使用して、マウスで開頭術を行った後のBBB透過性を測定し、挿入された熱電対を使用して、穴あけ中の脳表面の温度を直接測定します(図1B、C)。以前の観察では、2秒間隔でのパルス掘削のオン/オフがドリル加熱25を緩和するのに十分であることが示されたため、手術ロボットの実験アプローチに組み込まれています。
提示された研究の目的は、開頭穿孔による熱損傷を評価する方法を実証することです。方法は自動掘削のコンテキストで提示されていますが、そのような方法は手動掘削スキームにも適用できます。これらの方法は、標準的な手順として採用する前に、機器および/または掘削スキームの使用を検証するために使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64188/64188fig01.jpg"> 図1:実験的なパイプラインの概略図。 頭蓋窓手順後のEB定量のために動物が受けたプロセスを示す概略図。(A)脳定位固定装置フレームと手術ロボットドリルを備えたマウスの概略セットアップ。頭蓋窓の例は、シードポイント(緑)とエッジポイント(青)を持つ運動皮質の上に示されています。(B)灌流のセットアップには、動物全体に1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射して血液を除去し、続いて脳を抽出することが含まれます。(C)次に、脳をEB蛍光イメージングシステムチャンバーに入れて、エバンスブルー染料の蛍光イメージングを行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64188/64188fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>1 x リン酸緩衝生理食塩水 タイプ: 試薬</td><td>VWR</td><td>MRGF-6235</td><td>エバンス ブルー希釈オー</td></tr><tr><td>ラ用 ソフトウェア タイプ: ツール</td><td>スペクトル機器イメージング</td><td></td><td>ルミナイメージングシステム用オープンアクセスイメージング処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン タイプ: 動物</td><td>施設</td><td></td><td></td>から供給される薬剤</tr><tr><td>超硬ドリルビット、0.6mm (ロボットドリル) タイプ:ツール</td><td>ストールティング</td><td>58640-1</td><td></td></tr>カル<tr><td>プロフェン タイプ:</td><td>動物施設</td><td></td><td></td>から供給される薬物</tr><tr><td>セファゾリン タイプ:</td><td>動物施設</td><td></td><td></td>から供給される薬物</tr><tr><td>エバンスブルー Dye タイプ:試薬</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E2129</td><td>1xリン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>イソフルラン で再構成 タイプ:薬物</td><td>動物施設</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVISルミナII タイプから供給:ツール</td><td>パーキンエルマー</td><td>CLS136334</td><td>IVISルミナIIIは現在市場に出回っているルミナIIの代わりに</td></tr><tr><td>ジェンコ線形化温度計 タイプ:ツール</td><td>ジェンコ</td><td>765JF</td><td>熱電対のセットアップ用</td></tr><tr><td>ケタミン タイプ:動物</td><td>施設</td><td></td><td></td>から供給された薬剤</tr><tr><td>LivingImage タイプ: IVIS</td><td></td><td>Lumina III</td>Marcaine 用ツール <td></td></tr><tr><td>タイプ:</td><td>動物施設</td><td></td><td></td>から供給される薬剤</tr><tr><td>Neurostar Software タイプ: ツール</td><td>Stoelting</td><td></td><td>手術用ロボットの購入が付属しています</td></tr><tr><td>Physiosuite with MouseSTAT&reg;パルスオキシメータ &心拍数モニター タイプ:ツール</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>PS-03</td><td>バイタルモニタリングに使用</td></tr><tr><td>PrismPlus マウス タイプ:動物</td><td>ジャクソン ラボトリー</td><td>031478、RRID:IMSR_JAX:031478、オス、~8ヶ月齢</td><td>研究に使用された動物</td></tr><tr><td>電動定位固定装置用ドリルおよび注射ロボット タイプ:ツール</td><td>ストールティング</td><td>58640</td><td>定位固定装置フレーム付きメインロボットドリル</td></tr><tr><td>熱電対 タイプ: ツール</td><td>TC Direct</td><td>206-557</td><td>熱電対セットアップ用</td></tr><tr><td>USB-6008 多機能I/O DAQ タイプ: ツール</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>USB-6008</td><td>熱電対セットアップ用</td></tr><tr><td>キシラジン タイプ: 動物</td><td>施設</td><td></td><td></td>から供給される薬剤</tr></tbody></table>

マウスの頭蓋窓手術のためのロボットドリル開頭術による熱損傷の評価

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

頭蓋窓手術は、多光子または他の生体内イメージング技術を使用して、生きたマウスの脳組織のイメージングを可能にします。ただし、手作業で開頭術を行う場合、脳組織に熱損傷が発生することが多く、これは本質的に手術ごとに異なり、個々の外科医の技術に依存する可能性があります。手術ロボットを導入することで、手術を標準化し、手術に伴う熱損傷を減らすことができます。この研究では、熱損傷を評価するために、ロボット掘削の3つの方法をテストしました:水平、ポイントごと、およびパルスポイントごと。水平掘削は連続掘削回路図を利用しますが、ポイントごとに頭蓋窓を囲むいくつかの穴を掘削します。パルス化されたポイントバイポイントは、「2秒オン、2秒オフ」の穴あけスキームを追加し、穴あけの合間に冷却を可能にします。静脈内注射されたEvans Blue(EB)染料の蛍光イメージングは脳組織の損傷を測定し、掘削現場の下に配置された熱電対は熱損傷を測定します。熱電対の結果は、水平(16.66°C±2.08°C)およびポイントバイポイント(18.69°C±1.75°C)グループと比較して、パルスポイントバイポイント(6.90°C±1.35°C)グループで温度変化が大幅に減少していることを示しています。同様に、パルスポイントバイポイントグループも、水平法と比較して頭蓋窓穿孔後のEBの存在が有意に少なく、脳内の血管への損傷が少ないことを示しています。したがって、パルスポイントバイポイントドリル法は、熱損傷を低減するための最適なスキームであるように思われます。ロボットドリルは、トレーニング、変動を最小限に抑え、熱損傷を減らすのに役立つ便利なツールです。研究室全体で多光子イメージングの使用が拡大するにつれて、結果の厳密さと再現性を向上させることが重要です。ここで取り上げる方法は、これらの手術ロボットをより適切に使用してこの分野をさらに前進させる方法を他の人に知らせるのに役立ちます。

熱評価 熱損傷の可能性は、水平(図2A)、ポイントバイポイント(図2B)、およびパルスポイントバイポイント(図2C)の方法を使用して、掘削によるベースラインからの温度変化を測定することによって評価されました。図2Dは、熱データを取得するための実験セットアップを示しています。N = 4頭蓋窓のサンプルサイズを熱評価に使用しました。水平方向とポイント単位は同じシードドリル回路図を使用しますが、エッジポイントのカット方法によって異なります。パルスポイントバイポイントは、シードドリル部分とエッジドリル部分の両方にパルス方式を採用しています。水平法では、シード掘削は16.66 °C±2.08 °Cの最高温度変化を示し、エッジ掘削は9.08 °C±0.37 °Cを示しました。 ポイントバイポイント法では、シード掘削は18.69 °C±1.75 °Cの最大温度変化を示し、エッ...

頭蓋窓は、トランスジェニックマウスの生体内イメージングを可能にするために、遍在的に実装された外科的技術になっています。このプロトコルでは、頭蓋窓の半自動骨穴あけを実行し、外科医間のばらつきを減らし、熱血液脳関門の損傷を部分的に軽減するのに役立つ外科用ロボットの使用について説明しています。

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

このプロトコルは、頭蓋窓穿孔の結果として血管損傷を評価するための方法を提供する。手術ロボットは、手技を学ぶためのトレーニングの量を減らしながら、手順全体の一貫性を向上させます。この手順の間、私たちは非常に困難な頭蓋注射を利用しました。このテクニックに不慣れな人には、広範なトレーニングをお勧めします。まず、原稿に記載されているようにシステムを設定し、手術ロボットのマニュアルに従ってフレームキャリブレーションを実行します。外科用ソフトウェアに移動し、[クリーンなプロジェクトで開始]を選択して新しいプロジェクトを作成します。次に、被写体を上部にマウスとして設定し、使用するドリル座標アトラスを指定します。次に、[新しいプロジェクトの開始]を選択し、左下隅にある[計画]をクリックして、掘削座標の計画画面に移動します。頭蓋窓テクニックのドリルスキームを作成するには、脳定位固定装置アトラスの任意の場所をクリックします。bregmaを基準として使用し、原稿に記載されているように運動野の座標を入力します。キーボードの Enter キーを押して、選択した座標を更新します。[ターゲットの保存] をクリックしてこれらの座標を保存し、適切な名前を入力します。次に、左下の移動ボタンをクリックして、メインのドリル画面に戻ります。ツールをクリックし、次にプロジェクトをクリックし、名前を付けて保存オプションをクリックして、このテンプレートプロジェクトを後のプロジェクトに再利用します。まず、麻酔をかけたマウスに抗生物質、セファゾリン、鎮痛剤、カルプロフェン、ブプレノルフィンの皮下注射を投与します。次に、マウスを加熱パッドに置き、ノーズコーンを介した吸入により、0.5%〜2%イソフルランで麻酔を維持します。付属のイヤーバーを使用して手術ロボットの定位固定フレームに動物を取り付け、つま先のつまみでバイタルと麻酔薬の深さを定期的に評価します。次に、手術部位をグルコン酸クロルヘキシジンと70%イソプロパノールでこすり洗いして滅菌します。そして、手術中の無菌性を維持するために、マウスと定位フレームの上に滅菌プラスチックラップを置きます。メスの刃を使用して、目の後ろから頭蓋骨の正中線を1インチ切開し、3%過酸化水素を使用して頭蓋骨を乾かし、綿の先端のアプリケーターできれいにします。簡単に注射できるように尾を準備するには、アルコールで拭き取ります。親指と人差し指を使用して、尾を曲げて、尾の曲がりの上に尾静脈を露出させます。注射器を静脈と平行に挿入し、エバンスブルーのボリュームをゆっくりと注入します。注入したら、エバンスブルーが循環するまで5分間待ちます。注射が成功すると、マウスの四肢と手術窓が青色に変わるとすぐに確認されます。頭蓋骨の穴あけの準備ができたら、手術ソフトウェアに戻り、ツールをクリックします。次に、[プロジェクト]、[新規]の順に選択し、ドロップダウンメニューからテンプレートプロジェクトを選択してテンプレートプロジェクトを選択します。同じプロトコル要素を選択します。[計画]をクリックし、この新しいプロジェクトに引き継ぐドリルパラメータを選択して、[新しいプロジェクトを開始]をクリックします。次に、ツールをクリックして現在の動物のマウス頭蓋骨の傾きとスケーリングを考慮してドリルとフレームを修正し、[傾きとスケーリングの修正]を選択して修正画面を開きます。画面の上部で、薄赤色のドリルボタンをクリックしてドリルがアクティブであることを確認します 修正が実行されたら、画面中央の下部にある[閉じる]をクリックして修正ウィンドウから出て、[ツール]をクリックしてドリル画面に移動し、[ドリル]を選択してドリル手順を開始します。画面上部の開頭形状ウィンドウを選択してドリル部位を確認し、下のドロップダウンで掘削ターゲットの詳細を表示します。手動パルスドリルを実行するには、ドリルメニューのオートストップオプションの横にあるチェックボックスをオフにして自動停止機能をオフにします。ドリルメニューで、ドリル深さの前進として100マイクロメートルを選択します。ドリルサイトメニューを開き、最初のドリルサイトに移動します。前進ボタンまたは手動コントロールを使用して、頭蓋骨に触れるまでドリルを下げ、ドリルビットが頭蓋骨に到達したらセット面を押します。準備ができたら、[進む]をクリックして掘削を開始します。そして、ドリルが100マイクロメートル進んだら、Esキーを2回押してドリルを停止します。2秒後、頭蓋骨の深さについてこのサイクルを繰り返します。掘削中のシードポイントとエッジポイントごとに、硬膜に到達したら、ドリルメニューのボタンを使用して硬膜を設定してください。データ収集システムに接続された3つの異なる掘削スキームと組み合わせて熱電対を使用して頭蓋骨と脳の温度の変化を測定し、測定をMATLABに読み込むことができます。死体マウスを定位固定装置フレームに取り付け、ロボットドリルをセットアップします。頭蓋骨の側面に頭蓋窓を作る場所から約2ミリメートル離れたところに小さな穴を手動で開け、頭蓋窓の穴あけが行われる場所の下の位置に熱電対をスライドさせることができます。前に示したように、3つのスキームのそれぞれについて掘削プロセスを開始し、温度変化によるスパイクが発生し、ドリルが頭蓋骨を通過するときに脳の近くで加熱が発生することを示します。熱損傷の可能性は、水平、ポイントごと、およびパルスポイントごとの方法を使用して、掘削によるベースラインからの温度変化を測定することによって評価されました。水平掘削方式とポイントバイポイント掘削方式の両方で、熱変化に有意な違いはありません。しかし、パルスポイントバイポイント法に変更すると、水平およびポイントバイポイントドリルの両方よりも脳の加熱が大幅に少なくなりました。水平エッジ掘削には300秒かかりましたが、ポイントごとのエッジ掘削には200秒かかりました。パルス法は、シード掘削とエッジ掘削で最も長く、それぞれ約500秒かかりました。掘削スキームと血管損傷との関係を監視するために、Evans青色蛍光イメージングを実施した。水平およびポイントごとの切断による掘削は、脳内の血管系に損傷を与えることが見られました。対照群と比較して、パルスポイントバイポイント法は、シードおよびエッジポイントでの局所的な損傷が少なかったが、頭蓋窓内に目に見えるエバンスブルーの存在があった。手動で穴を開けるときは、硬膜が破られていないことを確認するために、ドリルを進めた後に開頭術をチェックすることが重要です。頭蓋窓に加えて、手術ロボットを標準的な開頭術に使用して、手術結果を改善することができます。

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学ぶロボットドリル開頭術によるマウスの頭蓋窓手術における熱損傷評価法。パルスポイントバイポイント法が水平法やポイントバイポイント法と比較して脳の加熱を有意に低減し、血管損傷を最小化する。

マウスの頭蓋窓手術のためのロボットドリル開頭術による熱損傷の評価

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