オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

オリエンタルショウジョウバエは、非常に侵襲的で適応性のある害虫種です。機能遺伝子研究のための効果的な方法は、環境にやさしい害虫管理戦略の開発に役立つ可能性があります。この方法は高効率かつ低コストである。

私たちのプロトコルは、オリエンタルショウジョウバエ研究者にとって突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。まず、目的の標的遺伝子の構造を予測し、バクトロセラス背筋ゲノムのバイオインフォマティクス解析によりエクソンとイントロンの境界を決定します。市販のgRNA合成キットを使用して、設計したsgRNAを生成します。

gRNA産物をヌクレアーゼフリーの水に再懸濁します。紫外可視分光光度計を使用して濃度を定量し、使用前に摂氏80度で保存してください。B.dorsalisの蛹をプラスチックケージに入れ、飼育条件は相対湿度55%、摂氏26.5度、光/日周期は14:10です。

大人が閉じたら、砂糖と酵母の混合物を水と一緒に食物として提供します。ほとんどの成人は出現後10日で性的成熟に達します。女性の繁殖力を改善するために30〜50ルクスのライトを備えたライトスタンドを使用し、したがって、胚収集の効率を向上させます。

次に、200メッシュのガーゼを、チャンバーの蓋から約1〜2ミリメートル離れた産卵室に置きます。マイクロインジェクションのセットアップの準備ができたら、新しい産卵室をケージに入れます。細かいウェットブラシを使用して10分ごとに胚を収集し、自作の注射プレートに並べます。

さらなる乾燥を避けるために、注射中に胚をハロカーボンオイルに浸します。Cas9タンパク質と対応するsgRNAをそれぞれマイクロリットルあたり300ナノグラムの濃度で混合することにより、作業溶液を調製します。次に、注入された胚をマークする便利な方法として機能するように、1マイクロリットルのフェノールレッドを混合物に加えます。

調製した混合物を氷上に置いて、sgRNAの分解を避ける。マイクロピペットプラーを使用してガラス注射針を準備します。気泡を導入せずに3マイクロリットルの混合物を注射針に加える。

次に、マイクログラインダーを使用して針を開き、ユーザーガイドに従ってマイクロマニピュレーターに接続します。インジェクターのパラメーターを Pi として 500 ヘクトパスカルに設定します。Tiは0.5秒、PCは200ヘクトパスカルです。

胚を並べたプレートを対物レンズの上に置きます。その後、マイクロピペット位置を微細光学顕微鏡下で調整し、マイクロピペットと胚とを同一平面上にセットした。針先を胚の後部または植物極に挿入します。

次に、インジェクターからペダルを押して、混合物を胚に送達します。わずかに赤みがかった色の出現は、混合物中のフェノールレッドの添加によるものである。注入された胚を含む注射プレートを人工気候室に入れる。

36時間後、孵化した幼虫を細い先端ブラシを使用して幼虫の餌に移します。幼虫が孵化しなくなるまで、幼虫を毎日3〜4回集めます。次に、成熟した幼虫を湿った砂に入れて蛹にします。

蛹化段階は10日かかります。蛹化後、閉鎖が始まる前に蛹をプラスチック製のケージに移動します。個々の成体の新鮮な蛹または単一の中脚からゲノムDNAを単離し、標的領域を増幅するための特異的プライマーを設計した後、本文に記載されているサイクリング条件に従ってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行します。

次に、精製PCR産物を配列決定する。標的部位に隣接する複数の重複するピークを検出することは、突然変異誘発が成功したことを示唆している。サブクローニングの場合は、精製したPCR産物を平滑末端ベクターと混合し、摂氏25度で15分間ライゲーションします。

次に、trans-T1細胞を追加し、氷上に30分間置きます。次に、500マイクロリットルのLB培地を加え、振とうしながら摂氏37度で1時間インキュベートします。遠心分離して上清を捨てる。

ペレットを再懸濁し、LBプレート上に広げます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベーションします。次に、シーケンシングのために個々の細菌コロニーを選択して、変異体の遺伝子型を検証します。

本研究では、選択した遺伝子の標的部位の例を第3エクソンに配置する。標的部位は高度に保存されており、合成gRNAおよびin vitro転写で得られたgRNAのDNA鋳型についてゲル電気泳動によりシングルバンドを検出した。B.dorsalisの生存率とマイクロインジェクション後の突然変異誘発をここに示します。

PCR産物の配列決定後、G0個体の80%がモザイク変異体である。変異体スクリーニングにおいて、8塩基対欠失を有する変異体は、アミノ酸翻訳の早期終了をもたらした。胚の後部または植物極に針を挿入することは、卵の生存に直接影響するため、中心的なステップです。

この技術は、B.Dorsalisの遺伝子機能の領域を研究するためのリファレンスを提供します 彼らはこの方法で彼らが望む突然変異体をすばやく捕らえることができます。