2光子ホログラフィック顕微鏡を用いた神経活動の評価と操作
2022年9月16日
神経活動の異常に伴う精神神経疾患の病態解明を目指し、高い時空間分解能で神経活動を可視化・評価・操作できる2光子ホログラフィック顕微鏡を開発しました。
このプロトコルは、神経活動に関する正確な空間時間情報を提供します。この技術の主な利点は、高い空間的時間分解能で神経活動を操作および評価できることです。神経活動の異常を引き起こす精神神経疾患の病原体を説明するのに役立つ場合があります。
この方法は、他の臓器の健康だけでなく、ニューロンの研究にも適用できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の大学院生である郭中天です。頭部移植の翌日、脳浮腫を避けるために手術の1時間前に1キログラムあたり1.32ミリグラムのデキサメタゾンリン酸ナトリウムを腹腔内投与する。
ステレオスコープの下で、歯科用ドリルを使用して直径約2ミリメートルの円形開頭術を行います。脳の損傷を減らすために、一定のわずかな動きと軽い下向きの圧力で歯科用ドリルを慎重に操作してください。吸引システムを使用して骨片を数回取り除きます。
骨片を取り除いた後、人工脊髄液またはACSF溶液を使用して、脳の表面に残っている破片を取り除き、洗浄します。炎症反応を抑制するために、この洗浄手順を数回繰り返します。圧力注入システムを使用して、適切な圧力を設定して、先端直径10〜20マイクロメートルのガラスキャピラリーを通して500ナノリットルのAAV溶液を10分間注入します。
ガラス毛細管内のAAV溶液のレベルが徐々に低下する場合、AAV溶液は脳に投与されています。逆流を防ぐために、ガラスキャピラリーをさらに10分間そのままにしておきます。これを3回繰り返して、合計1.5マイクロリットルのAAV溶液を脳に投与します。
マイクロピペットを使用してS1の脳表面に2%低融点アガロースを塗布し、2つのカバーメガネで開頭術の上にガラス窓を置きます。カバーガラスを液体のままアガロースに押し付けます。これにより、アガロース中の気泡の形成が防止される。
頭蓋窓の端を歯科用接着性レジンセメントでシールします。ホログラフィック刺激システムを較正するには、赤色蛍光スライドの表面をサンプル面に置き、弱い励起光で顕微鏡をライブイメージングモードに設定します。キャリブレーション GUI を実行します。
mfile、パラメータペインを確認し、[保存]ボタンをクリックします。ステップ 1 ペインの [Z スキャン] ボタンをクリックすると、各平面から 2 マイクロメートル離れた 21 の異なる軸面に 3 つのランダムなスポットが自動的に生成されます。スライドバーを動かしてライブ画像を確認します。
スポットが最も小さく、最も明るく表示される完璧な平面を見つけて、[保存]ボタンをクリックします。これにより、デジタルホログラムのオフセット球面が自動的に生成されます。ステップ 2 ペインの [移動] ボタンをクリックし、左側の四角形の 6 つのスポットをクリックします。
ライブ画像を確認してください。識別可能な蛍光スポットが6つある場合は、編集ボックスにx軸とy軸を入力し、[保存]ボタンをクリックします。これにより、ホログラフィック刺激とイメージングシステム間のキャリブレーションを調整するための細かい変換係数が自動的に生成されます。
次に、ステップ3ペインの[スキャン]ボタンをクリックします。441個のデジタルホログラムを生成し、21 x 21ステップで視野全体でシングルスポットスキャンを実行します。リストボックスでパターンを変えながら画像を確認します。
レーザー出力を調整して、イメージングデバイスのダイナミックレンジ内のスポット画像を取得します。イメージングデバイスを記録モードにして、[再生]ボタンをクリックします。再生が完了したら、ステップ 4 ペインの [ウェイト マップの生成] をクリックし、スタック画像を選択します。
次に、キャリブレーションGUIウィンドウを閉じます。各スポットの不均衡な強度を補正するために、ウェイトマップが自動的に生成されます。AAVを注入したマウスにヘッドプレートを顕微鏡下に置き、ホログラフィック顕微鏡と25倍の対物レンズで920ナノメートルに調整されたモードロックチタンサファイアレーザーを使用して2光子イメージングを実行します。
ライブイメージングモードで商用イメージングソフトウェアを開きます。画像検出器の電圧とイメージングレーザーの出力を調整して、GCaMP8fを発現するニューロンの明るさを最適化します。このタンパク質を発現しているニューロンの画像をキャプチャします。
ホログラフィック照明で特定のニューロンを照らすには、SLMコントロールを実行します。m スクリプト ファイル。参照画像をクリックし、取得した画像を選択します。
次に、[スポット]ボタンをクリックして画像内のニューロンの特定のピクセルを選択し、キーボードのEnterボタンを押して確定します。イメージセンサーを用いて神経活動を高い時間分解能で検出するには、露光時間、撮像領域、ビニングを設定し、画像取得を行います。マウスを顕微鏡下に置き、2光子イメージングを実行した後、市販のイメージングソフトウェアを開きます。
ライブイメージングモードでは、画像検出器の電圧とイメージングレーザーのパワーを調整して、GCaMP-6m-p2A-ChRmineを発現するニューロンの明るさを最適化します。これらのタンパク質を発現しているニューロンの画像をキャプチャし、前に示した手順に従って特定のニューロンを照らします。第2層および第3層のニューロン内の機能的接続性を調べるには、空間光変調器を使用して光遺伝学的刺激のホログラフィックパターンを生成し、それを2光子カルシウムイメージングと組み合わせます。
皮質表面から10〜150マイクロメートルの深さで測定したイメージングレーザーの強度を920ナノメートルに設定し、視野を256マイクロメートル×256マイクロメートルに設定します。ピクセル滞留時間を 2 ヘルツの場合は 1.5 マイクロ秒、30 ヘルツの場合は 100 ナノ秒に設定します。イメージングフレームレートとして2ヘルツと30ヘルツの両方を使用して、単一のホログラフィック刺激がニューロンにカルシウム応答を引き起こしたかどうかを確認します。
単一のニューロンを刺激するホログラフィック刺激レーザーの強度を、神経活動を誘発するのに十分な10ミリワットに設定します。同時に、1040ナノメートルで10回のホログラフィック刺激を行い、ベースライン期間10秒後50ミリ秒の持続時間で8秒間隔で、920ナノメートルでのカルシウム鉄応答を画像化します。その後、マウスをホームケージに戻します。
ホログラフィック刺激とイメージセンサーを用いた100ヘルツイメージングにおけるGCaMP8fを発現するニューロンの代表的な画像と痕跡を以下に示す。このグラフは、各レーザー出力でのホログラフィック刺激に対する神経応答を示しています。ここでは、2ヘルツおよび30ヘルツのイメージングフレームレートで10種類のニューロンをホログラフィック刺激する際の代表的なカルシウム2+トレースを示します。
同じ色は同じニューロンを示します。ニューロン間の機能的接続を評価する概略図がここに示されている。オレンジ色のニューロンが刺激されると、赤色のニューロンが同時に応答し、これらのニューロン間に機能的な接続があることを示します。
野生型でGCaMP6mを発現する初代体性感覚皮質ニューロンの典型的な画像をここに示す。これらのグラフィック画像は、2ヘルツおよび30ヘルツのイメージングフレームレートでのホログラフィック刺激中の典型的なカルシウム2+トレースを表しています。ホログラフィック刺激に対する神経応答性は、2ヘルツと30ヘルツの両方のイメージング速度で検出できます。
これらのステップは、脳の動きを減らすために重要であり、2つは安定した結果を得ることです。この顕微鏡は、特定のパターンを持つニューロンを書く際に行動を誘発できると考えています。この技術により、個々のニューロンの活動を評価および操作し、神経精神医学を詳細に特徴付けることができるようになりました。
概要
この研究では、高い時空間分解能で神経活動を可視化、評価、操作するように設計された二光子ホログラフィック顕微鏡を提示します。この技術は、異常な神経活動に関連する神経精神疾患の根底にあるメカニズムを解明することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 神経画像
- 神経精神疾患
背景
- 高い時空間分解能は、神経活動を理解する上で重要です。
- 神経精神疾患はしばしば異常な神経活動を示します。
- 神経活動の可視化と操作は、これらの疾患の研究に役立ちます。
研究目的
- 神経ダイナミクスを評価し操作するためのプラットフォームを開発すること。
- 神経精神疾患の病因を探ること。
- 異常な神経活動メカニズムへの洞察を提供すること。
使用された方法
- 研究では二光子ホログラフィック顕微鏡を使用しています。
- AAV溶液を注入されたマウスモデルを使用して神経活動を分析します。
- 主要なタイムラインには、頭部プレートの埋め込み手術とそれに続く撮像セッションが含まれます。
- 撮像前にホログラフィックシステムの校正が行われます。
主な結果
- 二光子ホログラフィック顕微鏡により、神経活動の正確な可視化が可能になります。
- 神経活動が疾患メカニズムとどのように相関するかについての重要なメカニズム的洞察が強調されています。
- オプトジェネティック刺激に対する神経応答が効果的に記録されます。
結論
- この研究により、神経活動の高度な可視化と操作が可能になります。
- 神経精神疾患の病理学に関する重要な洞察が提供されます。
- この発見は、神経メカニズムの理解と潜在的な治療アプローチに影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution two-photon holographic microscopy enables precise visualization and manipulation of neural activity, addressing a critical need for mechanistic de-risking in neuropsychiatric disorder research. This capability enhances predictive confidence in target validation and functional pathway interrogation, supporting risk-adjusted portfolio decisions in neuroscience R&D. The approach positions teams to advance disease-relevant models with quantitative, reproducible outputs for early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neural circuit function and mechanistic pathway mapping at single-neuron resolution.
- Supports biological de-risking by allowing selective activation and evaluation of individual neurons within complex tissue.
- Provides quantitative, high-temporal-resolution data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated neural systems for downstream optogenetic and imaging workflows.
- Delivers standardized, reproducible calcium imaging and optogenetic stimulation outputs for assay development.
- Enables reliable evaluation of neural responsiveness to controlled stimuli, supporting compound screening strategies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neural activity measurements with disease-relevant phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional connectivity analysis in vivo.
- Reduces mechanistic ambiguity in neuropsychiatric disorder models, informing risk-adjusted advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the neuroscience discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable platform for functional neural interrogation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of neural circuit function and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging and stimulation outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of calcium responses and functional connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Connects neural activity manipulation to disease-relevant endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, high-resolution imaging and stimulation capability for broad neuroscience R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable neural imaging and manipulation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling quantitative, disease-relevant data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroscience assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, two-photon microscopy, and neural circuit analysis.
- Demands advanced instrumentation, including spatial light modulators and high-speed imaging systems.
- Necessitates rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation across different neural models may require protocol optimization and validation.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for precise system alignment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
Surgery and Adeno‐Associated Virus (AAV) Injection
2:50
Preparation for the Holographic Stimulation or Illumination System
4:54
Ca2+ Imaging Using an Image Sensor with Holographic Illumination
6:06
Two‐Photon Imaging with Optogenetics Using a Holographic Microscope
8:04
Results: Imaging and Functional Connectivity Using a Holographic Microscope
9:26
Conclusion
