Name: エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ マウス胚の心内膜クッション作製法。エンフェイスイメージングを用いて平面細胞極性と細胞動態を解析し、心臓弁形成における内皮細胞の挙動を明らかにする新規アプローチです。

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本研究は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033からJ. L. P. J.G.-Bへの助成金PID2019-104776RB-I00およびCB16/11/00399(CIBER CV)の支援を受けました。マドリード市(2020-5ª/BMD-19729)のアトラシオン・デ・タレント・プログラムから資金提供を受けました。T.G.-C.Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)から資金提供を受けた。我々は、MCIN/AEI /10.13039/501100011033とFEDER「ヨーロッパを作る方法」(#ICTS-2018-04-CNIC-16)の共同出資により、CNIC顕微鏡・ダイナミックイメージングユニット(CNIC)、ICTS-ReDibに感謝する。また、A.ガリシアとL.メンデスのマウス飼育にも感謝します。この出版物の費用は、欧州地域開発基金からの資金によって部分的に支えられました。CNICは、ISCIII、MCIN、およびPro CNIC財団によってサポートされており、MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033によって資金提供されたセベロオチョアセンターオブエクセレンス(助成金CEX2020-001041-S)です。

動物実験は、Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares(CNIC)動物実験倫理委員会およびマドリッド共同体によって承認されました(PROEX 155.7/20参照)。すべての動物の手順は、Real Decreto 201/63に基づいてスペインの法律で制定された、実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するEU指令2007/63EUおよび勧告2007/526 / ECに準拠しています。
1. AVCおよび/またはOFTのオブテンション(Xiaoらから適応。25)
<ol><li>午後にメスの mTmG とオスの VE-カドヘリン-Cre-ERT/+の間に交配を設定します。</li>
	<li>翌朝、膣栓をチェックします。膣栓がある場合は、半日(E0.5)として数えます。関心のある実験に応じて、8日または9日を数えます。</li>
	<li>解剖の24時間前に、コーン油で希釈した5 mg / mL 4-OH-タモキシフェン50 μLで妊娠中の女性を経口投与します。. 注:この用量は、GFP陽性クローンの存在によって明らかにされた限られた量のCRE媒介組換えを誘発します。適切な用量は、4-OH-タモキシフェンの新しいバッチごとに決定する必要があります。</li>
	<li>子宮頸部脱臼によりE8.5またはE9.5で妊娠中の女性を犠牲にします。</li>
	<li>ハサミを使って妊娠マウスの腹部を開き、ハサミと細かい鉗子を使って胚を含む子宮を取り除きます。</li>
	<li>氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と0.1%Tween-20(PBT)を含むペトリ皿に子宮を置きます。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で細かい鉗子を使用して子宮から個々の脱落膜を取り除きます。</li>
	<li>細いピンセットを使って、胚がある脱落膜の白い部分を切開し、引っ張らないようにそっと取り除き、先端を切り落としたP1000を使用して新鮮なPBTを入れた新しいペトリ皿に胚を移し、胚が壊れずに通過するのに十分な直径を残します。</li>
	<li>ジェノタイピングのために、卵黄嚢の小片(0.5 mm2)または尾片(後端から頭に向かって5〜10個の体節を数えます)を取り、100 μLの適切なバッファーで消化します。</li>
	<li>ヒュームフードの下で、4°Cの微量遠心機(2 mL)チューブ内の滅菌ろ過PBS中の氷冷した4%パラホルムアルデヒド(4%PFA)に胚を移します。 胚を2時間から4°Cで一晩(O / N)ナテーターに固定します。</li>
	<li>ヒュームフードの下で、胚に触れることなく、微量遠心チューブから4%PFA固定液を取り除きます。PFA を適切な容器に入れて廃棄します。</li>
	<li>胚を冷たいPBTで室温(RT)でそれぞれ10分間5回洗浄します。</li>
	<li>細かい鉗子を使用して心臓を取り外し、新鮮なPBTを入れた新しい1.5mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
</ol>2. マウス胚性心臓のホールマウント免疫蛍光法
<ol><li>PBTをPBSTr(PBS中の0.4%トリトンX-100)に置き換え、オービタルシェーカーのRTでサンプルをそれぞれ3回、5分間洗浄します。</li>
	<li>PBSTrをブロッキング溶液(PBSTrを10%熱不活化ウシ血清)に置き換えます。オービタルシェーカーで4°Cで2時間O/Nインキュベートします。</li>
	<li>ブロッキング溶液を、所望の濃度の一次抗体を含むブロッキング溶液に置き換えます(抗GFPまたは抗VE-カドヘリン抗体の場合は、1:1000希釈を使用します)。オービタルシェーカーでO/Nを4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>4°CでO/Nインキュベートした後、オービタルシェーカーでRTで1.5時間インキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために非常に重要です。</li>
	<li>一次抗体溶液を取り出し、最大3回の実験のために4°Cに保ちます(最適な保存のために、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%まで添加します)。</li>
	<li>胚をPBSTrでそれぞれ3分間3回洗浄します。</li>
	<li>胚をPBSTr 3xで4°Cのオービタルシェーカーでそれぞれ30分間洗浄します。</li>
	<li>最後の洗浄後、一次抗体宿主種に対する1:1000蛍光標識二次抗体を含むブロッキング溶液1 mLを加えます。また、1:3000 DAPIを溶液に加え、胚O/Nをオービタルシェーカーで4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>4°CでO/Nインキュベートした後、オービタルシェーカーでRTで1.5時間インキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために非常に重要です。</li>
	<li>胚をPBSTrでそれぞれ3分間3回洗浄します。</li>
	<li>胚をPBSTr 3x-5xでRTのオービタルシェーカーでそれぞれ30分間洗浄します。</li>
</ol>3. マウス胎児AVCまたはOFTのマウント
<ol><li>PBSを含むペトリ皿(35 mm)にハートを置きます。</li>
	<li>タングステン線と細い鉗子を使用して、AVCまたはOFTを分離し、縦方向に切断します26。</li>
	<li>カバーガラス(22 mm x 22 mm)、スライド(60 mm x 24 mm)、鉗子、適切なチップ付きのP200ピペット、ペーパータオル、および蛍光用のグリセロール水性封入剤をDAPIなしで準備します。</li>
	<li>Xiao, C. et al.25と同様のアプローチを使用して、0.3〜0.6 cm離れたスライドに2本のテープを貼り付けて、サンプルを押しつぶさずに元の形状を保存できる3Dルームスペースを作成します。</li>
	<li>慎重に、最小量のバッファーを使用して、カットされたP200チップピペットを使用して、テープストライプの間のスライドにサンプルをドロップします。解剖顕微鏡を使用して精度を高めます。</li>
	<li>細かい鉗子を使用して、心内膜を上に向けてサンプルを置きます(スライド上で心筋を下向きにします)。</li>
	<li>ペーパータオルで余分なPBSを取り除き(サンプルに触れないでください)、サンプルをRTで1〜2分間乾燥させて、サンプルをスライドにくっつけます。</li>
	<li>40 μLの水性ベースの封入剤を組織に追加します。</li>
	<li>カバーガラスを2枚のテープの上に置き、針または鉗子でゆっくりとティッシュの上に下げます。気泡は発生しないでください。</li>
	<li>カバースリップの各頂点に1滴のマニキュアを使用してカバーガラスをシールします。</li>
	<li>マニキュアが乾いたら、吸収性ペーパータオルを使用してカバーガラスの側面から余分な封入剤を取り除きます。カバーガラスを動かさないでください。</li>
	<li>カバーガラスの端に沿ってマニキュアを追加して完全に密閉し、マウントメディアの蒸発を防ぎます。</li>
	<li>正立または倒立共焦点顕微鏡を使用して、一般表示の場合は10倍、詳細画像の場合は3倍ズームで63倍で画像を撮影します。</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750(2014).</li>
<li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200(2021).</li>
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<li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+chamber+formation%3A+Development%2C+genes%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li>
<li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li>
<li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li>
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<li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+tissue+interactions%3A+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li>
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<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li>
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<li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+Par3%2FBazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li>
<li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li>
<li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+moving+cells%3A+Think+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li>
<li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034(2016).</li>
<li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li>
<li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li>
<li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+morphodynamics%3A+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li>
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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

心内膜は、胚性心臓管の内面全体を覆う上皮単層である。弁の発達中、将来の弁領域の心内膜細胞はEMTを受けるため、心内膜細胞は細胞骨格を形質転換および再配置して、心内膜から心臓ゼリーに向かって剥離します。私たちらは、心内膜が細胞の列として示されているE8.5およびE9.5胚性心臓の横断切片を分析することにより、マウス胚の弁発生に関する関連データを取得しました6、8、24、32。このアプローチにより、弁の発生に関与するシグナル伝達経路やその他の分子の発現を解析することができましたが、弁膜前心内膜の空間的側面を解析することはできませんでした。
AVCまたはOFT外植片は、主に3Dコラーゲンゲル上でECを変換する研究に使用されました。外植片は、EMT定量、形質転換能力の分析、または培養6、<...

心臓は哺乳類の胚の最初の機能的な器官です。マウスの胚期(E)7.5日目頃、両側前心臓中胚葉細胞は腹側1に心臓三日月を形成する。心臓三日月には、心筋と心内膜2の前駆細胞を含む前心臓細胞の2つの集団が含まれています。E8.0付近では、心臓前駆体が正中線で融合し、外側心筋と、心臓ゼリーと呼ばれる細胞外マトリックスによって分離された特殊な内皮である内心内膜の2つの上皮組織からなる原始的な心臓管を形成します。その後、E8.5で、心臓管は右向きにループします。ループ心臓には、流出路(OFT)、心室、房室管(AVC)など、特定の分子シグネチャを持つさまざまな解剖学的領域があります3。最初は細胞4の添加により心臓管はその流入側で拡張するが、E9.5では集中的な心臓増殖により、心腔のバルーニングと小柱網5の確立が生じる。弁形成は、AVC(将来の僧帽弁および三尖弁)およびOFT(将来の大動脈弁および肺弁)で行われます。
心内膜は弁の発達に重要な役割を果たします。心内膜細胞は、AVCおよびOFTで上皮間葉転換(EMT)を受けて、弁の発達の開始時に現れる構造である心内膜クッションを形成します。異なるシグナル伝達経路がこのプロセスを活性化します。マウスのE9.5では、心筋由来BMP2に応答して心内膜で活性化されたNOTCHは、TGFβ2およびSNAI(SNAI1)の活性化を介してAVCおよびOFT領域の心内膜細胞の侵襲性EMTを促進し、接着接合部(AJ)の膜貫通成分である血管内皮カドヘリン(VE-カドヘリン)の発現を直接抑制します6,7,8。.OFTでは、EMTを開始するための心内膜の活性化はFGF8およびBMP4によって媒介され、その発現はNOTCH9、10、11、12によって活性化される。
EMTの進行には、細胞が形を変え、隣接する細胞との接合部を壊して作り直し、層間剥離し、移動し始めるときの細胞動態が含まれます13。これらの変化には、AJのリモデリングと段階的な分解14,15、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達、アピコ基底極性(ABP)の喪失、頂端狭窄、および細胞骨格組織が含まれます16,17。ABPは、細胞の前後軸に沿ったタンパク質の分布を指します。発達中の心臓では、心筋細胞におけるABP調節が心室の発達に必要です18。PCPは、組織の平面を横切る細胞内のタンパク質の分極分布を指し、細胞分布を調節します。安定した幾何学を持つ上皮は六角形の細胞で構成されており、頂点19,20,21,22に収束するのは3つの細胞だけです。上皮形態形成中に起こる細胞分裂、隣人交換、または層間剥離などの異なる細胞プロセスは、頂点に収束する細胞の数と、特定の細胞が持つ隣接細胞の数が22増加する。PCPに関連するこれらの細胞挙動は、異なるシグナル伝達経路、アクチン動態、または細胞内輸送によって調節され得る23。
マウスにおける弁の発達を研究するために生成されたデータは、E8.5およびE9.5胚性心臓の横方向、冠状、または矢状切片から得られており、心内膜は細胞の野としてではなく細胞の列として示され、心内膜は心臓管24の内面全体を覆っている。胚切片は、マウス胚の心内膜におけるPCPの分析を可能にしない。我々の新しい実験法は、代表的な結果に示すように、心内膜細胞分布の解析、AJ異方性、および単一細胞形状解析を可能にします。このタイプのデータは、PCPに関連する他の分子の説明とともに、PCP分析に必要ですが、このレポートには示されていません。ホールマウント免疫蛍光法、特異的サンプル調製、および遺伝子改変マウスの使用により、マウスの弁発生開始時の心内膜の平面極性分析が可能になります。

<table><tbody><tr><td>4-OH-タモキシフェン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-6278</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldheyde</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>157-10</td><td>水で 4% に希釈</td></tr><tr><td>反 GFP</td><td>Aves Labs</td><td>FGP-1010</td><td></td></tr><tr><td>抗 VECadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗チキン、アレクサ フルーア 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス アレクサ フルーア 647</td><td>ジャクソン イムノリサーチ</td><td>115-605-174</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099,0005</td><td></td></tr><tr><td>スライド スーパーフロスト PLUS</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>A4974,0500</td><td>AppliChem</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド マウントミディアム</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr></tbody></table>

エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

哺乳類の心臓の発達の根底にある細胞および分子メカニズムの研究は、ヒトの先天性心疾患に対処するために不可欠です。原始心臓弁の発達には、局所誘導性心筋および心内膜信号に応答して、心臓の房室管(AVC)および流出路(OFT)領域からの心内膜細胞の上皮から間葉への移行(EMT)が含まれます。細胞が層間剥離し、心内膜と心筋の間に位置する細胞外マトリックス(心臓ゼリー)に浸潤すると、原始心内膜クッション(EC)が形成される。このプロセスは、心内膜が剥離された細胞によって残されたギャップを埋めなければならず、軸に沿って収束(狭く)または伸長(延長)するためにそれ自体を再編成しなければならないことを意味する。現在の研究では、このプロセスに関与する因子の細胞内局在の調節に平面細胞極性(PCP)経路が関与しています。古典的には、心臓弁発生の初期段階は、胚性心臓の断面またはコラーゲンゲル上で培養された ex vivoAVC またはOFT外植片で研究されてきました。これらのアプローチは、アピコ基底極性の分析を可能にするが、上皮の平面内の細胞挙動または移動する細胞の形態学的変化の分析は可能ではない。ここでは、弁形成領域の心内膜を細胞の平面場として可視化できる実験的手法を示す。この実験的アプローチは、弁の発達中のOFTおよびAVCの心内膜内のPCP、平面トポロジー、および細胞間コミュニケーションを研究する機会を提供します。心臓弁の形態形成に関与する新しい細胞メカニズムの解読は、心内膜クッションの欠陥に関連する先天性心疾患の理解に貢献する可能性があります。

このプロトコルを使用して生成されたデータは、AVCの心内膜の顔面イメージングを実行することが可能であることを示しています。最初の目的は、弁形成中の心内膜の細胞形状を細胞分解能で解析することでした(図1)。E9.5の個々の心内膜細胞を強調するために、2つのトランスジェニックマウス系統を使用しました。(1)ROSA mT/mGは、細胞膜で蛍光が検出される2色の蛍光Creレポーター対立遺伝子(tdトマト/mTおよびEGFP/mG)です。Cre媒介活性化なしでは、導入遺伝子はtdTomato(mT)を発現する。Cre媒介活性化により、tdTomato発現は、特定の細胞およびクローン誘導体におけるEGFP蛍光発現(mG)に置き換えられる27。(2)Cdh5CreERT2/+マウス株は、胚期の血管内皮および心内膜で発現する血管内皮カドヘリンプロモーター(Cdh5)の制御下でタモキ...

古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の 顔面2次元イメージングのための私たちの新しいアプローチは、弁発生中の心内膜の平面極性と細胞再配列分析を可能にします。

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

このプロトコルは、平面方向での原始心内膜の分析を可能にする。心内膜細胞の分布、他の差し止め命令の異方性を解析し、弁発生中の単一の心内膜細胞の形状を記述することができます。古典的な組織切片と比較して、内弁再生領域のエンフェイスイメージングにより、無傷の胚における弁発生中の平面細胞極性と心内膜細胞のダイナミクスの分析が可能になります。この方法は、心臓発達中の平面細胞極性の知識を深めるために使用できます。安楽死させた妊娠マウスから摘出した子宮を、氷冷PBTを含むペトリ皿に入れることから始めます。細かい鉗子を使用して解剖顕微鏡下で子宮から個々の脱落膜を取り除きます。細いピンセットを使用して、胚がある落膜の白い部分を切開します。それをそっと取り除き、引っ張らないようにし、先端を切り落としたP-1000を使用して、胚が壊れずに通過するのに十分な直径を残して、新しいPBTを含む新しいペトリ皿に胚を移します。ジェノタイピングのために、卵黄嚢の約0.5平方ミリメートルの小片または後端からの尾の一部を取り、頭に向かって5〜10個の体節を数え、100ミリリットルの適切なバッファーで消化します。ヒュームフードの下で、胚を摂氏4度の2ミリリットルの微量遠心チューブ内の氷冷4%PFAに移します。胚を2時間から4°Cで一晩、ナテーターに固定します。ヒュームフードの下で、胚に触れることなく、4%PFA固定液をマイクロ遠心チューブから取り出します。PFA を適切な容器に入れて廃棄します。胚を冷たいPBTで室温で10分間5回洗浄します。細かい鉗子を使用して心臓を取り外し、新しいPBTを備えた新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。PBTをPBSトリトンに置き換え、オービタルシェーカーで室温でサンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。PBSトリトンを、10%熱不活性化ウシ血清を含むPBSトリトンを含むブロッキング溶液に置き換えます。.オービタルシェーカーで摂氏4度で2時間から一晩インキュベートします。ブロッキング溶液を、所望の濃度の一次抗体を含むブロッキング溶液と交換します。摂氏4度のオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。摂氏4度で一晩インキュベートした後、オービタルシェーカーで室温で1.5時間サンプルをインキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために重要です。一次抗体溶液を取り出して摂氏4度に保ち、今後最大3回の実験を行います。最高の保存のために、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%まで添加します。次に、胚をPBSトリトンでそれぞれ3分間3回洗浄します。胚をPBS Tritonで30分間3回洗浄し、摂氏4度のオービタルシェーカーに保ちます。最後の洗浄後、一次抗体宿主種に対する蛍光標識二次抗体を含むブロッキング溶液1ミリリットルを加えます。次に、DAPIを溶液に加え、摂氏4度のオービタルシェーカーで一晩胚をインキュベートします。摂氏4度で一晩インキュベートした後、オービタルシェーカーで室温で1.5時間胚をインキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために不可欠です。テキスト原稿に記載されているように、PBSトリトン洗浄手順を繰り返します。PBSが入った35ミリメートルのペトリ皿にハートを置きます。タングステン線と細い鉗子を使用して、房室管または流出路を分離し、それらを縦方向に切断します。カバースリップ、スライド、鉗子、適切なチップを備えたP-200ピペット、ペーパータオル、およびDAPIなしで蛍光を発するための水性グリセロールベースの封入剤を準備します。0.3〜0.6センチメートル離れたスライドに2枚のテープを貼り付けて、サンプルを押しつぶさずに元の形状を維持できる3Dルームスペースを作成します。次に、約20マイクロリットルのバッファーを使用して、カットされたP-200ピペットチップを使用して、テープストリップ間のスライドにサンプルを注意深くドロップします。解剖顕微鏡を使用して精度を高めます。細かい鉗子を使用して、心内膜を上に向けて、心筋を下にしてサンプルをスライド上に置きます。ペーパータオルで余分なPBSを取り除き、サンプルに触れないようにしてください。次に、サンプルを室温で1〜2分間乾燥させて、サンプルをスライドに付着させます。40マイクロリットルの水性ベースの封入剤を組織に追加します。カバースリップを2枚のテープの上に置き、針または鉗子でゆっくりとティッシュの上に下げます。気泡は発生しないでください。カバースリップの各頂点に1滴のマニキュアを使用してカバースリップをシールします。マニキュアが乾いたら、吸収性ペーパータオルを使用して、カバースリップの側面から余分な封入剤を取り除きます。カバースリップを動かさないでください。カバースリップの端に沿ってマニキュアを追加して完全に密閉し、マウントメディアの蒸発を防ぎます。正立顕微鏡または倒立共焦点顕微鏡を使用して、一般的なビューの場合は10倍の倍率で、詳細な画像の場合は3倍ズームで63倍の倍率で画像を撮影します。心内膜の細胞形状は、弁の形成中に細胞分解能で分析された。単一細胞または数細胞のクローンが心内膜においてGFPを発現した。GFPの発現とVE-カドヘリンの細胞内局在との併用は、AJが溶解するにつれて膜突起を発達させるため、AJ動態と糸状足の形成およびEMT前の細胞との関係を研究するための効果的なアプローチでした。心内膜におけるVE-カドヘリン染色の強度の違いは、弁膜前段階で房室管の胚性心内膜に異方性収縮性が存在することを示した。心臓全体をE8.5およびE9.5のVE-カドヘリン抗体で染色した。E8.5では房室管の心内膜は安定した上皮組織を有する傾向があり、4つ以上の細胞によって形成された頂点は検出されなかった。E9.5では、最大6個の細胞の頂点がロゼット様構造を形成していることが観察され、これは、前述した上皮が活発な細胞再配列を受けている細胞組織と同様に、房室管心内膜が弁発生中に動的な細胞再配列を受けていることを示唆しています。このテクニックの専門家になるには、学習曲線が必要です。さらに、ソブリン鉗子とタングステン線を使用することを強くお勧めします。今日、弁膜前心内膜の視覚化は断面に限られていました。私たちのアプローチは、平面的な観点から胚性心膜膜の挙動を研究する可能性を提供します。

en-face-endocardial-cushion-preparation-for-planar-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。...

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

我々は、光のクリアランス、共焦点顕微鏡に続く標準的な免疫学的染色法を用いて、E15.5までの全胚マウス心臓における冠血管の分析のためのプロトコルを提示します。この技術は、連続切片の時間のかかる分析を必要とすることなく、心臓全体にわたって血管の可視化を可能にします。...

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。...

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光...

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

この方法では胚の心臓組織は外科的 microdissected、解離、蛍光標識、そして宿主胚性組織に注入です。これは個人または組織レベル発達組織下異所性血行力学的条件、および/またはパラクリン/juxtacrine...

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent...

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。...

マウス胎児の構造的心臓欠損を特徴付けるパイプライン

学ぶ マウス胚の心内膜クッション作製法。エンフェイスイメージングを用いて平面細胞極性と細胞動態を解析し、心臓弁形成における内皮細胞の挙動を明らかにする新規アプローチです。

エンフェイスマウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

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