細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム
March 17th, 2023
この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。
EVの複雑な性質は、関心のある亜集団を認識することを困難にし、このプロトコルは、表現型、サイズプロファイル、およびナノ機械的特性でそれらを検出できます。この手法の組み合わせはラベルフリーの方法であり、病態媒体と血漿からEVをリアルタイムで検出することができます。この技術は、病理学の生物学的指標として使用するために、または薬物送達のためのナノ粒子としても使用するために、関心のあるナノ粒子の深いサブセットを特徴付けることを可能にする。
これは非常に敏感な方法であるため、目的のサンプルを注入する前にバイオチップの準備に注意を払うことが不可欠です。チップをコーティングして機能化した後、200ミリモルのエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド/N-ヒドロキシスクシンイミドと50ミリモル/リットルのN-ヒドロキシスクシンイミドの混合物中で、室温の暗所で少なくとも30分間、バイオチップをインキュベートします。スポッターを使用して、300ナノリットルのリガンド溶液を加え、バイオチップをソニックバス下で30分間インキュベートします。
バイオチップを上から超純水で洗い流します。プリズムと同じ屈折率の油滴を加えて、バイオチップとプリズムの間に均一な薄層を作り、バイオチップと同じ屈折率のプリズムにそっと置きます。表面プラズモン共鳴イメージングの場合は、バイオチップをSPRiシステムにマウントします。
ソフトウェアの左側にあるドロップダウンメニューに移動し、作業ディレクトリをクリックします。さまざまなスポットが表示されている画像を見つけ、クリックしてこの画像を選択します。次に、リガンドファミリーの名前を書き、Finish種の定義をクリックします。
カーソルで黒い線を最適な作業角度にドラッグします。[ミラーを作業角度に移動]をクリックし、作業角度を選択します。次に、キネティクスをクリックします。
ネガティブコントロールの定義を求めるメッセージが表示されたら、この時点でネガティブコントロールなしを選択します。ラット血清アルブミンを毎分50マイクロリットルで4分間注射します。エタノールアミンを毎分20マイクロリットルで10分間注入して、表面にまだ存在し反応性のあるカルボキシ基を不活性化します。
その後、40ミリモルOGを毎分50マイクロリットルで4分間注入してバイオチップを洗浄します。細胞外小胞を特定の濃度で生体機能化チップに注入し、異なるスポットでの小胞の相互作用の動態を同時に追跡します。反射率の値と相互作用のレベルも決定します。
安定したら、チップにグルタルアルデヒドを注入して、AFMイメージングを行う前に細胞外小胞を元の場所に固定します。スライドガラスのマスクの上部にバイオチップを合わせます。AFMの上部にあるCCDカメラを使用して、スキャンする必要のある正しい場所にカンチレバーの位置を特定します。
AFM取得を、3〜5つの大きな領域から小さな領域への接触モードで開始します。次に、最初に高さチャンネルを選択して、JPKデータ処理ソフトウェアでAFM画像を処理します。各線から減算する多項式フィットを選択して、直線化されたスキャン線を取得します。
金粒の高さのしきい値を選択して、表面の粗さを排除します。穀物抽出モジュールは、8.5ナノメートルの高さしきい値を使用して粒子をマークします。多重化されたバイオチップをアルブミンパッシベーション後に分析した。
デフォルトのないチップ。スポットの融合、弱いグラフト、または気泡または汚染物質によるいくつかの欠陥のあるチップ。そして、金への細胞外小胞の吸着を調べるためのマイクロアレイのない裸の金チップが示されている。
マルチプレックスバイオチップでのキャプチャ実験では、ネガティブコントロールの応答が無視できるため、異なるリガンドに対して良好な反射率信号が示され、異なるリガンドに対して良好な信号対雑音比が示されました。細胞外ベシクル試料注入後の細胞外ベシクル吸着は高い反射率シグナルを示し、これらのベシクルが金チップ上で吸着して安定に保たれていることが示唆された。細胞外小胞ローディング後、バイオチップ上の細胞外小胞の大規模および小規模AFM画像が生成された。
高解像度のより詳細なビューにより、細胞外小胞の計測が可能になります。バイオチップ上の細胞外小胞の有効直径は30〜300ナノメートルの範囲であり、大部分は約60ナノメートルであった。空気と液体で得られた結果は同等でした。
裸のチップに吸着した細胞外小胞のラマンスペクトルは、細胞外小胞膜の脂質に関連するメチレン振動に主に対応するピークを持つ明確なスペクトルを明らかにしました。EVを正確かつ再現性のある方法で検出できるようにするには、バイオチップを厳密に準備することが重要です。ウェスタンブロッティングやナノ粒子追跡分析などの従来の方法を使用して、表現型とサイズパターンを相関させて確認することができます。
さらに、マルチオミクス解析は、EV分子の特性評価と潜在的なサブセット識別をさらに深く掘り下げることが想定されています。
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概要
この研究は、細胞外小胞（EV）サブセットを高スループットで特徴付けるための新しい多重分析プラットフォームを提示します。このプラットフォームは、多重生体センシング法、原子間力顕微鏡、ラマン分光法を組み合わせ、EVのフェノタイプ、サイズプロファイル、ナノメカニカル特性をリアルタイムで分析します。
主要な研究要素
研究分野
- 細胞外小胞の特徴付け
- 多重分析技術
- 生体センシング法
背景
- EVの複雑さにより、サブポピュレーションの同定が困難です。
- 病理学と薬物送達のバイオマーカーとしてのEVの重要性。
- 様々な生物学的サンプルにおける感度の高い検出方法の必要性。
使用された方法
- 多重生体センシング、原子間力顕微鏡、ラマン分光法を組み合わせます。
- EVをリアルタイムで検出するための生体機能化マイクロアレイを利用します。
- EVの特徴付けへの干渉を最小限に抑えるためのラベルフリーアプローチを採用します。
主要な結果
- この技術は、サイズと組成に基づいたEVの効果的な検出を示します。
- 高解像度の画像は、直径30から300ナノメートルのEVを、主に約60ナノメートルであることを明らかにします。
- ラマンスペクトルは脂質膜の組成を示し、この方法の有効性を裏付けています。
結論
- この研究は、広範なEVの特徴付けのための信頼性の高い方法を成功裏に実証しました。
- この研究は、バイオマーカー研究と治療応用に重要な意味を持ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicle (EV) subsets with high specificity and throughput is a critical challenge in early biomarker discovery and therapeutic platform development. The described multimodal analytical platform integrates multiplexed biosensing, atomic force microscopy, and Raman spectroscopy to deliver quantitative, label-free phenotypic and molecular profiling of EVs. This capability enhances predictive confidence in EV-based biomarker validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic and nanomechanical profiling of EV subpopulations for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing EV subsets based on size, composition, and molecular features.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of EVs as disease-relevant bioindicators.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biochips for reproducible EV capture and analysis workflows.
- Delivers quantitative, real-time readouts of EV interactions and adsorption profiles.
- Standardizes assay conditions to enable reliable cross-sample and cross-ligand comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV subset characterization with translational biomarker strategies for disease monitoring.
- Provides continuity from discovery-stage EV profiling to preclinical validation of candidate biomarkers.
- Reduces mechanistic ambiguity in EV-based therapeutic and diagnostic development.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal platform bridges early discovery, screening, and translational research by enabling comprehensive EV subset analysis from biological fluids.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking through multiplexed, quantitative EV profiling.
- Screening: Delivers reproducible, label-free assay outputs for EV subset discrimination and ligand specificity.
- Analytics: Integrates morphomechanical and molecular readouts to inform cross-condition comparisons and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity for EV-based diagnostics.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable analytical platform for diverse EV research and development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker and therapeutic candidate selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in EV analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in EV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed biosensing, AFM, and Raman spectroscopy for optimal platform operation.
- Demands rigorous biochip preparation and functionalization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Needs access to advanced instrumentation and analytical infrastructure for high-resolution EV characterization.
- Benefits from cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different biological matrices or EV sources as supported by the platform's flexibility.
