Name: 細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学ぶ細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム。ラベルフリーでリアルタイム検出し、AFMとラマン分光を組み合わせて表現型、サイズプロファイル、ナノメカニカル特性を評価します。

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IVEThコア施設(パリ)のケリー・オベルタンとファビアン・ピコは、ラマンイメージング実験で認められています。Thierry Burnouf(台北医科大学、台湾)とZuzana Krupova(フランス、ヘリンクール出身)は、それぞれ血小板と牛乳のサンプルに由来するEVサンプルを提供したことで認められています。この作業は、ブルゴーニュフランシュコンテ地域とEUR EIPHI大学院(BEGINNERプロジェクト、2021-2024)によってサポートされました。この作業の一部は、CLIPPプラットフォームとFEMTO-ENGINEERINGのRENATECHクリーンルーム施設を使用して行われ、Rabah Zeggariに感謝します。

<ol><li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products%3A+A+position+paper+of+the+group+%26%2334%3BExtracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).</li>
<li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li>
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<li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).</li>
<li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Definition%2C+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Medecine+Sciences%3A+M%2FS%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li>
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<li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM%2C+SEM+and+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li>
<li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603(2021).</li>
<li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion%3A+A+tool+to+improve+transfusion+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).</li>
<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+%C2%ABon-chip%C2%BB+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li>
<li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li>
<li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).</li>
<li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM%3A+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).</li>
<li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicle+%28EV%29+Array%3A+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).</li>
<li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+%28SUPRA-MS%29%3A+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li>
<li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+lipids%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li>
<li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li>
<li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246(2016).</li>
<li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

最近最も広く使用されているEV同定法は、EVの起源を確認するためのタンパク質特異的イムノブロッティング、その構造を確認するためのTEM、およびサンプル量中の数とサイズ分布を定量するNTAです3。それにもかかわらず、(生物)医学研究におけるEVへの高い関心と既存の分析ツールの限界により、科学界はEVの特性評価、識別、および定量化のための新しい方法を開発するようになりました。
ほとんどの開発は、免疫標識または免疫捕捉の原理をEV検出のための高度な物理的方法と組み合わせることに焦点を当てています。これらのアプローチのいくつかは、ナノオブジェクトスケールで最大限に信頼性の高いデータを取得するために、個々のEVの識別に焦点を当てています。他の人は、臨床使用のために手頃な価格で信頼できるグローバルな方法を提案することにもっと関心を持っています。
多重化された金基板上のEVのバイオ検出とAFM特性評価を組み合わせたNBAプラットフォームは、複雑な生体液中に存在するナノベシクルの深い認定を可能に...

診断および治療におけるEV研究への関心の高まり1,2,3,4,5は、この分野が直面する課題と相まって、これらの小胞を定量化または特徴付けるための多種多様なアプローチと技術の開発と実装をもたらしました。EVの同定に最も広く使用されている方法は、EVの起源を確認するためのタンパク質特異的イムノブロッティングとプロテオミクス、その構造を確認するための透過型電子顕微鏡(TEM)、およびサンプルボリューム中のそれらの数とサイズ分布を定量化するナノ粒子追跡分析(NTA)です。
ただし、これらの手法だけでは、EVサブセットの特性評価に必要なすべての情報を提供するものではありません。生化学的および物理的特性の多様性によるEVの固有の不均一性は、特に混合物(粗サンプル)に含まれるEVの場合、信頼性が高く再現性のあるグローバルな分析を妨げます。したがって、検出および特性評価の方法は、EVに個別にも一般的にも、より高速であるが選択的ではない他の方法を補完するために必要です6。
TEM(またはクライオTEM)またはAFMによる高解像度イメージングにより、ナノメートル分解能7,8,9,10,11,12でEVの形態と計測を決定できます。ただし、EVなどの生物学的物体に電子顕微鏡を使用することの主な制限は、サンプルの固定と脱水を必要とする研究を実行するための真空の必要性です。このような調製は、観察された構造から溶液中のEV形態に変換することを困難にします。サンプルのこの脱水を避けるために、クライオTEMの技術はEVの特性評価に最も適しています13。EVの微細構造を決定するために広く使用されています。生体機能化金ナノ粒子による小胞の免疫標識は、EVの特定の亜集団を同定し、複雑な生物学的サンプル中に存在する他の粒子と区別することも可能にします。しかし、電子顕微鏡で分析するEVの数が少ないため、複雑で不均一なサンプルを代表する特性評価を行うことはしばしば困難です。
このサイズの不均一性を明らかにするために、国際細胞外小胞学会(ISEV)は、高解像度の個々のEVを明らかにするために、十分な数の広視野画像を分析して、より小さな画像を伴うことを提案しています14。AFMは、EVの研究のための光学的アプローチと電子回折技術の代替手段です。この手法では、柔軟なカンチレバーによって保持される鋭い先端を使用して、1つの支持体に堆積したサンプルを1行ずつスキャンし、先端とフィードバックループを介して存在する要素との間の距離を調整します。これにより、試料のトポグラフィーを特徴付け、形態力学情報を収集することができる15、16、17、18。EVは、原子レベルで平坦な基板上に堆積した後、または抗体、ペプチド、またはアプタマーによって機能化された特定の基板上に捕捉された後のいずれかでAFMによってスキャンされ、様々な亜集団を特徴付けることができる18,19。AFMは、前処理、標識、脱水を必要とせずに、複雑な生物学的サンプル内のEVの構造、生体力学、および膜状の生体分子含有量を定量し、同時にプローブできるため、温度と媒体の生理学的条件下でEVを細かくマルチパラメトリックに特性評価するためにますます使用されています。
本論文では、多重化されたフォーマットで(バイオ)化学的に機能化できるコア金バイオチップを使用する方法論を提案します。この基板は、表面プラズモン共鳴によるEVサブセットのバイオ検出を組み合わせた強力な分析プラットフォームの基礎であり、EVがチップに吸着/グラフトまたは免疫捕捉されると、AFMはEVの計測学的および形態機械的特性評価を可能にします。チップ上に取り込まれたEVサブセットのラマンシグネチャと組み合わせることで、この分析プラットフォームは、分析前のステップを必要とせずに、ラベルフリーの方法で生物学的サンプルに存在するEVの認定を可能にします。この論文は、基板調製とデータ収集における非常に厳密な方法論に支えられた強力な技術の組み合わせにより、EV分析が深く、決定的で、堅牢になることを示しています。
提案されたアプローチの原理は、金基質を準備し、EVサブタイプを吸着/グラフトまたは捕捉し、それらをAFMでスキャンして、各EVサブセットのサイズと形態を推定することです。さらに、吸着されたEVはラマン分光法によって分析されます。実際、この基板は、複雑化する3種類の界面、すなわち裸、化学的に機能化された、またはリガンドマイクロアレイを提示することができる。プロトコルのさまざまなステップを説明する前に、読者は、表面プラズモン共鳴画像法(SPRi)、AFM、および分光法を組み合わせた、 図1のナノバイオ分析プラットフォーム(NBA)アプローチの概略図を参照します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg"> 図1:ナノバイオアナリシスプラットフォーム。このアプローチは、(A)表面プラズモン共鳴イメージング、(B)原子間力顕微鏡、および赤外線/ラマン(ナノ)分光法を組み合わせており、すべて同じ基板(マルチプレックス金チップ)にかみ合っています。略語: NBA = ナノバイオ分析プラットフォーム;SPRi =表面プラズモン共鳴イメージング;AFM = 原子間力顕微鏡;EV =細胞外小胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
コアゴールドバイオチップは、すべてのラベルフリーの特性評価技術がこのバイオチップで実施されるため、プラットフォームの心臓部を構成します。EVの特性評価(グローバル/トータルEVまたはEVサブセットのいずれか)のニーズと使用される方法の制限/要求に応じて、3種類の金バイオチップ表面が開発されました:「裸」の化学的に機能化された「C11 / C16」、または「リガンド」金表面と呼ばれるリガンド生体機能化のいずれか。
「ネイキッド」と呼ばれるネイキッドバイオチップは、EVを金に簡単に吸着することを可能にします。使用するバッファーを選択し、受動的な方法(インキュベーションとその後のすすぎステップ)またはフロー下でのモニタリング(SPRi)のいずれかでこの吸着を実現することができます。さらに、この受動吸着は、チップ全体(マクロアレイとして)またはマイクロピペットスポッターを使用してマイクロアレイに局在化のいずれかで実現できます。「アンダーフロー手順」により、研究者はEV吸着の動態とレベルを追跡できます。裸の金基板上でのこのアプローチは、化学層界面が分析方法に干渉する可能性がある場合(例えば、ラマン分光法の場合)に採用される。
「C11/C16」と呼ばれる化学的に機能化されたバイオチップは、EVサンプルのグローバルビューを持つことを目的としている場合、チオレートと第一級アミド結合を形成することにより、金表面に共有結合したEVの高密度で堅牢な「カーペット」を作成するために使用されます。実際、この場合、金はメルカプト-1-ウンデカノール(11-MUOH:「C11」)とメルカプト-1-ヘキサデカン酸(16-MHA:「C16」)のチオレート混合物によって官能化され、チオレートの一部が化学的に活性化されてターゲットとの共有結合が確立されます。繰り返しになりますが、この戦略は、受動的(「マクロアレイ」またはマイクロピペットスポッターを使用した複数のマイクロアレイのいずれかでインキュベーションしてからすすぎのステップ)または流速下(SPRi)のいずれかで実現でき、金表面へのEVグラフトの動態とレベルを追跡します。
「リガンド」と呼ばれるリガンド 生体機能化バイオチップ は、化学的に活性化され、異なるリガンド(抗体、受容体など)を共有結合的に移植し、生物学的サンプル中に共存する異なるEVサブセットを選択的に(親和性で)捕捉します。

<table><tbody><tr><td>CD41a抗体</td><td>Diaclone SAS (France)</td><td>447528</td><td></td></tr><tr><td>CP920</td><td>Microparticles GmbH, Germany 448303</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DXR3xi&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma</td><td>A6272</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>血小板濃縮物由来の Evs</td><td>共同研究 : Pr T. Burnouf (東京都、台北市)</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>牛乳由来の Ev</td><td>共同研究 : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Σ</td><td>56845</td><td></td></tr><tr><td>グウィディオン&nbsp;</td><td></td><td>853.223.020</td><td></td></tr>マグ<tr><td>ネトロンスパッタ</td><td>リングPLASSYS</td><td>SAB5300165</td><td></td></tr><tr><td>メルカプト-1-ヘキサデカン酸</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>メルカプト-1-ウンデカノール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>マウンテンズ SPIP ones</td><td>デジタルサーフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoWizard 3 バイオサイエンス&nbsp;</td><td>ブルカーJPK&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オクチルグルコシド(OG)&nbsp;</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン抗体</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer 生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット アルブミン血清 (RSA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウムバッファー&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR-Biacore 3000</td><td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi Biochip</td><td>MIMENTO テクノロジープラットフォーム</td><td></td><td>バイオチップは、クリーンルーム、Besancon</td></tr><tr><td>SPRi Plex II</td><td>Horiba Scientificで</td>社内で製造されました。<td></td><td></td></tr><tr><td>スルホNHS</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

細胞外小胞(EV)は、直径50ナノメートルから数百ナノメートルの範囲のすべての細胞によって産生される膜由来の小さな小胞であり、細胞間コミュニケーションの手段として使用されます。それらは、さまざまな疾患の有望な診断および治療ツールとして浮上しています。サイズ、組成、内容が異なるEVを生成するために細胞が使用する2つの主要な生合成プロセスがあります。サイズ、組成、および細胞起源が非常に複雑であるため、それらの特性評価には分析技術の組み合わせが必要です。このプロジェクトには、EVの亜集団の特性評価のためのスループットが向上した新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームの開発が含まれます。この目標を達成するために、研究グループは、マイクロアレイバイオチップに閉じ込められた小胞ターゲットの原子間力顕微鏡(AFM)による計量および形態力学的分析と多重バイオセンシング法の組み合わせに基づいてEVの独自の調査を可能にする、グループが確立したナノバイオ分析プラットフォーム(NBA)から始まります。目的は、ラマン分光法による表現型および分子分析でこのEV調査を完了することでした。これらの開発により、臨床的可能性を秘めた体液中のEVサブセットを識別するためのマルチモーダルで使いやすい分析ソリューションの提案が可能になります。

リガンドグラフトに最適なpH条件の決定 バイオチップの調製に使用されるさまざまなリガンドは、pHとチオレート化学層と相互作用するそれらの可用性の関数としてテストされます(図3)。リガンドは、異なるpH値で酢酸塩バッファーで希釈され、C11C16層で化学的に機能化されたバイオチップに注入されます。溶液を表面にランダムに注入し、各リガンド注入後に界面活性剤(40 mMのOG)を注入してベースラインを回復させます。この 予備濃縮 試験により、各リガンドグラフトに最適なpHを決定することができます。 図3に示す例では、傾きとリガンドグラフトのレベルの観点から、pH6が最良のpHとして選択されました。
SPRi CCD イメージ SPRiマシンに挿入した後、バイオチップ(裸、化学的に機能化された、または提示マイクロアレイ)に登録されたSPRi CCD画像を <s...

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

EVの複雑な性質は、関心のある亜集団を認識することを困難にし、このプロトコルは、表現型、サイズプロファイル、およびナノ機械的特性でそれらを検出できます。この手法の組み合わせはラベルフリーの方法であり、病態媒体と血漿からEVをリアルタイムで検出することができます。この技術は、病理学の生物学的指標として使用するために、または薬物送達のためのナノ粒子としても使用するために、関心のあるナノ粒子の深いサブセットを特徴付けることを可能にする。これは非常に敏感な方法であるため、目的のサンプルを注入する前にバイオチップの準備に注意を払うことが不可欠です。チップをコーティングして機能化した後、200ミリモルのエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド/N-ヒドロキシスクシンイミドと50ミリモル/リットルのN-ヒドロキシスクシンイミドの混合物中で、室温の暗所で少なくとも30分間、バイオチップをインキュベートします。スポッターを使用して、300ナノリットルのリガンド溶液を加え、バイオチップをソニックバス下で30分間インキュベートします。バイオチップを上から超純水で洗い流します。プリズムと同じ屈折率の油滴を加えて、バイオチップとプリズムの間に均一な薄層を作り、バイオチップと同じ屈折率のプリズムにそっと置きます。表面プラズモン共鳴イメージングの場合は、バイオチップをSPRiシステムにマウントします。ソフトウェアの左側にあるドロップダウンメニューに移動し、作業ディレクトリをクリックします。さまざまなスポットが表示されている画像を見つけ、クリックしてこの画像を選択します。次に、リガンドファミリーの名前を書き、Finish種の定義をクリックします。カーソルで黒い線を最適な作業角度にドラッグします。[ミラーを作業角度に移動]をクリックし、作業角度を選択します。次に、キネティクスをクリックします。ネガティブコントロールの定義を求めるメッセージが表示されたら、この時点でネガティブコントロールなしを選択します。ラット血清アルブミンを毎分50マイクロリットルで4分間注射します。エタノールアミンを毎分20マイクロリットルで10分間注入して、表面にまだ存在し反応性のあるカルボキシ基を不活性化します。その後、40ミリモルOGを毎分50マイクロリットルで4分間注入してバイオチップを洗浄します。細胞外小胞を特定の濃度で生体機能化チップに注入し、異なるスポットでの小胞の相互作用の動態を同時に追跡します。反射率の値と相互作用のレベルも決定します。安定したら、チップにグルタルアルデヒドを注入して、AFMイメージングを行う前に細胞外小胞を元の場所に固定します。スライドガラスのマスクの上部にバイオチップを合わせます。AFMの上部にあるCCDカメラを使用して、スキャンする必要のある正しい場所にカンチレバーの位置を特定します。AFM取得を、3〜5つの大きな領域から小さな領域への接触モードで開始します。次に、最初に高さチャンネルを選択して、JPKデータ処理ソフトウェアでAFM画像を処理します。各線から減算する多項式フィットを選択して、直線化されたスキャン線を取得します。金粒の高さのしきい値を選択して、表面の粗さを排除します。穀物抽出モジュールは、8.5ナノメートルの高さしきい値を使用して粒子をマークします。多重化されたバイオチップをアルブミンパッシベーション後に分析した。デフォルトのないチップ。スポットの融合、弱いグラフト、または気泡または汚染物質によるいくつかの欠陥のあるチップ。そして、金への細胞外小胞の吸着を調べるためのマイクロアレイのない裸の金チップが示されている。マルチプレックスバイオチップでのキャプチャ実験では、ネガティブコントロールの応答が無視できるため、異なるリガンドに対して良好な反射率信号が示され、異なるリガンドに対して良好な信号対雑音比が示されました。細胞外ベシクル試料注入後の細胞外ベシクル吸着は高い反射率シグナルを示し、これらのベシクルが金チップ上で吸着して安定に保たれていることが示唆された。細胞外小胞ローディング後、バイオチップ上の細胞外小胞の大規模および小規模AFM画像が生成された。高解像度のより詳細なビューにより、細胞外小胞の計測が可能になります。バイオチップ上の細胞外小胞の有効直径は30〜300ナノメートルの範囲であり、大部分は約60ナノメートルであった。空気と液体で得られた結果は同等でした。裸のチップに吸着した細胞外小胞のラマンスペクトルは、細胞外小胞膜の脂質に関連するメチレン振動に主に対応するピークを持つ明確なスペクトルを明らかにしました。EVを正確かつ再現性のある方法で検出できるようにするには、バイオチップを厳密に準備することが重要です。ウェスタンブロッティングやナノ粒子追跡分析などの従来の方法を使用して、表現型とサイズパターンを相関させて確認することができます。さらに、マルチオミクス解析は、EV分子の特性評価と潜在的なサブセット識別をさらに深く掘り下げることが想定されています。

multimodal-analytical-platform-on-multiplexed-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。...

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

我々は、複数のマイクロ流体チャネル中の粒子の検出及びサイズを多重化するために、符号分割多重アクセス（CDMA）を有する抵抗パルスセンシング（RPS）を組み合わせた統合表面電極ネットワークとマイクロ流体プラットフォームを示します。...

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から細胞小胞の迅速な分離と特定のマーカーの特性の完全なワークフローを説明します。結果が発表される高レベルの再現性を示し細胞培養上清に調整することができます。...

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV...

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

疾患および悪性細胞に対するエキソソーム由来のバイオマーカーの臨床翻訳は、迅速かつ正確な定量方法の欠如によって妨げられている。このレポートは、低倍率の暗視野顕微鏡画像を使用して、少量の血清または血漿サンプル中の特定のエキソソームサブタイプを定量化することについて説明する。...

Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45...

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

ここでは、ラベルフリー表面強化ラマン分光法(SERS)を用いて個々の小さな細胞外小胞(sEV)を解析するプロトコルを提示し、低侵襲疾患の診断と治療的投与手段としてのsEVの評価を可能にします。...

個々のsEVの表面強化ラマン散乱に基づくバイオセンシングの疾患診断および治療への応用を探る

分析用超遠心器（AUC）サンプルセルは、サンプルとリファレンスバッファを保持し、実験中に、最大60,000...

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

学ぶ細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム。ラベルフリーでリアルタイム検出し、AFMとラマン分光を組み合わせて表現型、サイズプロファイル、ナノメカニカル特性を評価します。

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

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