感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離
2022年9月7日
免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)の定義された免疫細胞サブポピュレーションを分離および分析する方法について説明します。この方法を使用すると、磁気および蛍光標識された細胞を精製および分析できます。
この方法により、IM患者の同じ疾患状態にある異なる免疫細胞の特性評価が可能になり、EBV感染のメカニズムの理解が広がります。手順を実演するのは、私たちの研究室の医師であるリンリン・チャンです。まず、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで事前に分離したPBMCを取り、室温で300 Gで10分間回転させます。
上清を捨て、調製した80マイクロリットルのバッファーで細胞を再懸濁します。次に、20マイクロリットルのCD14マイクロビーズを細胞懸濁液に加え、ピペッティングによりよく混合し、氷上でチューブを15分間インキュベートする。次に、1ミリリットルのバッファーを使用してPBMCを洗浄し、室温で10分間300 Gで遠心分離します。
上清全体を廃棄し、500マイクロリットルのバッファーで細胞を再懸濁します。磁気分離の場合は、磁気ビーズセパレーターの上にカラムを置き、3ミリリットルのバッファーでカラムを洗浄してプライミングします。次に、細胞懸濁液をカラムに加えます。
それを通過させ、ラベルのない細胞を15ミリリットルの遠沈管に集めます。3ミリリットルのバッファーでカラムを3回洗浄し、15ミリリットルの遠沈管に廃液全体を回収します。次に、カラムを新しい15ミリリットルの遠沈管に入れ、5ミリリットルのバッファーをカラムに追加します。
プランジャーをカラムにしっかりと押し込み、磁気標識されたセルをチューブに洗い流します。磁気標識した細胞を300 Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、その後のトランスクリプトームシーケンシングのために細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
回収した非標識細胞を300Gで5分間遠心分離してペレット化し、1.5ミリリットルの微小遠心チューブに100マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。次に、2マイクロリットルの各標識抗体を細胞懸濁液に加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。次に、1.5ミリリットルの微小遠心チューブに100マイクロリットルのPBMC細胞懸濁液を分注し、陰性対照サンプルをCD3、CD4、CD8、およびCD19、単一染色サンプル、CD56、またはCD16染色サンプルとセットした。
次に、対応する蛍光標識抗体を2マイクロリットルずつ各チューブに加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、前述のようにすべての細胞をPBSで洗浄し、500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。セル選別システムを開き、電源オンプログラムを実行します。
次に、85マイクロメートルのノズルを取り付け、仕分けストリームを開きます。ソート電圧を4, 500ボルト、周波数を47に設定します。ブレークオフウィンドウでギャップを8に設定し、スイートスポット自動ソートモードをオンにして、液滴振幅値を自動的に決定します。
最後に、サイドストリームウィンドウで液滴遅延を30.31に調整します。前方散布図と側方散布図を使用して、ポリゴンゲートP1を描画し、無傷のリンパ球集団を特定します。次に、前方散乱領域対高さドットプロットを使用して、ポリゴンゲートP2を描画して単一セルを特定し、ダブレットを除外します。
次に、CPCY 5.5エリアドットプロットあたりのCD 19FITCエリア対CD3を使用して、長方形のゲートP3を描画して、CD3陽性T細胞、およびCD19陽性Bセルを選択します。次に、CD4APCCY7領域対CD8PE領域ドットプロットを用いて、矩形ゲートを描画し、CD4、およびCD8陽性T細胞を選択する。最後に、側方散乱領域対CD56またはCD16APC領域ドットプロットを使用して、矩形ゲートを描画して、CD56またはCD16陽性ナチュラルキラー細胞を選択する。
ネガティブコントロールチューブの場合は、取得ダッシュボードでロードをクリックし、ソフトウェアでサイトメーター設定を選択します。インスペクターウィンドウで、パラメータタブをクリックし、前方散乱、側方散乱、およびさまざまな蛍光色素の電圧を調整します。単一の染色チューブをサイトメーターにロードした後、取得ダッシュボードのロードをクリックし、補正タブをクリックして、テキストで説明されているように補正を調整します。
細胞懸濁液を穏やかにボルテックスしてから、チューブをサイトメーターにロードします。200マイクロリットルのFBSを4つの収集フローチューブに加え、チューブをボルテックスします。それらをサイトメーター収集チャンバーに入れます。
異なるタイプのセルを4つのフローチューブに別々に収集します。分離した細胞を300 Gで5分間スピンダウンし、トランスクリプトームシーケンシングのために200マイクロリットルのRNA単離試薬を細胞パレットに加えます。本研究では、異なるサンプルの末梢血由来の免疫細胞亜集団を、免疫磁気ビーズの技術と蛍光活性化細胞選別の技術を組み合わせることによって効率的に選別した。
このプロトコルで重要なのは、細胞ソーティングステップが細胞の生存率を改善するために最適化されていることです。選別された免疫細胞は、健康なエプスタインバーウイルスキャリアおよび非感染サンプルの両方と比較して、感染性単核球症患者におけるCD3、CD8陽性T細胞の割合の増加を示した。対照的に、感染性単核球症の患者では、健康なEBVキャリアおよびEBVに感染していない子供と比較して、CD3、CD4陽性T細胞、およびCD19陽性B細胞の割合の減少が観察されました。
さらに、感染性単核球症の患者では、EBVに感染していない子供と比較して、CD 56またはCD 16陽性のナチュラルキラー細胞の割合の減少が観察されました。.細胞の生存率を維持することは、その後の実験に不可欠です。選別プロセス中に細胞を氷上または冷蔵庫に保管することは、細胞の生存率にとって有益です。
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概要
本記事では、免疫磁気ビーズとフローサイトメトリー（FACS）を組み合わせて、末梢血単核細胞から特定の免疫細胞サブポピュレーションを分離・分析する方法について解説します。この手法により、磁気および蛍光で標識された細胞の精製および分析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- フローサイトメトリー
背景
- 末梢血単核細胞（PBMC）は、免疫応答の研究において極めて重要です。
- 免疫細胞のサブポピュレーションを理解することで、さまざまな疾患に関する知見を得ることができます。
- この手法を用いることで、EBV感染メカニズムをより詳細に特徴づけることが可能です。
- 特定の細胞型を単離することで、その機能や相互作用を研究する能力が向上します。
研究目的
- 定義された免疫細胞サブポピュレーションを単離および解析すること。
- 疾患における免疫応答への理解を深めること。
- PBMCを効率的に単離するための手順を実証すること。
使用した手法
- 遠心分離法を用いたPBMCの単離。
- CD14マイクロビーズを用いた単球の単離。
- 解析のためのフローサイトメトリー（FACS）による細胞分取。
- 調製したバッファーを用いた細胞の洗浄および再懸濁。
主要な結果
- 特定の免疫細胞種の分離に成功したこと。
- 個体における免疫応答の解析能力が向上したこと。
- 実験室環境における本手法の有効性を実証したこと。
- EBV感染メカニズムの研究における潜在的な応用可能性。
結論
- この手法は、免疫細胞を単離するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 免疫応答に関する研究に大きく貢献することが可能です。
- 今後の研究において、この手法を活用することで、さまざまな疾患の探索を行うことができます。
よくある質問
産業界における重要性
伝染性単核球症を発症した小児末梢血検体から免疫細胞のサブポピュレーションを精密に分離・特性解析することで、EBV免疫生物学におけるメカニズム的なリスク低減が可能になります。このワークフローは、疾患状態に関連する免疫細胞の変動を定量化することにより、ターゲットの検証と予測精度の向上を支援します。本アプローチは、免疫介在性病理における基礎生物学的な発見とトランスレーショナルリサーチの接点において、ポートフォリオ決定の根拠を強化します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- EBV感染における免疫細胞のダイナミクスを解析し、メカニズムを明確にすることを可能にします。
- B細胞、T細胞サブセット、およびNK細胞の分離とプロファイリングにより、機能的なターゲットの検証をサポートします。
- 感染症および免疫介在性疾患に関連する免疫経路の仮説について、予測的な確信を得ることを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の機能解析およびトランスクリプトームプロファイリングに向けて、高度に精製された免疫細胞集団を調製します。
- 細胞ソーティングおよび染色のプロトコルを標準化し、再現性と定量的なアウトプットを確保します。
- 疾患に関連する細胞系において、免疫調節化合物の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 免疫細胞プロファイリングを疾患関連バイオマーカーと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- EBV感染における免疫細胞の変化を臨床表現型に結びつけることで、リスク調整後の進展をサポートします。
- 前臨床モデルの選択および検証に役立つメカニズム的な知見を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この免疫細胞分離・分析法は、小児EBV感染における免疫応答の仮説駆動型解析を可能にすることで、初期発見研究とトランスレーショナルリサーチを橋渡しします。
- 探索生物学：CD4+、CD8+ T細胞、B細胞、およびNK細胞の変動を定量化し、免疫メカニズムを解明する。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物試験向けに、再現性のある高純度な細胞集団を提供する。
- 分析学：堅牢な条件比較のために、定量的なフローサイトメトリーおよびトランスクリプトームの出力を提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：免疫細胞の表現型を疾患状態に結びつけ、バイオマーカーの整合性を支援する。
- 組織的再利用：他の免疫介在性疾患モデルに適応可能な標準化されたワークフローを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 免疫標的のバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値： 標準化され、スケールアップ可能で、再現性のある免疫細胞の分離および解析を提供します。
- 戦略的価値： 免疫メカニズムを早期に明確にすることで、Go/No-Go判断を改善し、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 免疫標的および疾患モデルのリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- フローサイトメトリー、免疫磁気分離、および抗体パネル設計の専門知識が必要です。
- 高性能なサイトメーター、磁気分離装置、および解析インフラストラクチャへのアクセスが不可欠です。
- ゲーティング戦略およびコンペンセーション設定について、チーム間での標準化が必要です。
- さまざまな疾患モデルに適応可能ですが、細胞生存率やマーカー選択の最適化が必要な場合があります。
- 下流のトランスクリプトーム解析および機能解析において、細胞生存率とサンプルの取り扱いが極めて重要です。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:36
Isolation of CD14+ Monocytes from PBMCs Using CD14 Microbeads
2:38
Fluorescently Labeled Antibody Staining
3:52
Flow Cytometry Parameter Setting
4:32
Gating
6:18
Cell Sorting and Collection via Flow Cytometry
7:00
Results: Comparison of Immune Cell Subpopulations from Patients with Infectious Mononucleosis, Healthy Epstein Barr Virus Carriers, and Uninfected Samples
8:14
Conclusion
