Name: SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ外膜小胞を用いた「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームの構築法。SARS-CoV-2受容体結合ドメインの提示により抗原特異的免疫応答を向上させ、多様な抗原表示が可能な革新的なワクチン開発技術です。

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この作業は、重慶自然科学基金会の主要プログラム(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)および中国国家自然科学財団プロジェクト(第31670936号、82041045)。

1. プラスミド構築
<ol><li>SpyCatcher配列をコードするDNA(補足ファイル1)を、BamH IサイトとSal Iサイトの間のアンピシリン耐性pThioHisA-ClyAプラスミド(材料表を参照)に挿入し、以前に発表された第20相に続いてプラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。</li>
	<li>合成したSpyTag-RBD-Histag融合遺伝子(補足ファイル1)を、BamH IサイトとEcoR Iサイトの間のpcDNA3.1プラスミド( 材料表を参照)にリゲートし、以前に発表された第19報告に従ってプラスミドpcDNA3.1 RBD-STを構築しました。</li>
</ol>2. OMV-SCの準備
<ol><li>以下の手順に従ってClyA-SC変換を実行します。<ol><li>5 μLのpThioHisA ClyA-SCプラスミド溶液(50 ng/μL)を50 μLのBL21コンピテント株に加え、穏やかに吹き付け、氷上で30分間冷却します。</li>
		<li>溶液を42°Cの水浴に90秒間入れ、次に混合溶液を氷上に3分間置く。</li>
		<li>細菌懸濁液に500 μLのLB培地を加え、混合後、220 rpm、37°Cで1時間培養します。</li>
		<li>すべての形質転換をアンピシリン(100 μg/mL、 材料の表を参照)を含むLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩培養します。 注:その後の実験では、アンピシリンは培地中で同じ濃度に保たれました。そうでない場合、これは細菌のプラスミドの損失を引き起こす可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC 実動の場合は、以下のステップを実行します。<ol><li>プレートから単一コロニーを単離し(ステップ2.1.4.)、20 mLのLB(アンピシリン耐性)培地に、37°Cで220 rpmで一晩培養します。</li>
		<li>細菌溶液(ステップ2.2.1から)を2L培地に植菌し、対数増殖段階(OD600nm は0.6〜0.8の間)まで220rpm、37°Cで5時間培養する。</li>
		<li>細菌溶液の600 nmでのODが0.6〜0.8に達したら、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、 材料表を参照)を加えて細菌溶液の最終濃度を0.5 mMにし、25°Cで220 rpmで一晩培養します。</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC 精製を実行します。<ol><li>細菌溶液を7,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、100 kD限外ろ過膜または中空糸カラムを使用して濃縮します( 材料表を参照)。</li>
		<li>濃縮液を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心分離機(材料の表を参照)を使用して4°Cで2時間150,000 x gで遠心分離し、ピペットで上清を廃棄します。</li>
		<li>沈殿をPBSで再懸濁し、-80°Cで保存します。 この溶液は、-80°Cで長期安定性を維持できます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. RBD-STの準備
<ol><li>以下の手順に従ってRBD-STトランスフェクションを実行します。<ol><li>適切な真核生物発現系(例えば、HEK293F)を選択し、回収後に細胞を37°Cで130rpmで一晩培養する。</li>
		<li>20 μLのHEK293F細胞溶液を自動セルカウンター( 材料表を参照)に加え、細胞数を記録し、濃度を1 x 106 細胞/mLに調整してから、細胞を130 rpm、37°C、4時間培養します。</li>
		<li>RBD-STプラスミドを0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10 mLになるまで300 μgのプラスミドを細胞培養培地( 材料の表を参照)に加えます。10秒間振とうします。</li>
		<li>PEI(1 mg/mL、 材料表参照)をウォーターバスで65°Cに加熱し、0.7 mLのPEIと9.3 mLの細胞培養培地を混合し、10秒間間欠的に振とうします。 注意: 溶液を激しく振らないでください。そうしないと、結果として生じる気泡がトランスフェクション効率に影響を与える可能性があります。</li>
		<li>プラスミド溶液をPEI溶液に加え、混合物を断続的に10秒間振とうし、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>この混合物を280 mLの細胞培養培地に加え、37°Cで130 rpmで5日間培養します。</li>
	</ol></li>
	<li>RBD-ST精製を実行します。<ol><li>細胞を6,000 x g で25°Cで20分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を回収します。</li>
		<li>カラムに2 mLのNi-NTAアガロース( 材料表を参照)を満たし、3x PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>細胞上清にイミダゾール( 材料表参照)を加えて最終濃度を20mMにし、細胞上清を2倍負荷します。</li>
		<li>洗浄用に20 mMのイミダゾールを含むPBSを3カラム容量(CV)添加し、洗浄画分を回収します。</li>
		<li>低濃度から高濃度(例:.、0.3 M、0.4 M、0.5 M)のイミダゾールを含む3 CVのPBSでグラジエント溶出します。各濃度で2倍に溶出します。</li>
		<li>SDS-PAGE21 を使用して、異なる濃度勾配でRBD-STを特定します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. OMV-RBDバイオコンジュゲーションと精製
<ol><li>BCA法によりタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。<ol><li>標準BSAタンパク質溶液を2 mg/mLから0.0625 mg/mLに連続希釈し、精製したOMV-SCとRBD-STを10倍に希釈してから、BCA作業溶液AとB(アッセイキットに付属)を50:1(v/v)の比率で混合します。</li>
		<li>希釈したタンパク質溶液(25 μL/ウェル)を加え、BCA作業溶液(200 μL/ウェル)と混合します。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>各ウェルの562 nmにおける吸光度(OD)を測定し、標準曲線22からタンパク質濃度を算出する。</li>
	</ol></li>
	<li>以下の手順に従って、OMV-SCおよびRBD-STのバイオコンジュゲーションを実行します。<ol><li>OMV-SCとRBD-STをPBSで40:1(w / w)の比率で混合します。</li>
		<li>垂直回転させて、混合物を4°Cで15rpmで一晩ブレンドします。 注:異なる抗原は異なる比率で反応する可能性があります。抗原の特性に基づいて異なる反応比を試すことができます。</li>
	</ol></li>
	<li>反応効率を検証します。<ol><li>10 μLのOMV-SC、RBD-ST、および反応生成物を準備します(ステップ4.2)。2.5 μLの5xローディングバッファー( 材料表を参照)を加え、サンプルを100°Cで5分間加熱します。サンプルをゲル(10 μL/ウェル)にロードします。60Vで20分間電気泳動を行い、条件を120Vに1時間変更します。</li>
		<li>タンパク質をゲルからPVDFウェスタンブロッティングメンブレン( 材料の表を参照)に100 Vで70分間移します。</li>
		<li>メンブレンを5%の無脂粉ミルク/ TBSTに入れ、1時間振とうします。その後、TBSTで3回、振とうしながら1回の洗浄につき5分間洗浄します。</li>
		<li>メンブレンを0.1%His-Tag抗体/ TBST( 材料の表を参照)に入れて1時間振とうした後、振とうしながら洗浄ごとにTBSTで5分間3回洗浄します。</li>
		<li>メンブレンを0.02%抗マウスIgG1抗体(HRP)/TBST( 材料表参照)に入れて40分間振とうした後、振とうしながら1回洗浄するごとにTBSTで3回5分間洗浄します。</li>
		<li>強化された化学発光溶液( 材料の表を参照)を追加し、膜を露出させます。</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-RBDの精製を行います。<ol><li>反応したOMV-RBD溶液1 mLを10 mLに希釈し、希釈液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。</li>
		<li>ピペットを使用して上清を捨て、残渣を10 mLのPBSで懸濁します。懸濁液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。</li>
		<li>上清を捨て、残渣を1 mLのPBSで懸濁します。 注:抗原の溶解度がはるかに低い場合、サイズ排除クロマトグラフィー19によって同じ分離効果を達成することができる。</li>
	</ol></li>
</ol>5.特性評価
<ol><li>動的光散乱(DLS)を実行します。<ol><li>サンプルを100 μg/mLの濃度に希釈し、1 mLのサンプルをサンプルセルに加えます。</li>
		<li>「測定タイプ」に「サイズ」、「試料材料」に「タンパク質」、「分散剤」に「水」、「温度」に「25°C」を選択し、試料をロードして自動測定します23。</li>
	</ol></li>
	<li>透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して画像をキャプチャします。<ol><li>サンプルを100 μg/mLに希釈します。200メッシュの銅グリッドを取り、それに20μLのサンプルを加え、10分間吸収させます。</li>
		<li>ろ紙を使用して溶液を吸い取り、20 μLの3%酢酸ウラニルをサポートフィルムに加え、30秒間染色します。</li>
		<li>酢酸ウラニルを吸い取り、フィルムを室温で1時間自然乾燥させます。</li>
		<li>サンプルをTEMシステム( 材料表を参照)にロードし、80kVで画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
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<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームを作成するために、SC融合ClyAは、タンパク質発現24の利点のために組換えタンパク質生産に最も広く使用されているモデルの1つであるBL21(DE3)株で発現され、細菌増殖の過程でOMVの表面に十分なSCフラグメントが表示されます。同時に、抗原とOMVの間の化学的カップリングのためにST融合標的抗原を調製した。この実験スキームの利点と将来の適用の見通しは、主に3つの側面に反映されています。まず、異なる抗原と生体ナノ粒子の「プラグアンドディスプレイ」システムが実現されます。反応と精製のプロセスは迅速かつ簡単であり、緊急感染症やその他のシナリオのワクチンの開発に大きな利点があります。第二に、高密度抗原提示の目標を達成し、免疫原性の低い一部の抗原に対するワクチン設計方法を提供します。第三に、OMVおよびRBD(抗原タンパク質)の個々の発現は、従来の原核生物発現系が特定の補因子、分子シャペロン、および翻訳後修飾などの機能を欠いており、タンパク質の損失およびミスフォールディングにつながる可能性があるため、高い抗原活性を確保するのに有益である...

潜在的なワクチンプラットフォームとして、外膜小胞(OMV)は近年ますます注目を集めています1,2。主にグラム陰性菌3によって自然に分泌されるOMVは、通常20〜300nmのサイズの脂質二重層で構成される球状のナノスケール粒子です4。OMVには、細菌抗原や病原体関連分子パターン(PAMP)など、固形免疫増強因子として機能するさまざまな親細菌成分が含まれています5。OMVは、そのユニークな成分、自然な小胞構造、および優れた遺伝子工学修飾部位の恩恵を受けて、細菌ワクチン6、アジュバント7、癌免疫療法薬8、薬物送達ベクター9、および抗菌接着剤10を含む多くの生物医学分野で使用するために開発されてきました。
2020年以降世界中に広がったSARS-CoV-2のパンデミックは、グローバル社会に大きな打撃を与えました。スパイクタンパク質(Sタンパク質)の受容体結合ドメイン(RBD)は、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合することができ、次いで、細胞へのウイルスの侵入を媒介する11、12、13。したがって、RBDはワクチン発見の主要な標的であるように思われます14,15,16。しかし、単量体RBDは免疫原性が低く、分子量が小さいため免疫系が認識しにくいため、アジュバントが必要になることがよくあります17。
RBDの免疫原性を高めるために、多価RBDを示すOMVを構築した。RBDを表示するためにOMVを使用する既存の研究は、通常、RBDをOMVと融合させて細菌で発現させます18。しかし、RBDはウイルス由来のタンパク質であり、原核生物の発現はその活性に影響を与える可能性があります。この問題を解決するために、 化膿レンサ球菌由来のSpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系を用いて、従来の緩衝系においてOMVおよびRBDと共有結合性イソペプチドを形成した19。SCドメインは、バイオエンジニアリングされた 大腸菌による融合タンパク質としてCytolysin A(ClyA)で発現し、STはHEK293F細胞発現系を介してRBDで発現しました。OMV-SCとRBD-STを混合し、一晩インキュベートしました。超遠心またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製後、OMV-RBDが得られた。

<table><tbody><tr><td>アンピシリンナトリウム</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質定量キット</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touching Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamic Light Scattering</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ pAb から マウス IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>高速凍結遠心分離機</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag mouse mAb</td><td>細胞シグナル技術</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>サンゴン・バイオテック</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind スーパーフロー</td><td>キアゲン</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>無脂粉ミルク</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 細胞培養培地</td><td>Opm バイオサイエンス</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST プラスミド</td><td>武漢 遺伝子生物学的技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 生理食塩水</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン リニア</td><td>ポリサイエンス</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>染色済みタンパク質ラダー</td><td>サーモ</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC プラスミド</td><td>武漢 遺伝子生物技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF ウェスタンブロッティング 膜</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Quixstand ベンチトップシステム (100 kD 中空糸カラム)</td><td>GE ヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ローディングバッファー (5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (化学発光強化溶液)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>サスペンション装置</td><td>ライフテクノロジー</td><td>フラミキサー</td><td></td></tr><tr><td>透過型 電子顕微鏡</td><td>日立</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>オキソイド</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>紫外線分光光度計</td><td>日立</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>サンゴンバイオテクノロジー</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

sars-cov-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

細菌またはウイルスから得られる生体模倣ナノ粒子は、ワクチンの研究開発において大きな関心を集めている。外膜小胞(OMV)は、平均的な成長中に主にグラム陰性菌によって分泌され、ナノサイズの直径と自己アジュバント活性を持ち、ワクチンの送達に理想的である可能性があります。OMVは、タンパク質、核酸、および低分子の多面的な送達システムとして機能してきました。OMVの生物学的特性を最大限に活用するために、バイオエンジニアリングされた 大腸菌由来のOMVをキャリアとして、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)を抗原として利用して、「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームを構築しました。 化膿レンサ 球菌のスパイキャッチャー(SC)ドメインとスパイタグ(ST)ドメインをコンジュゲートOMVとRBDに適用しました。Cytolysin A(ClyA)遺伝子は、プラスミドトランスフェクション後に融合タンパク質としてSC遺伝子とともに翻訳され、OMVの表面に反応部位を残しました。従来のバッファーシステムでRBD-STを一晩混合した後、OMVとRBDの間に共有結合を形成しました。このようにして、多価表示OMVワクチンが達成された。OMVワクチンプラットフォームは、多様な抗原に置き換えることで、さまざまな不均一な抗原を効率的に表示できるため、感染症の流行を迅速に防ぐことができます。このプロトコルは、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む、OMVワクチンプラットフォームを構築するための正確な方法を説明しています。

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に示します。このプロトコルは、OMVをワクチンプラットフォームとして利用するための一般的なアプローチである可能性があります。抗原の種類に基づいて適切な発現システムを選択するだけで済みます。
図2は、実現可能なプラスミド設計スキームを示しています。SC遺伝子はフレキシブルリンカーを介してClyA遺伝子と接続され、STは精製と検証のためにHisタグ遺伝子でRBD遺伝子の5'末端に接続します。ウェスタンブロットは、OMV-SCの増加とともに反応が徐々に完了することを示した(図3A)。超遠心後、未反応のRBD-STのほとんどすべてが上清中に残存した。2回目の超遠心分離は、1回目に比べてさらなる有意な利点を提供しなかった(図3B)。
粒径の分布はDLSにより決...

本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

ナノサイエンスは、表面に抗原を表示した後、抗原特異的免疫応答を効果的に強化することができます このワクチンプラットフォームの主な利点は、プラークとディスプレイのゴーオフを達成することができます。換言すれば、プラットフォームは、この方法において様々な抗原を表示することができ、他の生物学的ナノ粒子にも適用してエンジンをナノサイズの担体に表示することができる。サイトライシンAスパイカテーテル変換を実行するには、50マイクロリットルのBL 21コンピテント株に5マイクロリットルの血漿溶液を加えることから始めます。静かに吹き、氷上で30分間冷まします。溶液を摂氏42度の水浴に90秒間置き、次に混合溶液を氷上に3分間置く。500マイクロリットルのルリアベルターニ培地を細菌懸濁液に加え、毎分220回転で摂氏37度で1時間混合培養した後。次に、アンピシリンを含む形質転換ルリア・ベルタニ寒天プレートを全てプレートし、摂氏37度で一晩培養した。OMVスパイキャッチャーの生産では、プレートから単一のコロニーを20ミリリットルのルリアベルターニ培地に分離し、摂氏37度で毎分220回転で一晩培養することから始めます。細菌溶液を2リットルの培地にインキュベートし、摂氏37度で毎分220回転で対数増殖段階に達するまで5時間培養します。イソプロピルベータD-IPTGを加えて細菌溶液の最終濃度を0.5ミリモルにし、摂氏25度で毎分220回転で一晩培養します。次に、OMVスパイキャッチャーの精製を実行します。細菌溶液を遠心分離して融合することから始めます。上清を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、中空糸カラムを使用して濃縮します。濃縮液を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心ヒューズを使用して摂氏4度で2時間、150, 000倍Gで遠心融合し、ピペットで上清を廃棄します。沈殿をPBSで再懸濁し、摂氏マイナス80度で保存します。RBD spytagトランスフェクションを実行するには、適切な真核生物発現系を選択することから始め、回収後、細胞を摂氏37度で毎分130回転で一晩培養します。20マイクロリットルのHEK 293Fセル溶液を自動セルカウンターに追加します。細胞数を記録し、濃度を1ミリリットルあたり10〜6細胞に1倍に調整する。そして、細胞を摂氏37度で毎分130回転で4時間培養します。RBDスパイタグプラスミドを0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10ミリリットルになるまで300マイクログラムのプラスミドを細胞培養培地に加えます。10秒間振とうします。PEIを水浴中で摂氏65度に加熱する。0.7ミリリットルのPEIと9.3ミリリットルの細胞培養培地を混合し、10秒間断続的に振とうします。プラスミド溶液をPEI溶液に加

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルは、組換え受容体結合ドメイン（RBD）ベースのSARSに対するサブユニットワクチンを研究するための一般的な手順を説明します。それは、293T細胞におけるRBDタンパク質のトランスフェクションと発現、RBDおよび確立されたSARSの偽ウイルス中和アッセイを用いたマウス血清の中和活性の検出によるマウスの免疫化のためのメソッドが含まれています。...

タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

このビデオでは、多価表示外膜小胞(OMV)ワクチンを生成する方法を示します。哺乳類細胞をトランスフェクションして、SpyTagおよびポリヒスチジンタグに融合したウイルス抗原を発現および分泌します。次に、これらの抗原をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)アフィニティーカラムを使用して精製します。精製された抗原は、表面結合型SpyCatcher(SC)タンパク質を発現する外膜小胞と混合されます。複数の抗原がSpyTag(ST)を介してSpyCatcherに共有結合し、抗原を表示するOMVを作り出し、多価ワクチンとして機能します。...

多価表示外膜小胞ワクチンの作製

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs...

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

ここでは、高病原性ウイルス中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群コロナのスパイク ・ プロテインを組み込む BSL 2 設定で新規のパーティクルを生成するプロトコルを提案する.これら新規粒子には、ターゲット ホストの細胞にウイルスのエントリの定量化を許可するルシフェラーゼ...

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

ここでは、ワクチン開発に使用する自己組織化タンパク質ナノ粒子(SAPN)の精製、再折りたたみ、および特性評価について詳しく説明します。...

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。...

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。...

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD...

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

私たちは、本物のウイルスを密接に模倣したSARS-CoV-2ウイルス様粒子を生成するための最適化された in vitro プロトコルを提示します。このアプローチにより、バイオセーフティレベル3の実験室を必要とすることなく、ウイルスの感染、組み立て、および出口メカニズムの調査が可能になります。...

SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

本記事では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてSARS-CoV-2疑似型粒子を生成する方法論と、それを用いたエントリー阻害剤の同定について説明しています。これらのプロトコルは、組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質と小分子化合物アルビドールという2種類のエントリー阻害剤を用いて実証されています。...

MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

学ぶ外膜小胞を用いた「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームの構築法。SARS-CoV-2受容体結合ドメインの提示により抗原特異的免疫応答を向上させ、多様な抗原表示が可能な革新的なワクチン開発技術です。

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

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