音響流体マイクロデバイスに基づく細胞・核の圧縮率測定

細胞力学は、腫瘍の転移、細胞の悪性化、および放射線感受性において重要な役割を果たします。音響流体法は、懸濁状態での高速かつ非破壊測定を実現できます。この手法は、上皮から間葉への移行における自己圧縮性の変化を反映し、循環腫瘍細胞を分離するために使用でき、癌診断への応用の見通しを示しています。

まず、直径1ミリメートルの中空針で入口ポートと出口ポート用のPDMSブロックに穴を開けて、PDMSブロックをチップにバインドします。次に、PDMSブロックとチップを裏面を上にしてプラズマクリーナーに1分間入れます。PDMSブロックの穴をチップの入口と出口に合わせた後、PDMSブロックをチップに15秒間静かに押し付けると、PDMSブロックとチップの表面の間にボンディングが発生します。

PTFEカテーテルをチップに接続するには、内径0.8ミリメートル、長さ10センチメートルのカテーテルを2枚切ります。内径0.7ミリ、長さ1.5センチ×90度のステンレス針をL字型に曲げ、カテーテルの一端に接続します。ステンレス鋼の針をPDMSブロックの穴に挿入します。

インレットには、19ゲージのディスペンシングニードルをシリンジのコネクタとしてカテーテルのもう一方の端に接続します。その後、脱イオン水を注入して、チャネル全体の気密性をテストします。圧電セラミックアセンブリの場合は、幅5ミリメートルのプレカット圧電セラミックシートを選択します。

次に、圧電セラミックの両側のワイヤを一端で溶接します。圧電セラミックの上にシアノアクリレート接着剤を一滴置き、圧電セラミックをチップの背面の中央に接着します。つまようじで接着剤を滑らかにし、余分な接着剤を取り除きます。

次に、チップをすばやく押して、約1分間押し続けます。マイクロデバイスを取り付けるには、PDMSをマイクロデバイスのベースとして切り取り、ベースの片側を入口と出口のPDMSブロックに貼り付け、反対側を両面テープを使用して透明なスライドガラスに貼り付けます。マイクロデバイス全体を顕微鏡ステージに固定して、チップを1つの焦点面に保ちます。

ポリスチレン標準粒子溶液を調製するには、0.05ミリリットルのポリスチレン粒子溶液を10ミリリットルのPBSに加え、よく混合します。次に、接着細胞をPBSで90%コンフルエントで洗浄することにより細胞懸濁液を調製します。500マイクロリットルの0.25トリプシンを室温で1〜2分間加えます。

トリプシンを除去した後、1ミリリットルの完全培地を添加し、ピペッティングによって細胞懸濁液を形成する。次に細胞懸濁液を100Gで5分間遠心分離する。上清を除去し、細胞懸濁液を得るために0.5〜1ミリリットルのPBSに再懸濁する。

次に細胞を血球計算盤で計数し、濃度はミリリットルあたり約300〜500, 000細胞でした。前に示したように細胞核懸濁液を調製した後、上清を除去し、細胞パレット20マイクロリットルあたり200マイクロリットルの細胞質タンパク質抽出試薬Aを添加し、よく混合する。次に、上記の混合物を220Gで5秒間ボルテックスし、氷浴に10分間置きます。

次に、インキュベーション後に10マイクロリットルの細胞質タンパク質抽出試薬Bを溶液に加える。ボルテックス後、氷浴に1分間置き、再び220 Gで5秒間ボルテックスします。その後、最後に摂氏4度で5分間1000Gで遠心分離する。

上清を取り除き、パレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、摂氏4度で1000 Gで4分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞核懸濁液として100マイクロリットルのPBSに再懸濁する。

上記の細胞核懸濁液にトリパンブルーを加え、室温で4分間染色する。次に、倒立顕微鏡下で10倍の対物レンズで核の数を数えます。上記の細胞核懸濁液をPBS緩衝液でミリリットル当たり200〜300, 000核の濃度に希釈する。

次に、細胞核懸濁液を70マイクロメートルのふるいを通してろ過します。測定システムを設定するには、顕微鏡の光源をオンにして、カメラソフトウェアを開きます。4倍対物レンズを使用して、マイクロチャネルの中央位置、つまり圧電セラミックの位置を見つけます。

ワイヤを接続した後、圧電セラミックの信号発生器出力のプラス端子とマイナス端子にそれぞれ溶接します。次に、シリンジをマイクロインジェクションポンプに置き、インレットカテーテルに接続します。マイクロチャネルから液体を収集するには、出口カテーテルの端に小さな容器を置きます。

測定パラメータを決定するには、シリンジでポリスチレン粒子溶液を吸引します。次に、気泡を避けながらチップマイクロチャネルに溶液を注入し、チップマイクロチャネルに注入して正確な測定を保証します。粒子がマイクロチャネルの正中線に向かって移動し、正中線に到達した後も正中線に沿って前進し続けることが観察されるまで、信号発生器の出力を1メガヘルツの周波数と10ボルトのピークtoピーク電圧の符号信号に設定します。

1ミリリットルの細胞または核懸濁液を標準粒子溶液と1対1の比率で混合した後、注射器でマイクロチャネルに注入し、細胞および核を測定します。細胞または核が視野に入ったらCCDカメラで記録を開始し、信号発生器をオンにします。次に、マイクロチャネルを脱イオン水、75%アルコール、脱イオン水で順番にすすぎ、後で使用する。

細胞および粒子の動きは、異なる時間間隔でマイクロチャネルの正中線に向かう音場力の作用下で観察された。エネルギー、密度、セル圧縮率の計算を行い、最良のフィッティング結果から粒子の音響エネルギー密度と測定された運動軌跡を求めた。細胞および核から高純度かつ無傷の核を単離し、核の運動軌跡を得ることによって核圧縮率測定を達成した。

異なる線量で薬物誘発EMTまたはX線照射後の異なる種類の癌細胞および細胞の圧縮率を測定し、比較した。測定した細胞を回収したところ、培養48時間後の無処理群と比較して細胞増殖率や生存率に有意差はないことがわかった。圧縮率測定が細胞の増殖および生存に影響を及ぼさないことを示す。

最も重要なことは、粒子がマイクロチャネルの正中線に向かって移動するのが観察されるまで、信号の周波数を微調整することです。