Name: 線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ、エキソヌクレアーゼV欠損株を用いた無細胞タンパク質合成法。線状DNAテンプレートを直接使用し、クローニングを省略して迅速なプロトタイピングを実現します。E. coli BL21 Rosetta2抽出物の調製とバッファー最適化の手順を解説します。

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ここでは、recBまたはrecBCDオペロンのいずれかのゲノムノックアウトを有する大腸菌BL21 Rosetta2から調製された細胞ライセートが、線状DNAテンプレートからの高タンパク質発現をサポートすることを示します。このプロトコルは、線状DNAテンプレートに特異的な段階的なライセートキャリブレーション手順を詳しく説明しており(図2)、これは直鎖DNA中のσ70プロモーターからの高発現をもたらし、等モルDNA濃度のプラスミドレベルに近いレベルに達する重要なステップです。このプロトコルは、最終アプリケーションで使用するDNA(直鎖状またはプラスミド)の種類に応じたバッファーキャリブレーションの重要性を強調しています。
このプロトコルは、プラスミドクローニングを回避するのに役立ち、時間とコストを大幅に向上させます。線状DNA断片は、市販のプロバイダーによって合成され、および/または実験室でのPCRによって増幅され得る。プラスミドDNAを使用した同じプロセスは、クローニング...

無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、バイオセンサーエンジニアリング、分散型製造、および遺伝子回路のプロトタイピングのための高速、簡単、効率的な方法としてますます使用されています1。その大きな可能性から、CFPSシステムは合成生物学の分野で定期的に使用されています。しかし、これまでのところ、CFPSシステムは環状プラスミドに依存しているため、技術がその潜在能力を最大限に発揮できない可能性があります。プラスミドDNAの調製は、クローニング中の多くの時間のかかるステップと大量のDNA単離に依存します。一方、プラスミドまたは合成されたDNAテンプレートからのPCR増幅は、数時間以内にCFPSテンプレートを調製するために使用できます2,3。したがって、線状DNAの適用は、CFPSの有望なソリューションを提供します。しかし、直鎖状DNAは、細胞抽出物4に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。λファージGamSタンパク質5またはカイサイト6を含むDNAを保護剤として使用したり、その末端2,7,8,9の化学修飾によって直鎖状DNAを直接保護したりするなど、この問題に対処する解決策があります。これらの方法はすべて、細胞抽出物への補給を必要とし、それは費用と時間がかかります。エキソヌクレアーゼV複合体(RecBCD)が細胞ライセート中の直鎖状DNAを分解することは長い間知られていました4。最近、私たちは、直鎖状DNAが、エキソヌクレアーゼ遺伝子(recBCD)のためにノックアウトされた細胞からのライセートではるかによく保護できることを示しました10。
このプロトコルでは、超音波処理溶解による大腸菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD株からの無細胞溶解物を調製するためのステップが詳細に説明される。超音波処理溶解は、いくつかのラボ11,12で採用されている一般的で手頃な技術です。この株から製造された抽出物は、線状DNAテンプレートからの発現をサポートするために、余分な成分やDNAテンプレートの修飾を追加する必要はありません。この方法は、天然大腸菌プロモーターからの線形DNA発現に特化した細胞抽出物のバッファー最適化という必須ステップに依存しています。直鎖状DNA発現のためのこの特定のバッファー最適化は、ネイティブσ70プロモーターがPCR産物の精製を回避しても、GamSタンパク質またはChi DNA補給なしで高タンパク質生産をもたらすための鍵であることが示されています10。直鎖状DNA発現のためのMg-gluの最適濃度は、プラスミドDNAのそれと同様であることがわかった。しかしながら、K−gluの最適濃度は、おそらく転写関連のメカニズムに起因する直鎖状DNAとプラスミドDNAの間に実質的な差を示した10。この方法を用いて発現されるタンパク質の機能性は、トーホールドスイッチの迅速なスクリーニングや酵素変異体の活性評価など、いくつかの用途で実証されています10。
このプロトコルは、変異型ΔrecBCD細胞抽出物と直鎖DNAの特異的キャリブレーションをテンプレートとして使用するだけで、大腸菌細胞フリーシステムで線状DNAテンプレートを使用するためのシンプルで効率的かつ費用対効果の高いソリューションを提供します。

<table><tbody><tr><td>2-YT Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Safe-Lock チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL マイクロチューブ</td></tr><tr><td>384 ウェル角底マイクロプレート</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>粘着プレートシール</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td></td><td>Agar Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine 5'-triphosphate 二ナトリウム塩水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta;recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta;recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (アデノシン 3' 5'-環状一リン酸)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (コエンザイム A 水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP 遠心分離チューブ、CentriStar キャップ付きラック、滅菌</td><td>済み Corning</td><td>430790</td><td>15 mL チューブ</td></tr><tr><td>Corning 50 mL PP 遠心分離チューブ、CentriStar キャップ付き円錐底、滅菌</td><td>済み Corning</td><td>430828</td><td>50 mL チューブ</td></tr><tr><td>CTP (シチジン 5'-三リン酸、二ナトリウム塩)水和物)</td><td>アルファ・アエサル</td><td>&nbsp;J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT(DL-ジチオスレイトール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸(固体フォリン酸カルシウム塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP(グアノシン5?-三リン酸、&nbsp;二ナトリウム塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kリン酸二塩基性(K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>Kリン酸一塩基性(H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-グルタミン酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-グルタミン酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP シリンジフィルターユニット、0.22 &micro;m、ポリエーテルスルホン</td><td>メルクミリポア</td><td>SLGP033RB</td><td>メンブレンフィルター0.22&micro;m</td></tr><tr><td>モナークPCR &DNAクリーンアップキット</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR &DNAクリーンアップキット</td></tr><tr><td>モナーク プラスミド ミニプレップキット</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>プラスミド ミニプレップキット</td></tr><tr><td>NAD(B-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NISTトレーサブルFITC標準</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxiキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>プラスミドMaxiprepキット</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>精製組換え EGFP タンパク質</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>組換え eGFP</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>DNA DNA Drawing Assay with DNA-binding dye</td></tr><tr><td>RTSアミノ酸サンプラー</td><td>バイオテクラビット</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td>ミリポアRiOs 8システムからの精製水で、オートクレーブ滅菌済みです。</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>ライフサイエンス製品 Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>ロシュ10109550001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波プロセッサVibra細胞VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>ソニケー</td></tr><tr><td>ターUTP Na3(ウリジン5'-三リン酸、三ナトリウム塩水和物)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>水、ヌクレアーゼフリー</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>ヌクレアーゼフリー水</td></tr></tbody></table>

線状dnaテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、その多くの利点のために、合成生物学の分野で最近非常に人気が高まっています。CFPSにリニアDNAテンプレートを使用すると、クローニング、形質転換、プラスミド抽出のステップを排除することで実験時間を短縮し、技術の可能性を最大限に引き出すことができます。直鎖状DNAはPCRによって迅速かつ容易に増幅して高濃度の鋳型を得ることができ、 潜在的なin vivo 発現毒性を回避します。しかしながら、線状DNAテンプレートは、細胞抽出物中に天然に存在するエキソヌクレアーゼによって急速に分解される。この問題に取り組むために、ヌクレアーゼ阻害剤の追加や、保護のための直鎖状DNA末端の化学修飾など、いくつかの戦略が提案されています。これらの戦略はすべて、余分な時間とリソースを要し、プラスミドに近いレベルのタンパク質発現をまだ取得していません。CFPSに線状DNAテンプレートを使用するための代替戦略の詳細なプロトコルをここに示します。エキソヌクレアーゼ欠損ノックアウト細胞からの細胞抽出物を使用することにより、線状DNAテンプレートは末端修飾を必要とせずにそのまま残ります。我々は、特に直鎖DNAのためのMg-グルタミン酸(Mg-glu)およびK-グルタミン酸(K-glu)のための超音波処理溶解および緩衝液較正による大腸 菌BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 株からの細胞ライセートの調製ステップを提示する。この方法は、 大腸菌 CFPSのプラスミドDNAから得られるタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルを達成することができる。

代表的な結果は、直鎖DNAとプラスミドDNAについて別々に最適なMg-グルタミン酸レベルとK-グルタミン酸レベルについてライセートを校正した後のここに示されています(図1)。Mg-グルタミン酸の最適濃度は、8 mMのΔrecB およびΔrecBCD 抽出物全体で類似しています(図1B)。ただし、プラスミドDNAの最適なK-グルタミン酸濃度は140 mMですが、同じ抽出物の直鎖状DNAの最適なK-グルタミン酸濃度は20 mMです(図1C)。WTおよびΔrecBCD 細胞からの抽出物におけるGFP発現の比較分析では、エキソヌクレアーゼV欠失抽出物に使用される直鎖DNAおよびプラスミドDNAからの最適な発現のために、抽出物のバッファー組成を特異的に較正する必要があることがわかりました。
較正ステップの後、WTおよびΔrecBCD抽出物中の直...

ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21 Rosetta2のエキソヌクレアーゼVノックアウト株からの細胞抽出物(ΔrecBCDおよびΔrecB)の調製およびバッファー較正のためのプロトコルである。これは、線形DNAテンプレートを使用した無細胞タンパク質合成システムで発現するための迅速、簡単、かつ直接的なアプローチです。

線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

このプロトコルは、ネイティブの大腸菌パラメータからでも、無細胞タンパク質合成システムで線形DNAテンプレートを迅速、簡単、直接使用できるため、非常に重要です。主な利点は、クローニング、線状DNA末端の化学修飾、ガンマやカイDNAなどの保護サプリメントを避けることで時間を節約できることです。関心のあるさまざまな生物の自己報告合成抽出物が開発されているため、私たちの方法は、線状DNAを使用してそれらの抽出物のプロトタイピングをスピードアップする方法を提示します。まず、摂氏マイナス80度のグリセロールストックから、1ミリリットルのクロラムフェニコールあたり10マイクログラムを含む2x YTP寒天プレートにストリーク株BL21ロゼッタ-2デルタrecBCDをストリークし、摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、寒天プレートから1ミリリットルあたり10マイクログラムのクロラムフェニコールを添加した40ミリリットル強の2x YTPに単一のコロニーを接種し、摂氏37度で200RPMを振とうしながら一晩インキュベートします。次に、一晩培養液を100倍に希釈して、クロラムフェニコールあたり10マイクログラムを含む新鮮な2x YTP培地4リットルに希釈して継代培養を行います。4リットルの培地を4つの別々のフラスコに分けます。摂氏37度、200 RPMで約3〜4時間の成長でインキュベートし、1.5〜2.0の光学密度に達します。培養液を氷上に置き、摂氏4度で12分間5, 000 Gで細胞を回転させ、デカントして上清を捨てます。次いで、細胞ペレットをDTTと共に800ミリリットルのチルドS30Aに再懸濁する。繰り返しますが、前に示したように、摂氏4度で12分間5, 000 Gで細胞をスピンダウンし、デカントによって上清を廃棄します。細胞ペレットをDTTで160ミリリットルのチルドS30Aに再懸濁した後、細胞をチルドして事前に計量した50ミリリットルのチューブに移します。細胞を摂氏4度で8分間2000Gでスピンダウンし、デカンテーションによって上清を廃棄します。再度、摂氏4度で2000 Gで4分間細胞をスピンダウンし、ピペットを使用して残りの上清を注意深く取り除きます。次に、チューブの重量を再測定してセルペレットの重量を計算し、セルペレットを摂氏マイナス80度に保ちます。細胞ペレットを摂氏マイナス80度から採取した後、氷上で1〜2時間解凍し、細胞ペレットの重量1グラムあたりDTTバッファーを含む0.9ミリリットルのS30Aに細胞ペレットを再懸濁します。その後、ゆっくりとピペットで細胞を再懸濁し、上部の泡をできるだけ避けます。再懸濁した細胞の1ミリリットルのアリコートを1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れ、氷上または摂氏4度で事前に冷やしたコールドブロックに保ちます。次に、3サイクルで20%振幅のセットアップで超音波処理器で各チューブを超音波処理し、摂氏4度で10分間12, 000Gでライセートをスピンダウンします。ピペットで上清を回収した後、50ミリリットルのチューブに移します。細胞ライセートを摂氏37度、200 RPM攪拌で80分間インキュベートします。ライセートをスピンダウンし、上清をプレチルド1.5ミリリットルのマイクロチューブに回収した後、すべてのチューブを氷上に保ちながら、プレチルドPCR8ストリップチューブに30マイクロリットルを分注します。ライセートのアリコートをドライアイスで瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保管します。原稿に記載されているバッファー調製タブに従ってマスターミックスを準備します。反応容量が10.5マイクロリットルの場合は、1.05マイクロリットルの異なるMg-グルタミン酸ストック濃度と9.45マイクロリットルのマスターミックスを加え、穏やかに混合します。上記の反応物10マイクロリットルを384ウェル角底マイクロプレートにピペットし、粘着プレートシールを用いて蓋をする。プレートリーダーで蛍光データを一定間隔で記録し、摂氏30度で8時間インキュベートし、毎分307サイクルで連続的に軌道振とうすることにより、遺伝子発現を蛍光出力として測定します。終点で最も高い蛍光値をもたらすMg-グルタミン酸濃度を特定した後、K-グルタミン酸キャリブレーションに進みます。実験を実行し、テストしたK-グルタミン酸濃度の中から最高の蛍光値を特定し、このライセートのMg-グルタミン酸およびK-グルタミン酸に最適なバッファー組成を特定します。Mg-グルタミン酸およびK-グルタミン酸の値が確立されたら、得られたバッチ量に従って最適化されたバッファー組成のストックチューブを調製する。必要なバッファーチューブの数を計算した後、チューブあたり38マイクロリットルを分注し、摂氏マイナス80度で保管します。まず、最適なマスターミックス調製のために1.5ミリリットルのマイクロチューブにラベルを付けます。適切な量のバッファーとライセートを加え、穏やかに混合します。次に、最初にDNAサンプルをピペットでピペットし、次にヌクレアーゼフリーの水をピペットで、最後に最適なマスターミックスを行います。プレートリーダーに加える直前に、無細胞反応をピペットで穏やかに混合し、気泡を避けます。プレートリーダーで反応を設定した後、キネティックランは、毎分307サイクルで連続軌道振とうしながら、摂氏30度で8時間のインキュベーションのために一定の間隔で蛍光データを記録しました。ライセートのキャリブレーション後、Mg-グルタミン酸の最適濃度は、直鎖DNAとプラスミドDNAの両方の抽出物全体で8ミリモルで類似していました。ただし、プラスミドDNAの最適なK-グルタミン酸濃度は140ミリモルですが、直鎖状DNAの最適なK-グルタミン酸濃度は20ミリモルです。キャリブレーションステップの後、野生型、デルタrecB、およびデルタrecBCD抽出物の直鎖DNAとプラスミドDNAの間でGFP発現のレベルを比較しました。直鎖状DNAからのGFP発現は、デルタrecBおよびデルタrecBCD株からの抽出物におけるプラスミドDNAからの発現のそれぞれ102%および138%に達した。プロトコルで最も重要なことは、細胞の超音波処理溶解と、特にネイティブパラメータを使用する場合、線状DNAとプラスミドDNAのバッファーキャリブレーションステップを別々に行うことです。この技術は、バイオセンサー、酵素、経路のスクリーニング、合成遺伝子回路のプロトタイピングなど、無細胞系での生物学的設計のテストをスピードアップするのに役立ちます。

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA...

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

無細胞発現系は、ハイスループット合成と重要なタンパク質のスクリーニングのための強力かつコスト効率の高いツールです。ここで、mRNA のテンプレート、線形 DNA プラスミド DNA を使用して急速な蛋白質の生産のビブリオ...

無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。...

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌...

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

新しい遺伝子回路の設計には、十分に特徴付けられた遺伝的部分が必要です。ここでは、遺伝子部分を迅速に特性評価するための費用対効果の高いハイスループットの方法について説明します。私たちの方法は、無細胞溶解物、クローニングを回避するための線状DNA、およびスループットを向上させ、反応量を減らすための音響液体処理を組み合わせることにより、コストと時間を削減します。...

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。...

無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

学ぶ、エキソヌクレアーゼV欠損株を用いた無細胞タンパク質合成法。線状DNAテンプレートを直接使用し、クローニングを省略して迅速なプロトタイピングを実現します。E. coli BL21 Rosetta2抽出物の調製とバッファー最適化の手順を解説します。

線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

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