等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

このプロトコルにより、研究者は溶液中に遊離した標的に対するアプタマーの結合親和性を決定できると同時に、結合のメカニズムについての洞察を得ることができます。ITCは結合による熱変化を測定するため、SPRなどの技術のようにアプタマーやリガンドを標識したり機能化したりする必要はありません。新しいユーザーは、すべてのバインド コンポーネント間でバッファーを一致させることに細心の注意を払う必要があります。

さらに、この手法には高いサンプル要件があり、タンパク質などの大きなリガンドでは満たすのが難しい場合があることに注意してください。はじめに、透析カラムの膜を活性化し、PBSバッファーで満たし、室温で10分間平衡化し、5, 000倍Gで15分間遠心分離します。バッファーを除去し、500マイクロリットルのアプタマーサンプルをカラムにロードします。

5, 000倍のGで遠心分離し、それを4回繰り返して、元のバッファーをPBSに交換します。透析したDNAアプタマーをピペットで回収し、新しい1.5ミリリットルチューブに移します。最後のフロースルーバッファーを収集して、テトラサイクリンを溶解します。

シリンジ内の実験用のバッファーが参照セル内のバッファーと一致することを確認します。紫外可視分光計を用いて再度アプタマー濃度を測定します。最後の交換バッファーを使用して、濃度を40マイクロモルのテトラサイクリンと2マイクロモルのアプタマーに調整します。

DNAアプタマーを90°Cで10分間加熱し、4°Cで10分間冷却した後、室温に20分間戻します。折り畳まれたアプタマーと透析テトラサイクリンを脱気ステーションまたは真空ポンプで25分間脱気し、溶存ガスを除去します。機械をクリーンアップして清浄度を確認した後、デフォルトのプログラムを使用し、製造元の指示に従って、EDTAと塩化カルシウムを含む標準キットで機械の精度をテストします。

実行パラメータを設定します。実行中のプログラム計算機を使用して、必要なボリュームを確認します。この実行パラメータを使用して、ITCシリンジ内の230マイクロリットルの40マイクロモルテトラサイクリンとITCサンプルセル内の485マイクロリットルの2マイクロモルアプタマーを使用してITC測定を実行します。

透析したテトラサイクリンシリンジプレートと折り畳まれたアプタマーを、ピペットを使用して気泡を避けてサンプルセルにロードします。ソフトウェアの[スタート]ボタンをクリックして、ITC機器の実行を開始します。ダブルクリックしてデータ分析ソフトウェアを開き、データの分析を開始します。

保存した生データのパスを開いて、バインドの傾向を確認します。モデリングタブを開き、さまざまなバインドモデルを使用して、データ曲線に最適なものを見つけます。次に、ソフトウェアはITCサーモグラムと、エンタルピー、エントロピー、自由エネルギー、平衡結合定数、化学量論などのさまざまな熱力学的パラメータを自動的に計算します。

データとフィットモデル情報から決定された熱力学的パラメータを収集します。ITCサーモグラムの写真とさまざまな熱力学パラメータを含むレポートを作成します。Kimらによって選択されたアプタマーは、解離定数1が13マイクロモルに等しく、解離定数2が53ナノモルに等しい結合親和性を有するテトラサイクリンに結合する。

ITCのフィッティングモデルと化学量論は、アプタマーがシーケンシャル結合モデルとの2:1の結合比でテトラサイクリンに結合することを反映しています。サイト2のITC測定によって決定された熱力学的パラメータは、比較的有意なエントロピー損失を克服するエンタルピーが強い結合を促進することを示しました。エントロピー損失を伴うエンタルピー駆動結合は、RNAと低分子間の結合挙動として報告されている核酸立体構造変化に関連しています。

アプタマーとリガンドは同じバッファーに入っている必要があります。アプタマーは、リフォールディングで現像する場合はリフォールドし、サンプルは脱気する必要があります。これらの考慮事項に対処することで、アプタマー-リガンド相互作用のみが測定シグナルに寄与することが保証されます。

アプタマーターゲットのサイズにより、適切なフォローアップ方法は、溶液中で測定された結合親和性フリーを確認するためのマイクロスケールの熱泳動である可能性があります。