Name: 1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぼう、1分子FRETと非天然アミノ酸導入による部位特異的標識法を用いて、mGluR2の立体構造ダイナミクスをリアルタイムで可視化する手法。タンパク質構造を損なわずに動的変化を捉え、神経科学・バイオ物理学研究に応用可能です。

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議論してくれたReza Vafabakhshラボのメンバーに感謝します。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01GM140272(R.V.へ)、ノースウェスタン大学の生命科学のためのサールリーダーシップ基金、およびシカゴコミュニティトラストのサール基金(R.V.へ)の支援を受けたシカゴ生物医学コンソーシアムによって支援されました。B.W.L.は、国立総合医学研究所(NIGMS)のトレーニング助成金T32GM-008061の支援を受けました。

プロトコルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。
1.サンプルチャンバーの準備
<ol><li>スライドとカバーガラスのクリーニング 注意: これらの手順は、スライドの表面とカバーガラスを洗浄し、アミノシラン化の準備をすることを目的としています。表面テザー分子で単一分子蛍光実験を実施するための重要な要件の1つは、不動態化表面です。最も信頼性が高く再現性のあるパッシベーション技術は、不活性ポリマー鎖を緻密な層としてガラス表面に共有結合させることを含む。ポリエチレングリコール(PEG)は、表面パッシベーションに使用される最も効率的なポリマーです16。PEG(PEG化)を用いたパッシベーション手順の詳細を以下に説明する:<ol><li>スライドに開ける穴をマーカーでマークします(~6 mm離れて、端から離れています)。ドレメルを使用して、スライドガラスに小さな穴(直径1 mm)を開けます。掘削プロセス中にスライドを水に浸します。</li>
		<li>スライドをアセトンで洗って、マーカーから残留インクを取り除きます。</li>
		<li>アセトンから取り出し、スライドを水ですすぎ、高出力(700 W)の水中で5分間電子レンジで加熱します。</li>
		<li>超音波処理するためにガラス染色瓶に入れる前に、水でスライドをきれいにします。カバーガラスを別の染色瓶に入れます。</li>
		<li>23°Cのバス超音波処理器で30分間アセトンでスライドとカバーガラスを超音波処理します。</li>
		<li>その間に、次工程で用いるアミノシラン化溶液を調製するためのガラス製フラスコを洗浄する。フラスコを1M KOHで満たし、フラスコを30分間超音波処理し、KOHを水で徹底的に洗い流し、メタノール中でさらに30分間超音波処理する。アミノシラン化工程の時点までフラスコをメタノール中に置いておく。</li>
		<li>その間に、アミノシラン、mPEG、およびビオチン-PEGを冷凍庫(-20°C)から取り出し、暗所で室温(RT)にします。</li>
		<li>スライドとカバーガラスの瓶からアセトンを適切な化学廃棄物容器に処分し、水で十分にすすぎ、5 M KOHでスライドを30分間超音波処理します。</li>
		<li>スライドとカバーガラスを水ですすぎ、メタノールで2分間超音波処理します(2回繰り返します)。アミノシラン化ステップまでメタノールで満たされたジャーを残します。 注:この研究では、特に明記されていない限り、脱イオン水が使用されます。23°Cで動作するバス超音波処理器が使用されます。</li>
	</ol></li>
	<li>アミノシラン化 注意: このステップは、アミノシランをきれいなスライドとカバーガラスの表面に共有結合させることを目的としています。官能化されたmPEGおよびビオチン-PEGは、次のステップでこの表面に共有結合します。<ol><li>清潔なフラスコでアミノシラン化混合物を調製する(ステップ1.6)。メタノール(150 mL)、酢酸(7.5 mL、ガラスピペットを使用)、およびアミノシラン(2.5 mL)を混合して溶液を調製します。</li>
		<li>化学ヒュームフードで溶液を穏やかに混合し、スライドジャーとカバーガラスジャーに注ぎます。カバーガラスには50 mL、スライドには100 mLを使用します。スライドとカバーガラスが溶液に完全に浸されていることを確認してください。</li>
		<li>10分間インキュベートし、次に1分間ジャーを超音波処理し(超音波処理は表面から不純物を除去します)、さらに10分間インキュベートします。</li>
		<li>アミノシラン化溶液を廃棄物収集容器に廃棄する。瓶にメタノールを加え、蓋で瓶を閉め、手でそっと振る。メタノールを処分し、瓶に水を入れます。</li>
		<li>アミノシランボトルを冷凍庫(-20°C)に戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>ペグ化 注意: これらの手順では、PEG化手順について説明します。<ol><li>アミノシラン化の際には、ペグ化バッファーを調製します。84 mgの重炭酸ナトリウム(NaHCO3)を量り、10 mLの水(10 mM)に加えます。さらに、mPEGとビオチン-PEGの重量を量り、脇に置きます。6枚のスライドとカバーガラスには、96 mgのmPEGと1.2〜2.4 mgのビオチン-PEGを使用します。 注:ビオチン-PEGはバックグラウンドスポットの数を増やす可能性があるため、あまり多く追加しないことが重要です。スライドに適用する直前までPEG混合物を溶解しないでください。</li>
		<li>スライドを水ですすぎ、穏やかなエアブローで乾かしてから、加湿した組み立てボックスに入れます。 注:クリーンな航空会社を使用することが不可欠です。ガラスに残留物を残す可能性のある圧縮された缶詰の空気の使用は避けてください。</li>
		<li>PEG粉末混合物にペグ化バッファーを加え、ピペットでゆっくりと上下に複数回ピペットで溶解します。スライドあたり55 μLのペグ化バッファーを追加します(6枚のスライドの場合は、330 μLのペグ化バッファーを追加します)。</li>
		<li>9,600 x g で23°Cで1分間遠心分離し、未溶解粒子を沈殿させます。次のステップで使用する上清を収集します。 注:ビオチン-PEGは、NHSグループの存在により急速に加水分解します。混合と遠心分離のステップを迅速に行うことが重要です。</li>
		<li>各スライドに60 μLのPEG化溶液を塗布し、PEG化溶液をスライドとカバーガラスの間に挟むようにカバーガラスを上に置きます。 注意: スライドとカバーガラスの間に気泡を導入すると、不動態化効率が低下するため、避けてください。カバーガラスとスライドをピペットチップで調整して、気泡を取り除きます。</li>
		<li>スライドを平らで暗い引き出しに置きます。スライドは一晩保存できます。ただし、4〜6時間のインキュベーションでは、最適な不動態化が得られます。 注意: どちら側がペグされているかを覚えておくことが重要です。</li>
		<li>保管する前に、ペグ化されていない側に印を付けてください。インキュベーション後、スライドとカバーガラスを静かに分解し、水で十分にすすいでください</li>
		<li>空気を吹き付けてスライドとカバーガラスを乾かします。スライドとカバーガラスを滅菌チューブ(50 mL)に入れ、PEG化表面を互いに反対側に向けて保管します。実験当日まで−20°Cで保存する。 注意: 準備から4週間以内にスライドとカバーガラスを使用するのが最善です。PEG化表面は互いに反対側を向いている必要があります。PEG化スライドとカバーガラスを真空シールされたバッグに保管すると、貯蔵寿命を延ばすことができます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 非天然アミノ酸を組み込んだmGluR2の発現、蛍光標識、抽出
注:このプロトコルは、UAA 4-アジド-L-フェニルアラニン(AZP)を含むmGluR2を発現するための細胞の調製、試薬、および治療の概要を示しています。この手順は、18mmのガラスカバーガラス上で増殖させたHEK293T細胞を対象としています。この手順は、必要に応じてスケールアップできます。
<ol><li>シード 注:HEK293T細胞を、10%(v / v)ウシ胎児血清、100ユニット·mL-1ペニシリン-ストレプトマイシン、および15 mM HEPESバッファー(補足ファイル1)(pH 7.4)を添加したDMEMで、5%CO2下で37°Cで維持します。<ol><li>細胞を0.05%トリプシン-EDTAで継代する。HEK293T細胞をポリL/D-リジン(PLL/PDL)ガラスカバーガラスカバースリップ上に播種し、トランスフェクション時に≥80%のコンフルエントに達するようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>トランスフェクション<ol><li>0.1 M NaOH中のAZPの40 mMストック溶液を調製します。</li>
		<li>細胞およびmGluR2発現を増殖させるためのAZP添加培地を調製します。40 mM AZPストック溶液を使用して、標準培地(+FBS、ペン/連鎖球菌、15 mM HEPES)を補足します。最終的なAZP濃度を0.6 mMにします。1 M HEPES溶液を追加します(40 mM AZPストック溶液の半分の容量を追加)。例えば、10 mLのAZP添加培地を調製するには、9.775 mLの標準培地、150 μLの40 mM AZPストック溶液、および75 μLの1 M HEPES溶液を組み合わせます。</li>
		<li>シリンジフィルター(0.2 μm、PES)を使用して培地をろ過(滅菌)します。</li>
		<li>トランスフェクションの前に、標準培地をAZP添加培地を含む培地と交換してください。 注意: 培地の交換中に細胞を乾燥させないように注意してください。</li>
		<li>メーカーのマニュアルに従って、トランスフェクション試薬(材料表)で細胞をトランスフェクションします。合計2 μgのDNA(1000 ngのtRNA/シンテターゼ+ 1000 ngのアンバーコドン含有タンパク質プラスミド)を使用して、HEK293T細胞を18 mmのカバーガラスにトランスフェクトします。使用した成分の濃度と量については 表1 を参照してください。</li>
		<li>トランスフェクションの24時間後に培地を新鮮なAZP添加培地に変更し、細胞をさらに24時間増殖させます。</li>
	</ol></li>
	<li>アルキンシアニン色素による標識<ol><li>ラベル貼付の20分前に、カバーガラスを温かい(37°C)記録バッファー(RB)(補足ファイル1)で2回洗浄し、AZPを含まない温かい(37°C)標準培地(+FBS、ペン/ストレプト、15 mM HEPES)に移動します。</li>
		<li>Cy3-アルキン、Cy5-アルキン、BTTES、硫酸銅(II)(CuSO4)、(+)L-アスコルビン酸ナトリウム、およびアミノグアニジンを含む標識溶液を調製します。</li>
		<li>ソリューションの作成と追加の順序に従います(表2)。<ol><li>50 mM BTTESを準備します。</li>
			<li>100 mMアミノグアニジンを調製します。</li>
			<li>100 mMのアスコルビン酸Naを準備します。</li>
			<li>655.5 μLのRBを準備します。</li>
			<li>Cy3/Cy5アルキン色素(DMSOストックで10 mM)をRBに追加します。 注:RBにアミノグアニジンを追加します。</li>
			<li>20 mM CuSO 4を準備します。</li>
			<li>CuSO4とBTTESを新しいチューブに混ぜます(溶液が青色に変わります)。</li>
			<li>CuSO4 と BTTES の混合物を RB に追加します (2.3.3.6)。</li>
			<li>Na-アスコルビン酸塩を追加します。</li>
			<li>下の 表2 に示す容量に従って、18mmのカバーガラスを確認してください。</li>
		</ol></li>
		<li>溶液を完全に混合し、細胞を標識する前に氷上および暗所で10分間インキュベートします。</li>
		<li>カバーガラスにラベル付け溶液を追加する前に、メディアを取り外してRBで洗浄します。標識溶液を加え、暗所条件下で37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>注:標識を改善するには、10分後にグルタミン酸(最終濃度~0.5 mM)を加え、さらに5分間インキュベートします。銅は細胞に対して非常に有毒であり、標識反応は in vivoで15分以上継続してはなりません。すべてのコンポーネントを新鮮に準備します。最後にNa-アスコルビン酸塩を追加します。調製中は反応液を4°Cに保ちます。但し、標識液を添加するに際し、細胞はインキュベーター内で37°Cで保存することになっている。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞を採取し、タンパク質を抽出する(細胞溶解)<ol><li>標識溶液を取り出し、mGluR2トランスフェクト細胞を含むカバーガラス(18 mm)をRBで2回洗浄します。</li>
		<li>ピペットを使用して、カバーガラスから細胞を洗い流し、RB(1 mL)に再懸濁します。 注意: この時点以降、サンプルの光への露出をできるだけ最小限に抑えてください。</li>
		<li>細胞を1,000 x g で4°Cで5分間回転させてペレット化し、上清を除去します。細胞ペレットを80〜130 μLの溶解溶液に再懸濁します。 注:細胞ペレットは目で見えるはずです。溶解量は、標識および洗浄プロセス中に失われるサンプルの量によって異なります。</li>
		<li>ピペッティングで穏やかに混ぜてペレットを砕きます。ホイルで包み、4°Cのロッカーに0.5〜1時間置き、細胞を溶解します。</li>
		<li>不溶性画分を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を新鮮なコールドチューブ(目的の蛍光タグ付きタンパク質を含む溶解タンパク質)に移し、実験のために氷上に保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 1分子フローチャンバーの組み立てと機能化
<ol><li>冷凍庫からスライドとカバーガラスを取り出し、暗闇の中でRTで温めます(~30分)。</li>
	<li>スライドとカバーガラスの間に両面テープのストリップを挟んで、両面テープを使用してチャンバーを組み立てます。PEG化表面がフローチャンバーの内部を形成していることを確認してください。</li>
	<li>ピペットチップを使用してカバースリップを押し、テープがカバースリップとスライドの両方に完全に接触していることを確認します。カバーガラスを壊さないように注意してください。スライドの端にエポキシを塗ります。 注意: ドリルで開けた穴にエポキシが充填されるほど多く追加しないでください。</li>
	<li>カバーガラス側を下に向けてフローチャンバーを加湿された暗い箱に入れ、エポキシを乾燥させます(~30分)。 注意: 乾燥期間中にエポキシが穴(10〜15μL)を覆うのを防ぐために、ドリルで開けた穴にT50バッファー(補足ファイル1)を追加します。</li>
	<li>各チャンバーレーンに~40 μLをゆっくりと塗布し、500 nMニュートラアビジン(T50で希釈)で各チャンバーレーンをインキュベートします。</li>
	<li>加湿した暗い箱の中でRTで2分間インキュベートします。レーンあたり~100 μLのT50バッファーで洗浄します。</li>
	<li>各チャンバーレーンを20 nMビオチン化抗体11でインキュベートします。抗体の選択は、タンパク質のタグに依存します。 注:一次抗体がビオチン化されていない場合は、最初にビオチン化二次抗体と30分間インキュベートし、次に一次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>加湿した暗い箱の中でRTで30分間インキュベートします。レーンあたり~200 μLのT50で洗浄します。 注意: 準備プロセス中にレーンが乾かないようにしてください。</li>
</ol>4. 単一分子バッファー
<ol><li>トロロックスバッファ 注:Troloxバッファーは、イメージングバッファーを作成するための開始バッファーです。緩衝液の成分は実験に依存し、目的のタンパク質に応じて変化し得る。ここで説明するプロトコルで使用されるバッファーには、塩(NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2)、緩衝剤(HEPES)、およびトロロックス(pH ~7.35)が含まれます。<ol><li>9〜10 mgのトロロックスを10 mLの単一分子記録バッファーに溶解します(SRB、 補足ファイル1) 注:トロロックスはバッファーをわずかに酸性にします。この段階で、水酸化ナトリウム(NaOH)溶液、10 M(pH 7.35)を使用してpHを調整します。微調整は、トロロックスが完全に溶解した後に行われます。しかしながら、この時点でpHを上げると、トロロックスの溶解度が増加する。</li>
		<li>ベンチトップロッカー(アルミホイルで包んだ)を使用してRTで溶液を4〜8時間混合し、トロロックスを完全に溶解します。</li>
		<li>pHを確認し、必要に応じて調整します。</li>
		<li>トロロックスが完全に溶解していることを確認してください。溶液をシリンジフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。 注:バッファーは、2〜10日間のエージング後に使用する必要があります。トロロックスはまばたきを抑制するのに役立ち、単一分子研究で一般的に使用されています17。アンチブリンキング特性は、トロロックス18の酸化誘導体に由来します。したがって、成熟するには少なくとも数時間はRTに保つことをお勧めします。さらに、新鮮なトロロックス溶液のUV放射は酸化プロセスをスピードアップし、トロロックスバッファー18の「老化」を加速するために使用できます。</li>
	</ol></li>
	<li>イメージングバッファーレシピ:トロロックスバッファー+界面活性剤(界面活性剤のCMC値の~2倍)+4 mMプロトカテク酸(PCA)を混合します。 </li></ol><ol><li> </li><li><li><li> </li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64254/64254eq01.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sending+signals+dynamically%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li>
<li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li>
<li>Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+biological+functions+and+potential+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li>
<li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li>
<li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors%3A+Physiology%2C+pharmacology%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li>
<li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA%28B%29+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li>
<li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li>
<li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li>
<li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li>
<li>Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li>
<li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22G+Protein+Coupled+Receptors%3A+Structure%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li>
<li>Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSerfling%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li>
<li>Cao, A. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).</li>
<li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li>
<li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li>
<li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series%3A+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518(2018).</li>
<li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+%28an+introduction%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).</li>
<li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A%282A%29+receptor+during+G+protein+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li>
<li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li>
<li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li>
<li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry%3A+In+vitro%2C+in+vivo%2C+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li>
<li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations%2C+challenges%2C+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662(2016).</li>
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著者は競合する利益を宣言しません。

GPCRは、細胞膜上で作用してシグナル伝達を開始するタンパク質です。多くのGPCRは複数のドメインで構成されており、シグナリングはドメイン間の協調的相互作用に依存しています。これらの膜受容体の特性を調節するためには、複数のドメインの動的挙動を理解することが不可欠です。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、タンパク質の立体構造とダイナミクスをリアルタイムで測定できる蛍光技術です11,32。ここでは、smFRET、単一分子プルダウン(SiMPull)、および全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を組み合わせて、不動態化された表面に固定化された個々のタンパク質の再配列を直接視覚化するアプローチについて説明します5,11,33。FRETは距離に非常に敏感で、分子内変化(3-8 nm)のプローブに適したナノスケール定規として効果的に機能します。...

原形質膜を横切る情報の伝達は、膜受容体の機能に大きく依存しています1。受容体へのリガンド結合は、立体構造変化および受容体活性化をもたらす。このプロセスは、本質的にアロステリックであることがよくあります2。800を超えるメンバーを持つGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体の最大のファミリーです3。ほぼすべての細胞プロセスにおける役割により、GPCRは治療薬開発の重要な標的となっています。GPCRシグナル伝達の標準モデルでは、アゴニストの活性化は受容体の立体構造変化をもたらし、続いてGαのヌクレオチド結合ポケットでGDPとGTPの交換を介してヘテロ三量体Gタンパク質複合体を活性化します。活性化されたGα-GTPおよびGβγサブユニットは、下流のエフェクタータンパク質の活性を制御し、シグナル伝達カスケードを伝播します4,5。このシグナル伝達プロセスは、本質的に、受容体の三次元形状を変化させるリガンドの能力に依存する。リガンドがこれを達成する方法の機構的理解は、新しい治療法を開発し、合成受容体とセンサーを設計するために重要です。
代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、クラスC GPCRファミリーのメンバーであり、グルタミン酸の遅い神経調節効果とニューロンの興奮性を調整するために重要です6,7。すべてのGPCRの中で、クラスCのGPCRは、それらが絶対二量体として機能するという点で構造的に独特である。mGluRには、ハエトリソウ(VFT)ドメイン、システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TMD)の3つの構造ドメインが含まれています8。活性化プロセス中の立体配座変化は複雑であり、12 nmの距離にわたって伝播する局所的およびグローバルな立体配座結合、および二量体の協調性が含まれます。中間的な立体配座、状態の時間的秩序、状態間の遷移速度は不明です。個々の受容体の立体構造をリアルタイムで追跡することにより、活性化中の一過性の中間状態と立体構造変化のシーケンスを特定することができます。これは、mGluR2 11の活性化中の立体構造変化の伝播を視覚化するために最近適用されたように、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動9,10(smFRET)を適用することによって達成することができる。FRET実験の重要なステップは、目的のタンパク質にドナーおよびアクセプター蛍光色素を部位特異的に挿入することによるFRETセンサーの生成です。非天然アミノ酸(UAA)取り込み戦略が採用されました12,13,14,15システインレス変異体の作成または大きな遺伝的にコードされたタグの挿入を必要とする典型的な部位特異的蛍光標識技術の限界を克服するため。これにより、mGluR2のリガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインを結合した必須のコンパクトなアロステリックリンカーの立体構造再配列を観察することができました。このプロトコルでは、銅触媒によるアジ化環化反応を用いて蛍光色素を結合させるためのUAAによるmGluR2の部位特異的標識のアプローチなど、mGluR2でsmFRET実験を行うためのステップバイステップガイドを紹介します。さらに、このプロトコルは、膜タンパク質の直接捕捉およびデータ解析のための方法論を記述する。ここで概説したプロトコルは、他の膜タンパク質の立体構造ダイナミクスの研究にも適用できます。

<table><tbody><tr><td>(+)-Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>4-azido-L-phenylalanine</td><td>Chem-Impex International</td><td>Cat # 06162</td><td></td></tr><tr><td>548UAA</td><td>Liauw et al. 2021</td><td></td><td>Transfected construct</td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (2022)</td><td>https://www.adobe.com/</td> <td>RRID:SCR_010279</td><td>ソフトウェア、アルゴリズム</td></tr><tr><td>アミノグアニジン (塩酸塩)</td><td>ケイマンケミカル</td><td>81530</td><td></td></tr><tr><td>アミノシラン</td><td>アルドリッチ</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>バス ソニケーター 2.8 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>超音波バス 2.8 L</td></tr><tr><td>ビオチン-PEG</td><td>レイサン バイオ インク</td><td>アイテム#ビオチン-PEG-SVA-5000-100mg</td><td></td></tr><tr><td>BTTES</td><td>クリックケミストリーツール</td><td>1237-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅 (II) シ</td><td>グマ・アルドリッチ</td><td>Cat # 451657-10G</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>16004-306</td><td>サンプルチャンバー</td></tr><tr><td>Cy3アルキン</td><td>クリックケミストリーツール</td><td>TA117-5</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 アルキン</td><td>クリックケミストリーツール</td><td>TA116-5</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310 1 GM</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>DDM-CHS (10:1)</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310-CH210 1 ML</td><td>コレクテロール含有洗剤</td></tr><tr><td>定義されたウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Di01-R405/488/561/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>ノッチフィルター</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U</td><td>カメラ</td></tr><tr><td>ET542lp</td><td>クロマ</td><td></td><td>ロングパス エミッションフィルター</td></tr><tr><td>FF640-FDi01</td><td>Semrock</td><td></td><td>エミッションダイクロイックフィルター</td></tr><tr><td>FLAG-tag 抗体</td><td>Genscript</td><td>A01429</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Invitrogen T7279</td><td>テトラスペック マイクロスフィア</td><td>球状ビーズ</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーファイネスト</td><td>12-544-4</td><td>サンプルチャンバー</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 6106-04-3</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 12022001</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBioReagents</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>イメージスプリッター</td><td>OptoSplit II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>レーザー</td><td>Oxxius</td><td></td><td>4ラインレーザーコンバイナー</td></tr><tr><td>リポフェクタミン3000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L3000015</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オ</td><td>リンパス オリンパス IX83</td><td></td></tr><tr><td>ミリQ水</td><td>バーンステッド</td><td></td><td>水 脱イオン装置</td></tr><tr><td>m-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>NF03-405/488/532/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>ダイクロイックミラー</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985091</td><td>Reduced Serum Medium</td></tr><tr><td>OptiMEM/Reduced serum medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro (2020b)</td><td>https://www.originlab.com/</td> <td>RRID:SCR_014212</td><td>データ解析・グラフ作成ソフトウェア</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pIRE4-Azi</td><td>Addgene</td><td>プラスミド # 105829</td><td>トランスフェクトコンストラクト</td></tr><tr><td>Poly-L-リジン臭化水素酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # P2636</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテク酸 (PCA)</td><td>HWI グループ</td><td>99-50-3</td><td></td></tr><tr><td>smCamera (Version 1.0)</td><td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td><td></td> <td>Cameraソフトウェア</td></tr><tr><td>重曹</td><td>FisherBioReagents</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td> <td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Whatman UNIFLO</td><td>Cat#9914-2502</td><td>液体ろ過</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>53188-07</td><td></td></tr></tbody></table>

1分子fretを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

細胞が外部シグナルに応答する能力は、細胞の発生、成長、および生存に不可欠です。環境からの信号に応答するには、細胞がそれを認識して処理できなければなりません。この課題は主に膜受容体の機能に依存しており、その役割はシグナルを細胞の生化学的言語に変換することである。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体タンパク質の最大のファミリーを構成しています。GPCRの中でも、代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、絶対二量体として機能し、リガンド結合部位を含む大きな細胞外ドメインを有するユニークなサブクラスです。mGluRの構造研究における最近の進歩は、それらの活性化過程の理解を改善しました。しかし、活性化および調節中のmGluRを介した大規模な立体配座変化の伝播はよくわかっていません。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、生体分子の構造ダイナミクスを単一タンパク質レベルで視覚化および定量化するための強力な手法です。mGluR2活性化の動的プロセスを視覚化するために、非天然アミノ酸(UAA)の取り込みに基づく蛍光立体配座センサーが開発され、受容体の天然構造の摂動なしに部位特異的タンパク質標識が可能になりました。ここで説明するプロトコルでは、新しいUAAラベリングアプローチ、サンプル調製、smFRETデータの取得と分析など、これらの実験の実行方法について説明します。これらの戦略は一般化可能であり、さまざまな膜タンパク質の立体構造ダイナミクスを調べるために拡張することができます。

UAAベースのFRETセンサーの発現と蛍光標識 本明細書では、mGluR2(548UAA)のCRD内へのUAA(AZP)の挿入および蛍光標識の例示的な結果が考察される11。前述のように、AZPをmGluR2に挿入するには、改変tRNA合成酵素と相補的tRNA(pIRE4-Azi)を含む改変翻訳機構と、突然変異誘発法を用いて作成された548位のアンバーコドンを含むmGluR2の共発現が必要です(図2A、B)。シアニン色素によるAZPの標識は、銅触媒による環化付加反応によって達成され(図2C)、548UAAの効果的な原形質膜標識をもたらします(図2D)。全長548UAAの翻訳および二量体受容体の完全性を検証するために、Cy5で標識された548UAAを発現するHEK293T細胞からの細胞ライセートに対してSDS-PAGE電気泳動を行った。250K...

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による 部位特異的標識を使用します。このプロトコルは、smFRETサンプル調製、実験、およびデータ分析のためのステップバイステップガイドを提供します。

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

ここでは、単一分子FRETを使用し、天然アミノ酸の取り込みを介した部位特異的タンパク質標識を使用して、mGluR2の構造動態を研究しました。これにより、タンパク質構造を乱すことなくタンパク質動態を研究することができます。原子構造は、タンパク質の静止画像を提供する。しかし、1分子FRETを使用すると、タンパク質の全範囲の動きをリアルタイムで溶液で視覚化できます。この方法は、あらゆるタンパク質の動態を研究するために適用することができる。さらに、天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質間相互作用、および合成受容体の工学を研究するために使用することができる。サンプルのローディングとイメージングの最適化には、忍耐と練習が必要です。まず、スライドガラスに開ける穴にマーカーで印を付けます。スライドを水に浸している間、ドレメルを使用してスライドに小さな穴を開けます。スライドを超音波処理し、摂氏23度のバス超音波処理器で30分間アセトンでスリップを覆います。スライドとカバーのスリップジャーからアセトンを廃棄します。水で十分にすすぎ、5モル水酸化カリウムで30分間超音波処理します。次に、スライドをすすぎ、スリップを水で覆い、メタノール中で2分間超音波処理します。アミノ塩類化ステップまでメタノールで満たされたジャーを残します。新しく調製したアミノ塩類化混合物をスライドに注ぎ、スリップジャーを覆います。溶液を廃棄する前に、アミノ塩類化混合物中のスライドおよびカバースリップをインキュベートし、超音波処理し、再びインキュベートする。次に、瓶を水で満たす前にメタノールで洗います。次に、スライドを水ですすいでください。エアブローで乾かし、組み立てボックスに入れます。60ミリリットルのPEG化溶液をスライドに塗布し、その上にカバースリップを置きます。保管する前に、非PEG化面に印を付けてください。インキュベーション後、静かに分解し、スライドとカバースリップを水ですすいでください。次に、空気を吹き付けて乾燥させ、PEG化表面を互いに反対側に向けて滅菌した50ミリリットルのチューブに入れます。HEK 293T細胞を0.05%トリプシン-EDTAで継代した後、細胞をポリ-L/D-リジンカバースリップに播種します。増殖細胞および代謝型グルタミン酸受容体2、またはmGluR2発現用のAZP補充培地を含む標準培地を配置する。その後、トランスフェクション試薬で細胞をトランスフェクションし、24時間インキュベートしてから、新鮮なAZP添加培地で培地を交換します。アルキンシアニン染料で標識する20分前に、カバースリップを温かい記録バッファー(RB)で2回洗浄し、AZPを含まない温かい標準培地に入れます。次に、標準培地を除去し、細胞をRBで洗浄してから、新たに調製した標識溶液を加えます。暗闇の中で摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、標識溶液を取り除きます。トランスフェクトした細胞を含むカバースリップをRBで2回洗浄し、同じ培地に再懸濁します。次に、摂氏4度で1,000gで5分間回転させて細胞をペレット化し、上清を除去してからペレットを80〜130マイクロリットルの溶解溶液に再懸濁した。ピペッティングでペレットを破る。次に、それをホイルで包み、摂氏4度のロッカーに30分から1時間置き、細胞を溶解します。不溶性画分を20, 000 gおよび摂氏4度で20分間遠心分離することによりペレット化する。次に、上清を新鮮な冷たいチューブに移し、氷の上に保存します。スライドとカバースリップを冷凍庫から取り出し、暗所で室温で温めます。スライドとカバースリップの間に両面テープのストリップを挟んでチャンバーを組み立て、PEG化表面がフローチャンバーの内部を形成するようにします。ピペットチップを使用してカバースリップを押し、テープがカバースリップとスライドに接触していることを確認します。スライドの端にエポキシを塗布します。40マイクロリットルの500ナノモルのニュートラアビジンを各レーンに塗布し、加湿した暗い箱の中でインキュベートします。2分後、各チャンバーレーンを100マイクロリットルのT50バッファーで洗浄します。次に、20ナノモルのビオチン化抗体溶液を加え、レーンあたり200マイクロリットルのT50バッファーで洗浄する前に30分間インキュベートします。コンピュータと顕微鏡の電源を入れます。次に、レーザーをオンにしてウォームアップします。次に、EMCCDカメラの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。サンプルチャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、タンパク質サンプルを徐々に追加して、視野あたり約400分子を実現します。0.3単位のプロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼを添加した100マイクロリットルのイメージングバッファーでチャンバーを洗浄します。ゲイン、取得率、レーザー出力を調整して、ドナーチャンネルとアクセクターチャンネルの両方で単一分子蛍光シグナルを検出します。次に、ドナーを励起し、視野内のドナー分子の80%がフォト退色するまでのタイムトレースを取得します。映画の最後に、640ナノメートルのレーザーをオンにして、分子の一部が光退色するまでアクセプターを直接励起します。視野を変更し、ドナーとアクセプターの励起の手順を繰り返して、条件ごとに3つの動画を収集します。粒子ピッキングの単一分子FRETトレースを選択するには、ドナートレースとアクセクタートレースの合計強度が時間の経過とともに安定しているトレースを選択します。次に、ドナーとアクセプターの強度に反相関の変化があるトレースを選択します。シングルステップの光退色を示すドナー分子とアクセプター分子を選択し、5秒以上の長さをトレースします。FRET欠損を計算します。最後に、原稿に記載されている手順に従って、隠れマルコフモデリング(HMM)によって立体構造状態を特定します。シアニン色素によるAZPの標識は、銅触媒による環化付加反応によって達成され、ドナーおよびアクセプター蛍光色素で標識された細胞表面集団による548UAAの効果的な原形質膜標識をもたらしました。SDS-PAGE電気泳動では、548UAAを発現するHEK 293T細胞で250キロダルトンの単一バンドが観察され、これは全長二量体mGluR2と一致しました。ドナーおよびアクセプターの漂白イベントに対する複数の短命および長期の代表的な選択的痕跡をここに示します。立体配座状態はHMM解析を用いて同定した。離散FRET状態間の遷移を理想適合値から抽出し、遷移密度ヒートマップとしてプロットした。理想化されたFRETトレースは、識別された各確認の滞留時間に関する情報も提供します。ドナーチャネルとアクセプターチャネルを持つ単一分子の痕跡を以下に示します。さらに、単一分子FRETは、mGluR2システインリッチドメインの4つの立体配座状態を明らかにします。単一分子のプルダウンには効率的なピーク保存が不可欠であり、このプロセスには注意が必要です。さらに、酸素消去剤はイメージングの直前に添加する必要があります。この標識法と1分子FRET実験は、複数の受容体に適用され、受容体の活性化と受容体機能の調節のメカニズムに新たな洞察をもたらしました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。...

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Gタンパク質共役受容体によるGタンパク質の選択的活性化を検出する簡単な方法は、細胞シグナル伝達における未解決の課題です。ここでは、GPCRとGタンパク質ペプチドをペアワイズテザリングして、生細胞の制御された濃度でのコンフォメーション変化を調べることにより、Fӧrster共鳴エネルギー移動(FRET)バイオセンサーを開発しました。...

ライブ細胞懸濁液の蛍光光度アッセイでFRETセンサーを用いて測定したGタンパク質選択的なGPCRの立体配座

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。...

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション...

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。...

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

この研究は、標識部位の選択、色素の選択、取得、およびデータ分析を含むFRETマッピングの方法論を詳述している。この方法論は、タンパク質系における結合部位、立体構造変化、および動的運動を決定するのに有効であり、既存の3D構造情報と組み合わせて実行される場合に最も有用である。...

フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論

このプロトコルでは、TIRF顕微鏡を使用して個々のイオンチャネルを追跡し、支持された脂質膜におけるそれらの活性を決定し、それによって側方膜の動きとチャネル機能の間の相互作用を定義する方法について説明します。メンブレンの準備、データの記録、および結果の分析方法について説明します。...

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。...

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

学ぼう、1分子FRETと非天然アミノ酸導入による部位特異的標識法を用いて、mGluR2の立体構造ダイナミクスをリアルタイムで可視化する手法。タンパク質構造を損なわずに動的変化を捉え、神経科学・バイオ物理学研究に応用可能です。

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

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