Name: 市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ市販タンパク質を用いたアクチン彗星形成とビーズ運動性の再構成法。細胞運動メカニズムを模倣し、力生成の生化学・生物物理学的機構を評価できる教育用プロトコルです。

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私たちは、LPENSの新しい家のメンバーの温かい歓迎、特にABCDJチームのすべての助けとサポートに心から感謝します。JPは財団ARC(グラントPJA 20191209604)からの財政的支援を認め、C.S.はヒューマンフロンティアサイエンスプログラム組織からの財政的支援(グラントRGP0026/2020)を認めます。

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<li>Abou-Ghali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+protein+is+not+necessary+for+polarized+actin+network+growth+and+actin+based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).</li>
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</ol>

著者は、この記事の内容と利益相反がないことを宣言します。

ここで詳述するプロトコルは、市販のタンパク質を使用して、ビーズ表面上のアクチンネットワークの成長、彗星形成、およびビーズの運動性を得る方法を説明しています。ただし、彗星が再現性よく観測されないか、スライドとカバーガラスの間で不均一になることがあります。次の説明では、プロトコルのいくつかの重要なポイントを強調し、調整可能ないくつかのパラメータを提案します。覚えておくべき1つの要因は、彗星の形成とビーズの速度は温度の影響を受け、25°Cをはるかに超える温度または23°Cをはるかに下回る温度は彗星形成に悪影響を及ぼし、再現不可能なデータを与えることです。温度管理された顕微鏡または温度管理された部屋での顕微鏡の使用を強くお勧めします。蛍光顕微鏡で彗星を観察するための運動性ミックスには、蛍光標識されたアクチンが含まれることがよくありますが、彗星の長さがビーズの直径を超えると、位相差顕微鏡ではビーズの隣の暗い塗抹標本としても見ることができます。位相差の可視化は、スピニングディスク を介して も蛍光イメージングに関連する光毒性があるため、タイムラプスイメージングに適しています。ビーズは時間の経過とともに沈降するため、倒立顕微鏡は直立顕微鏡よりも水平方向のビーズドリフトが少なく、映画に適しています。マニキュアなどの物質が彗星の形成を妨げるため、スライドをシールするために溶融VALAPを使用することは重要です。大量のVALAPをビーカーで作り、次にすくい取って、より急速に溶けやすい小さなビーカーを補充することができます。VALAPは室温で何年も良いです。
もう一つの重要な技術的側面は、綿密な緩衝液と運動性ミックス調製です。MB13を調製するとき、特にpH調整ステップでは注意が必要です。MB13のpHは、ATP加水分解を避けるためにNaOHで中性に迅速に調整する必要がありますが、pHが中性に近づくにつれてEGTAが可溶化するため、速すぎないでください。EGTAは、アクチンに結合したカルシウムを複合体化し、運動性ミックスでより活性なマグネシウム形態16を与えるため、重要な成分です。MB13の準備が速すぎたり遅すぎたりすると、彗星の形成が最適ではないか、まったく形成されません。追加の重要なポイントは、条件で遊ぶときに運動性ミックス中のKCl濃度を注意深く追跡することです。例えば、反応ミックスに1x MB13を使用し、プロフィリン、キャッピングタンパク質、およびArp2/3複合体をMB13で希釈する場合、運動性反応における最終KCl濃度は、Gバッファーによる希釈により約40〜50mMになります。この濃度はコメットアッセイで最良の結果をもたらし、60 mM KClを超えるとArp2/3複素核形成活性が低下します。
タンパク質面では、アクチン彗星を得るための重要な技術的側面は、市販のアクチン結合タンパク質の適切な取り扱い、特にマイクロリットルの量の正確なピペッティングです。ブラッドフォード標準曲線の直線性はピペッティングの優れたテストであり、この曲線はタンパク質濃度の日常的な測定に使用できます。実際、コメットの手順に再懸濁された市販のタンパク質を使用する場合、再懸濁中のバッチの変動性とユーザーエラーが実際の濃度と予想される濃度の違いにつながる可能性があるため、タンパク質濃度を常に検証することが重要です。タンパク質濃度のわずかな違いが彗星の完全な欠如につながることがあります。
ここで提示される方法の別の重要な側面は、重合のための燃料としてのプロフィリン複合体G-アクチンの使用である。歴史的に、インビトロ系は、アクチン源としてプレポリマー化糸状アクチン(F−アクチン)を使用した:表面上のバルク供給重合における解重合10、17。これには、G-アクチンレベルを制御するという利点がありましたが、解重合を触媒するために追加のコンポーネントを必要とする複雑さの層が追加されました。アクチンネットワークのターンオーバーは、ビーズの表面での核生成と重合によって促進される力の生成と運動性に必要ではないのに対し、ADF/コフィリンなどのアクチン解重合因子は表面から遠く離れた老化ネットワークに作用するため18、アクチンベースの運動性のほとんどのin vitro再構成は、簡単にするためにターンオーバーなしで行われます。しかしながら、G-アクチンを使用することにはいくつかの欠点がある。第1に、凍結乾燥された市販のアクチンを使用する場合、オリゴマーが存在する。ここで説明する解重合ステップは、再現性のある結果を得る上で非常に重要です。特に、G-緩衝液は伝統的にpH 8に調整されていますが、おそらく低pHが解重合を促進するため、この記事に記載されているアッセイでは、より低いpH(例えばpH7)がよりよく機能するようです19。G-アクチンを使用することの別の欠点は、重合に許容される塩条件に置かれると、自発的な核生成が起こり、F-アクチンがバルクおよびビーズ表面に形成されることである。G-アクチンとプロフィリンを複合化することで、バルクおよび尖った末端重合における自発的な核生成を抑制し、それによって核生成と有刺鉄線末端重合の両方を表面20に集中させる。プロフィリン−G−アクチンは、細胞内のアクチンの多くがこの形態21で存在するので、生理学的に関連性がある。ここでは、プロフィリン:アクチンの1:1の比率が使用されます。しかしながら、より高い比率(例えば3:1)はバルクでの重合をより完全に阻害するが、より高い比率はまた、Arp2/3複合体および有刺鉄線末端伸長をある程度阻害する22,23。
キャッピング活性は、表面活性化Arp2/3錯体24,25による核生成のサイクルを介して表面に新しいアクチンを確実に挿入するため、彗星形成にとっても重要です。キャッピングがなければ、表面での重合は雲を壊すのに十分な張力を蓄積しないため、アクチン雲は対称性を破って彗星を形成することはありません26。過去には、自家製の組換えマウスキャッピングタンパク質13を使用してきましたが、この記事で実施されたテストでは、市販の組換えヒトキャッピングタンパク質は、市販のゲルソリンと同様に効果的であることが示されていますが、10倍以上のゲルソリンを使用する必要があり、特定のアプリケーションでは、キャッピング27と同様にアクチン切断活性があるため、適切ではない場合があります。
最後に、この方法の堅牢性は、非常に活性なArp2/3複合体活性化剤であるストレプトアビジン-pVCA(SpVCA)28の使用にあります。SpVCAは、プロフィリン-G-アクチン条件において最も効率的であることが見出されるので、Arp2/3複合体結合ドメインに加えてWASPのプロフィリン-G-アクチン結合ドメイン(pドメイン)を含む29。さらに重要なことに、ビオチン-ストレプトアビジン結合 を介した 表面機能化を可能にするために最初に導入されたストレプトアビジンタグの使用は、おそらくストレプトアビジンが四量体であり、したがってArp2 / 3複合体活性を増加させることが知られている活性化因子をクラスター化しているという事実に起因して、Arp2 / 3複合体活性化を増加させる追加の効果を有する30.商業的に生産されたSpVCAは現在開発中であり、まもなく購入できるようになります。さらに、40 μLの2 μM SpVCAは、3 cm2 のビーズ表面をコーティングするために日常的に使用されていますが、他のコーティング濃度(より高いおよびより低い)も機能し、これらの条件で遊ぶと、異なる彗星の成長速度と形態が得られます。実際、彗星が形成されない場合、または彗星のサイズがスライド上で均一でない場合は、運動性混合物中の異なるKClおよびプロフィリン濃度と同様に、異なるコーティング条件をテストする必要があります。運動性ミックス中のアクチン、Arp2/3複合体、およびキャッピングタンパク質の濃度も、彗星形成を最適化するために変更することができますが、私たちの手では、これらの比率を変更すると、しばしば混乱した結果が生じます。
結論として、ここで説明する方法は、ビーズ表面および運動性上にアクチンアセンブリを生成するが、SpVCAで官能化できる任意の表面を使用することができる。ここで説明した吸着が機能しない場合は、ストレプトアビジン部分を使用して、ビオチン化後にSpVCAを目的の表面に付着させることができます。このようにして形成されたアクチン構造は、彗星であろうとなかろうと、アクチンネットワークの異なる生化学的および生物物理学的側面を試験するために使用することができ、マイクロピペット、光ピンセット、およびレーザーアブレーションによる物理的操作に特に適している15、26、31、32。ここで説明するアプローチは、研究コミュニティでの使用に加えて、学部生の生物物理学の学生が対称性の破れや自己組織化などの能動的物質の概念を研究するための教育ツールとして適切です。

細胞内でのアクチン重合は、細胞シグナル伝達の下流にあるアクチンフィラメント核形成の厳密な調節によって空間的および時間的に制御されています1。核形成はアクチン三量体の形成を介して起こり、その後、新生フィラメントの両端が自発的に重合しますが、一方の端(とげのある端)はもう一方の端(尖った端)よりも動的です2。核形成および有棘末端重合が表面に向けられるとき、それらは移動のために細胞膜を押し出し、ATP加水分解をエネルギー源として細胞内のミクロンサイズの物体を動かすのに十分な力(ピコからナノニュートンの範囲)を生成する3。いくつかの例には、アクチン彗星を使用して細胞から細胞へと広がるリステリア・モノサイトゲネス細菌、および有糸分裂中のランダム化遺伝にアクチン彗星ベースの移動が重要であるミトコンドリアが含まれます4,5。エンドソーム上のアクチン彗星および他の細胞内小胞は、ドナー膜からの剥離に関与している6、7、8。
ここで紹介する方法では、細胞アクチン重合のシグナル伝達の側面がバイパスされ、マイクロメトリックポリスチレンビーズに分岐アクチン核生成の活性化剤、特にヒトWASPタンパク質の活性ドメインであるVCA(WAまたはWCAとも呼ばれる)1をコーティングすることにより、アクチン重合が生成されます。次に、コーティングされたビーズは、細胞内の主要なアクチン重合核であるArp2/3複合体を含むアクチン重合に必要な成分を含む混合物中でインキュベートされ、ビーズ表面でVCAによって活性化され、娘フィラメント1の側面から分岐して新しいフィラメントを形成します。アクチンは最初はビーズの周りで均一に重合しますが、その後自然に対称性を破ってビーズを前方に押し出すアクチン彗星を作り、それによって細胞のような突出したネットワークと彗星を制御された方法で再現します。ビーズやその他のコーティングされた表面を用いた同様のアプローチは、アクチン重合の生化学および生物物理学を研究するために過去に私たちや他の人々によって使用されてきました9,10,11,12、しかしこれらの実験にはアクチン結合タンパク質に関する広範な専門知識が必要でした。ここで紹介するプロトコルは、市販の(またはまもなく入手可能になる)試薬でアクチン彗星と運動性を完全に堅牢に作成する方法を説明し、生物物理学的概念を教えるための教育環境を含め、誰でもこのアプローチにアクセスできるようにします。主な特徴には、穏やかで信頼性の高いピペッティングの重要性、アクチン源としてのプロフィリン複合モノマーの使用、およびビーズコーティング試薬としての高活性Apr2/3複合活性化剤の使用の重要性が含まれます。

<table><tbody><tr><td>アクチン、ウサギの筋肉、Alexa Fluor 488コンジュゲート&nbsp;</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>A12373 (最近販売終了)</td><td>本製品はHypermolのATTO-488アクチンに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>アクチン、ウサギ筋肉、ATTO-488</td><td>Hypermol</td><td>8153</td><td></td></tr><tr><td>アクチン、ウサギ骨格筋</td><td>細胞骨格</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Arp2/3 複合体</td><td>細胞骨格</td><td>RP01P</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>バイオスペクトロメーター、基本</td><td>Eppendorf</td><td>035739</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>BSA、高品質</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>BSA 標準液 2 mg/mL (Pierce)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td></td></tr><tr><td>Capping protein (a1b2, mouse recombinant)</td><td>Home-purified (参考文献 13)</td><td></td><td>この製品は、まもなく Cytoskeleton から発売される予定です。</td></tr><tr><td>キャッピングタンパク質(a1b2、ヒト組換え)</td><td>Hypermol</td><td>8322</td><td></td></tr><tr><td>Cube、GFP:U-MNIBA3またはU-MWB2</td><td>オリンパス</td><td>は製造中止</td><td>使用する顕微鏡に適合した任意のGFPキューブを使用できます。</td></tr><tr><td>攪拌用ドライブロック:ThermoMixer C(冷蔵)</td><td>Eppendorf</td><td>035963</td><td></td></tr><tr><td>** SmartBlock付き、24マイクロチューブ 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>035969</td><td></td></tr><tr><td>Gelsolin(ヒト組換え、Hisタグ付き)</td><td>細胞骨格</td><td>HPG6</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma</td><td>49909</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機 5427R + ローター</td><td>Eppendorf</td><td>934126</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、正立:BX51</td><td>オリンパス</td><td>販売終了</td><td>位相差光学系を装備した落射蛍光正立顕微鏡であれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡:IX70</td><td>オリンパスは</td><td>販売終了</td><td>位相差光学系を装備した落射蛍光倒立顕微鏡であれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>シグマ</td><td>76244ワ</td><td></td></tr><tr><td>セリン:ワセリン</td><td>シグマ</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>ピペットリサーチプラス</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>ギルソンピペットは、非常に少量(0.5 &micro;たとえば、L)。</td></tr><tr><td>**10 & マイクロ;L</td><td></td><td>933954</td><td></td></tr> <tr><td>** 2.5 & マイクロ;L</td><td></td><td>933953</td><td>この2つのサイズは必須ですが、高品質のピペット(例えば、フルセットのResearch Plus)の使用をお勧めします。</td></tr><tr><td>ポリスチレンカルボン酸ビーズ</td><td>Polysciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>**approx. 1 & micro;m径</td><td></td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>**約4.5&マイクロ;m diameter</td><td></td><td>17140-5</td><td></td></tr><tr><td>Profilin 1 (human recombinant, untagged)</td><td>Cytoskeleton</td><td>PR02</td><td></td></tr><tr><td>SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag)</td><td>Home-purified (参考文献 14)</td><td></td><td>この製品は、近日中にCytoskeleton社から発売される予定です。</td></tr><tr><td>VCA(ヒトWASP VCAドメイン、GSTタグ付き)</td><td>細胞骨格</td><td>VCG03</td><td></td></tr></tbody></table>

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

多くの細胞の動きや形状の変化、および特定の種類の細胞内細菌やオルガネラの運動性は、細胞、細胞小器官、または細菌の表面に動的なネットワークを形成する生体高分子アクチンによって駆動されます。このプロセス中の力生成の生化学的および機械的基礎は、機能化され、制御された一連の成分でインキュベートされたビーズなどの不活性表面上でアクチンベースの動きを無細胞的に再現することによって研究することができる。適切な条件下では、弾性アクチンネットワークがビーズ表面に集まり、ネットワークの成長によって発生する応力によって壊れ、ビーズを前方に推進する「アクチン彗星」を形成します。しかし、そのような実験では、さまざまなアクチン結合タンパク質のホストを精製する必要があり、多くの場合、専門家以外の人の手の届かないところにあります。本稿では、市販の試薬を用いてアクチン彗星とビーズの運動性を再現性よく得るためのプロトコルについて詳述する。ビードコーティング、ビードサイズ、および運動性混合物を変更して、ビード速度、軌道、およびその他のパラメータへの影響を観察することができます。このアッセイは、さまざまなアクチン結合タンパク質の生化学的活性を試験し、アクチンネットワークの活性物質特性を明らかにする定量的物理的測定を行うために使用できます。これはコミュニティにとって有用なツールであり、アクチン結合タンパク質精製の専門知識がなくても in vitro アクチンベースの運動性の研究を可能にします。

ビーズ上にアクチン彗星を再現性よく作成するための重要な側面の1つは、繊細なアクチン結合タンパク質の穏やかで正確なピペッティングです。ブラッドフォード検量線の生成は、ピペッティングスキルを評価する良い方法です。 図1A、B は、検量線のチューブと、ブラッドフォード試薬と混合した後のBSAの2つの段階希釈液の例を示しています。段階的な青色の色相に注意してください(タンパク質濃度が高いほど、溶液はより青色になります)。分光光度計で読み取ってプロットすると、これらの溶液は 図1Cに示すような標準曲線を与える。慎重なピペッティングを行うには、図に示すように、線形相関係数が0.999になるまでアッセイを繰り返す必要があります。
市販の再懸濁タンパク質の濃度がブラッドフォードアッセイ によって 慎重に評価されたら、コーティングされたビーズと運動性ミックスを調製し、一緒に混合します。 図2A は、彗星形成のさまざまな段階の代表的な画像を示しています:アクチン雲は、SpVCAコーティングされたビーズと運動性媒体を混合してから数分以内に形成されます。雲の偏波は~5分で起こり、彗星の生成は15-20分で起こる。落射蛍光顕微鏡と位相差顕微鏡の両方で見えるアクチン彗星(図2A)は、何時間も伸び続けますが、一定の速度が維持されないため、ビーズの運動性は通常1時間以内に評価されます。一方、VCAコーティングされたビーズでは、明るいアクチン雲が得られるまでに30分かかり(図2B)、彗星は形成されませんが、対称性は1〜2時間で壊れ始め( 図2Bの矢印)、一晩インキュベートすると雲は偏光を示します。
図3 は、キャッピングタンパク質の存在下でのビーズ速度評価の一例を示す。すべてのビーズはほぼ同時に対称性を破るため、スライドをスキャンし、彗星の全集団の写真を経時的に撮影する「疑似タイムラプス」記録が実行されます(図3A)。彗星は解重合しません。したがって、時間の経過とともに測定された彗星の長さの増加は、変位速度の計算に使用できます(図3B)。ゲルソリンは、その減少したキャッピング活性を補うために10倍以上のゲルソリンを添加した場合、彗星形成のためのキャッピングタンパク質の代わりに使用することができる。ゲルソリンの存在下で形成された彗星は質的に同じであり、キャッピングタンパク質を含むビーズとほぼ同じ速度で移動します(図3C)。キャッピング活性はビーズの表面で重合を集中させるための鍵であり、キャッピングタンパク質もゲルソリンも運動性ミックスに含まれていない場合、アクチン雲が偏光して彗星を形成することはありませんが、ビーズの周りに明るいアクチン雲が形成されます(図3D)。ビーズ上の彗星は、運動性ミックスを変化させ、異なるマイクロマニピュレーション技術、例えば15を用いて運動性の結果を観察することによって、異なる生化学的状況におけるアクチンベースの力産生を測定するために使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig01.jpg"> 図1:ブラッドフォード標準曲線 。 (A)ブラッドフォード標準曲線を作成するためのチューブの設定方法の写真。サンプルチューブは示されていません。(B)ブラッドフォード試薬と混合された2つの重なり合うBSA連続希釈液の写真。(C)(B)に示す溶液の600 nmでの吸光度を分光光度計で測定し、BSA溶液のタンパク質濃度の関数としてプロットします。線形適合は、サンプル濃度の計算に使用されます。線形適合の相関係数Rは0.999です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig02.jpg"> 図2:VCAコーティングビーズとは対照的に、SpVCAコーティングビーズでの彗星形成。 (A)代表的なSpVCAコーティングビーズ(各画像で異なるビーズ)を経時的に示す。混合の瞬間からの時間が示されています。アクチン雲はすぐに形成され、雲の偏光は彗星を与え、それは何時間も伸び続けます。(B)代表的なVCAコートビーズ(各画像に異なるビーズ)を経時的に示す。アクチン雲の偏光の始まりを見るには1時間以上必要であり(矢印)、長いインキュベーションでも彗星は生成されません。すべての画像は直径4.5μmのビーズ、蛍光アクチンの落射蛍光イメージングと位相差の視覚化を組み合わせたもので、(A)、スケールバー= 5μmの15分および20分の時点の位相差可視化です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig03.jpg"> 図3:彗星とビーズの速度解析 。 (A)および(C)キャッピングタンパク質(CP)またはゲルソリンのいずれかの存在下では、アクチン雲は反応の最初の20分で分極して彗星を形成し、彗星は時間とともに伸長します。各画像に示されている混合からの時間。各画像は異なるビーズです。ビーズと調製物の間に多少のばらつきがありますが、ここで説明する標準条件下では、平均してビーズはミクロン/サブミクロン/分の速度(0.2〜1μm / min)で移動します。(B)彗星長(ビーズの全集団)の経時的な評価を示す代表的なグラフ。線形相関の傾きは平均変位速度に対応し、この場合は0.24 μm/minです。 (D)キャッピング活性がない場合(キャッピングタンパク質またはゲルソリンなし)、アクチン雲はビーズの周りに形成されますが、彗星は形成されません。すべての画像は直径4.5μmのビーズ、蛍光アクチンの落射蛍光イメージング、スケールバー= 5μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、市販のタンパク質成分を使用してビーズの表面にアクチン彗星を生成する方法を説明しています。このようなシステムは、細胞に見られる突起構造を模倣しており、力生成の生理学的メカニズムを簡単な方法で調べるために使用できます。

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

成分と機能化された表面の単純な組み合わせで、このプロトコルは細胞の重要な機能、アクチンアセンブリによって駆動される動きを再現します。力生成の生化学的および生物物理学的メカニズムは、成分ミックスと機能化された表面の特性を変えることによって評価することができます。このプロトコルの主な利点は、すべての成分を購入できるため、タンパク質精製の専門知識が不要になることです。これにより、専門家以外の人がこのシステムを研究のツールとして使用できます。このプロトコルは、学部レベルの教育モジュールを提供し、タンパク質の操作と顕微鏡下での自己準備された生物学的システムの観察を学生に実践的な経験を提供します。システムパラメータを制御および変更できます。ラングミュア方程式などの物理解析は、軌道上で実行できます。凍結乾燥タンパク質を再懸濁することから始めます。タンパク質粉末を摂氏4度でパルス遠心分離することにより、チューブの底に固体を集めます。次に、製造元の指示に従って水を加え、氷上で少なくとも15分間インキュベートします。ピペッティングで穏やかに混ぜます。さらに15分間氷の上に置き、もう一度混ぜます。遠心分離によってチューブの底にある溶液を集める。リミックスし、氷上でアリコートします。凍結乾燥および凍結中に形成されるアクチンオリゴマーを解重合するには、再懸濁したアクチンのアリコートをGバッファーで8倍希釈し、追加のATP、DTT、および10%標識アクチンを添加します。タンパク質濃度を測定する前に、少なくとも数日から1週間、時折混合しながら氷上で解重合させます。再懸濁タンパク質のタンパク質濃度を測定するには、まずBSA希釈シリーズを調製します。原稿に記載されているように、2ミリリットルと1.5ミリリットルのチューブをラックに入れることから始めます。15ミリリットルの円錐形のチューブをブラッドフォード試薬で上部まで満たし、氷の上に置きます。200マイクロリットルのブラッドフォード試薬を取り、それを円錐形のチューブに戻し、ピペットチップを濡らします。溶液は粘性があるので、ゆっくりとピペットで溶液が泡を立てずにチップに完全に出入りできるようにします。次に、プレウェットチップを使用して、200マイクロリットルのブラッドフォード試薬をラック内の1.5ミリリットルのチューブのそれぞれにピペットで入れます。そして、15ミリリットルの円錐管の残りの内容物をボトルに戻します。列1、3、および5の2ミリリットルのチューブに水を計量します。原稿に記載されているように、校正されたBSAストック溶液を希釈することにより、BSA希釈シリーズを調製します。次に、各溶液900マイクロリットルを次のチューブに移して連続希釈します。ブランク用のブラッドフォード試薬チューブに800マイクロリットルの水を加え、タイマーを開始します。準備したチューブで、各BSA標準800マイクロリットルをブラッドフォード試薬200マイクロリットルと混合します。使い捨てキュベット中のブラッドフォード試薬または各標準物質と混合してから5分以内に、600ナノメートルの吸光度を読み取ります。得られた吸光度値を既知のBSA濃度の関数としてグラフ化し、R値0.99との線形相関を得る。2000マイクロリットルの水を含むチューブで、原稿に記載されているように再可溶化タンパク質を穏やかに希釈します。調製したブラッドフォード試薬に直ちに各溶液800マイクロリットルを加えて混合する。5分以内に分光光度計の吸光度を読み取ります。以前に作成した検量線を使用してタンパク質濃度を計算します。ビーズコーティングの場合は、遠心分離機を摂氏4度に事前に冷却します。50マイクロリットルのXbバッファーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで入れます。直径4.5マイクロメートルのビーズ懸濁液をボルテックスで十分に混合し、Xbバッファーを含むチューブに9マイクロリットルの懸濁液を加えます。サンプルを 20, 000 G で摂氏 4 度で 10 分間遠心分離します。ビーズをコーティングするには、ビーズを乱さずに上清を注意深く取り除き、穏やかにピペッティングしてビーズペレットをXbバッファー中の40マイクロリットルの2マイクロモルSpVCAに再懸濁します。次に、ドライブロック内のビーズを摂氏18度で20分間1000 RPMで攪拌します。次に、コーティングしたビーズを遠心分離により洗浄する。上清を除去し、ビーズを1%BSAを含む50マイクロリットルの冷たいXbに再懸濁した。ビーズを洗浄した後、コーティングされたビーズペレットを120マイクロリットルの冷Xb、1%BSAに再懸濁する。冷蔵庫または冷蔵室で氷上に保管してください。原稿に記載されているように運動性反応混合物を調製する。反応をすばやく混合し、タイマーを開始します。運動性反応混合物全体をスライド上に見つけます。18ミリメートル×18ミリメートルのカバーガラスで覆い、小さな絵筆を使用して溶かしたVALAPでカバーガラスを密封します。ビーズ全体の平均変位速度を得るには、スライド全体をスキャンして、位相差または蛍光静止画を経時的に記録します。彗星の長さを手で測定し、値を記録します。彗星の長さと時間をプロットします。線形フィットの傾きは平均成長速度です。位相差顕微鏡でタイムラプス動画を選択して、個々のビーズ速度を評価します。ビードの速度と必要な解像度に応じて、1〜10秒ごとにフレームを取ります。画像処理プログラムのトラッキングツールを使用して、ビーズの速度と軌道を取得します。BSA標準物質とブラッドフォード試薬を混合すると、段階的な青色の色合いの溶液が得られます。吸光度値を標準タンパク質濃度に対してプロットし、線形相関を使用して再懸濁タンパク質濃度を決定します。SPVCAコード化されたビーズとキャッピングタンパク質を含む運動性培地を混合すると、数分以内にアクチンクラウドが形成されます。雲の偏極は約5分で起こり、彗星の生成は15〜20分で起こります。アクチン彗星は何時間も伸び続けますが、一定の速度は維持されません。したがって、ビーズの運動性は1時間以内に評価されます。キャッピングタンパク質またはゲルソリンのいずれかとの運動性ミックスは、同様の方法で彗星を与える。アクチン雲は反応の最初の20分で偏光して彗星を形成し、彗星は時間とともに伸びます。経時的に測定された彗星の長さの評価は、変位速度の計算に使用されます。キャッピング活性がない場合、アクチン雲はビーズの周りに形成されますが、彗星の形成は起こりません。この手順を成功させるには、運動性ミックスを作るときだけでなく、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を測定するときにも、タンパク質の慎重な取り扱いとピペッティングが不可欠です。このプロトコルで得られた彗星の形成とビーズの軌道により、ソフトマターと統計物理学の解析、および力の測定やマイクロマニピュレーションなどの生物物理学的実験を使用して、運動の物理的メカニズムを理解することができます。

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市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

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