ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析
2022年8月9日
サルモネラ菌は、サルモネラ菌特異的液胞と細胞質ゾル中の遊離の両方で腸上皮細胞内に侵入して複製します(過剰複製)。ここでは、ImageJを介した2つの相補的な画像分析によってサルモネラ菌の細胞内表現型を定量化し、単一細胞の分解能とスコアリングを達成するためのハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルについて説明します。
この蛍光顕微鏡法は、腸管上皮細胞内のサルモネラ菌表現型を自動的に定量化し、スケーラブルな分解能で多数の菌株のサルモネラ菌の研究を可能にします。私たちの方法は、定量的、ハイスループット、および自動化を同時に行うという利点があり、エリア分析とシングルセル分析の両方に依存しています。細胞内挙動は、多くの細菌の宿主と病原体の相互作用の中心です。
本手法はサルモネラ菌以外の細菌性病原体にも容易に適応でき、その病態解明に貢献します。画像を取得した後、取得を開いてシングルセル解析を実行します。イメージJのcziファイル。
画像をクリックして[カラー]を選択し、[チャンネルの分割]を選択して、チャンネルを分割します。セルセグメンテーションの場合は、C1取得タイトルウィンドウでZ平面画像を選択します。C1取得タイトルウィンドウを選択し、画像をクリックしてから複製をクリックします。
次に、選択したZ平面の番号を書き込みます。書く C1Zplane タイトルボックスに、チェックを外します スタックを複製、をクリックします OK 選択したZ平面画像のみを複製します。選択したZ平面画像を表示するC1Zplaneというウィンドウが開きます。
次に、[プロセス]を選択し、[コントラストを強化]をクリックして、取得したC1Zplane画像の画像のコントラストを高めます。飽和ピクセルを調整し、[正規化]をオンにして[OK]をクリックし、コントラスト強調手法を適用して、コントラスト正規化されたC1Zplane画像を取得します。プロセスに移動し、Find Maximaをクリックして、コントラスト正規化C1Zplane画像で上皮細胞をセグメント化します。
次に、すべての上皮細胞に1つの極大点のみを帰属させるには、プレビュー点の選択にフラグを付け、ノイズ許容度を設定します。C1Zplane のセグメント化された画像 (マークされた最大値ポイントごとに各セグメント化されたパーティクルを表示する新しいバイナリマスクのような画像) を取得するには、[エッジ最大値を除外]にフラグを付け、[出力タイプ]としてセグメント化されたパーティクルを選択し、[OK]をクリックします。次に、C1Zplaneのセグメント化された画像にセグメント化されたセルのマスクを作成します。「解析」をクリックしてから「パーティクルを解析」をクリックし、「マスクを表示」および「エッジで除外」オプションを選択します。
サイズ間隔を設定し、[OK]をクリックしてC1Zplaneセグメント化されたバイナリマスクのマスクを取得します。ルックアップ テーブルをクリックし、ツールバーの [ルックアップ テーブルの反転] を選択します。コントラスト正規化された C1Zplane 画像のしきい値を設定するには、画像に移動し、[調整]、[しきい値] の順に選択し、暗い背景を確認します。
自動しきい値設定をデフォルトに設定し、赤いオプションを選択します。セルが完全に赤くなり、背景が暗くなるまで、最小カットオフ値を調整します。[適用] をクリックして、コントラスト正規化された C1Zplane イメージを、セルが白、背景が黒のバイナリ画像に変換します。
さらに、C1Zplaneセグメント化されたバイナリマスクのマスクのセルセグメンテーションを修正するには、[プロセス]を選択し、[画像計算機]をクリックします。次に、画像 1 としてセグメント化された C1Zplane のマスクを選択し、ドロップダウンリストで操作 AND を選択し、画像 2 としてしきい値のコントラスト正規化された C1Zplane を選択します。OKをクリックすると、ImageJは出力画像にC1Zplaneセグメントのマスクの結果として自動的に名前を付けます。
C1Zplane のすべてのセグメント化されたセルを関心領域としてラベル付けするには、[解析]、[パーティクルの分析] の順にクリックします。前に示したようにサイズを調整し、[何も表示しない] オプションを選択します。[マネージャーに追加] をオンにして、すべてのパーティクルを ROI マネージャー ツールに追加します。
また、[エッジで除外]をオンにして、[OK]をクリックします。ROIデータをROIセル取得タイトルとして保存します。ROI マネージャー メニューを [詳細] をクリックし、[保存] を選択して zip を実行します。細胞セグメンテーションが終了したら、C2取得タイトルウィンドウで液胞サルモネラ菌を分析します。
まず、プロセスに移動し、画像計算機をクリックし、画像1としてC2取得タイトルを選択し、ドロップダウンリストで操作減算を選択します。次に、画像2としてC3取得タイトルを選択し、[ウィンドウの新規作成]にチェックを入れて[OK]をクリックします。Z スタック全体に減算を適用するには、「プロセススタック」ウィンドウで「はい」をクリックします。C2取得タイトルウィンドウの結果を複製するには、画像メニューをクリックし、複製を選択します。
次に、重複スタックを確認し、[OK]を押して、C2取得タイトル1ウィンドウの結果を取得します。C2取得タイトル1ウィンドウの結果にガウスぼかしを適用するには、プロセスに移動し、フィルターをクリックして、ガウスぼかしを選択します。Sigma の値は 2 のままにするか、カスタマイズします。
[OK]をクリックし、[プロセススタック]ウィンドウで[はい]をクリックして、Zスタック全体にガウスぼかしを適用します。C2取得タイトル1のガウスフィルタリング結果をC2取得タイトルの結果に減算するには、[プロセス]をクリックして[画像演算]を選択します。次に、C2取得タイトルの結果を画像1として選択し、ドロップダウンリストで減算操作を選択し、C2取得タイトル1の結果を画像2として選択して、[OK]をクリックします。[プロセススタック]ウィンドウで[はい]をクリックしてZスタック全体に減算を適用し、C2取得タイトルの結果としてImageJによって自動的に名前が付けられたウィンドウを取得します。
C2取得タイトルの結果の背景からサルモネラ菌を分離するには、画像をクリックし、[調整]を選択して[閾値]をクリックします。次に、暗い背景を確認し、自動しきい値を大津に設定します。サルモネラ菌が完全に赤く表示され、背景が暗くなるまで、最小カットオフ値を調整します。
[適用]をクリックすると、[バイナリに変換]という名前のウィンドウが開きます。黒い背景を確認し、[OK]をクリックします。C2取得結果標題バイナリウィンドウにおける細胞内サルモネラ菌フォーカス面に対応する中央のZ面を選択する。画像をクリックしてから [スタック] をクリックし、[スライスの設定] を選択します。
次に、選択したZ平面の番号を書き込み、[OK]をクリックします。次に、[分析] をクリックし、[測定値の設定] を選択して、各 ROI の記録する測定値を設定します。次に、各ROIの合計領域に対応する領域を確認します。各ROIのしきい値ピクセルが占める面積の割合を記録するには、[面積の割合]と[しきい値の制限]をオンにします。
ディスプレイラベルをチェックして、すべてのROIに画像タイトル、チャネル、Z平面、およびX / Y座標のラベルを付けます。選択した細胞内サルモネラ菌のZ平面を使用して、すべての単一細胞のラベル、面積、およびサルモネラ菌が占める面積の割合を記録します。ROIセル取得タイトルを開きます。
zip ファイルを作成するには、[ファイル] メニューをクリックし、[開く] を選択します。次に、ROIマネージャーメニューの[測定]をクリックします。出力は、選択した測定値を報告するテーブルです。
最後に、ファイルを選択し、結果ウィンドウで[名前を付けて保存]をクリックして、結果テーブルを保存します。サルモネラ菌の細胞浸潤、液胞負荷、細胞質ゾル過剰複製を上皮細胞内で可視化した。面積分析の結果、ネズミチフス菌の感染率はサルモネラダービー株の両株と比較して有意に高く、サルモネラ菌株の上皮細胞への定着能力の違いを検出するための面積分析の有効性が実証されました。
サルモネラダービーsipA欠失変異株は、サルモネラダービー野生型と比較して、ハイパーレプリケーション率の低下を示し、ハイパーレプリケーションの誘導におけるsipaの役割と一致しました。ネズミチフス菌とサルモネラダービー野生型の間に過剰複製の違いは観察されませんでした。シングルセル解析では、ネズミチフス菌と比較してサルモネラダービー株の感染細胞の割合に有意差は見られませんでした。
それ以外の場合、サルモネラダービー株は、ネズミチフス菌よりも有意に低い平均液胞負荷を生成しました。ネズミチフス菌とサルモネラダービー野生型の間に差は認められなかったが、サルモネラダービーsipAは過剰複製の有意な減少を示し、面積分析の結果と一致した。サルモネラ菌には、多様な病原性を持ついくつかの血清型が含まれています。
この高速かつ自動化された方法で多数の菌株を調べることは、この病原体の実際の病原性の可能性を理解するのに大きく貢献します。
概要
この記事では、腸上皮細胞内のサルモネラ菌の細胞内表現型を定量化するための高スループットの蛍光顕微鏡法を紹介します。このプロトコルは自動分析を可能にし、解析可能な解像度で複数の株の研究を可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 微生物学
- 病原体-宿主相互作用
- 細胞イメージング
背景
- サルモネラ菌は腸上皮細胞に侵入し、バクテリオ内小胞と細胞質内で複製します。
- 細胞内挙動の理解は、宿主-病原体相互作用の研究に不可欠です。
- 既存の方法は自動化とスケーラビリティに欠ける可能性があります。
- この研究は定量的アプローチでこれらのギャップに対処します。
研究の目的
- サルモネラ菌の表現型を定量化するための高スループット法を開発すること。
- 多数の細菌株の分析を容易にすること。
- 他の細菌病原体にも適応可能なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 画像取得のための蛍光顕微鏡。
- 単細胞および領域分析のためのImageJソフトウェア。
- 上皮細胞の分割と細胞内サルモネラの定量化。
- 包括的な分析のためのZスタックの自動処理。
主な結果
- 単細胞レベルでのサルモネラ菌表現型の定量化に成功。
- 複数の株の分析のためのスケーラビリティを実証。
- 他の細菌研究にも適応可能な堅牢な方法を提供。
- サルモネラ菌の細胞内挙動の理解を深め。
結論
- 開発された方法は定量的で、高スループット、自動化されています。
- 細菌病原性の研究に大きく貢献します。
- 将来の応用は様々な細菌病原体にまで及ぶ可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Automated quantification of intracellular Salmonella phenotypes using ImageJ enables scalable, high-throughput analysis of host-pathogen interactions in epithelial cells. This approach supports robust, quantitative assessment of bacterial replication modes, directly informing early discovery and target validation for anti-infective strategies. The method's adaptability and throughput facilitate portfolio-wide screening and mechanistic de-risking in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of Salmonella replication phenotypes within host cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing vacuolar versus cytosolic bacterial behavior.
- Facilitates comparative analysis across multiple strains for functional target validation.
- Provides data-driven insights for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, automated scoring of infection phenotypes suitable for screening campaigns.
- Standardizes image analysis workflows, improving reproducibility and assay scalability.
- Generates quantitative outputs for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Enables batch processing and platform reuse across diverse experimental sets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant intracellular infection models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale strain comparisons.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement decisions in anti-infective pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This automated image analysis protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and screening in infectious disease research.
- Discovery Biology: Quantifies intracellular bacterial load and replication mode, clarifying host-pathogen pathways.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible scoring of infection phenotypes for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides single-cell and population-level quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects in vitro phenotypes to disease-relevant infection models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other bacterial pathogens, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in infection models.
- Operational Value: Automates and standardizes image analysis, enhancing reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis using ImageJ.
- Needs access to automated imaging platforms and computational infrastructure for batch processing.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various bacterial pathogens and cell models with protocol optimization.
- Throughput and resolution may be limited by imaging hardware and sample preparation quality.
