Name: 合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ合成mRNAトランスフェクションとインピーダンスベースのリアルタイム測定を組み合わせた腫瘍細胞の遊走・浸潤解析法。この手法により、がん転移を促進する遺伝子の同定と治療標的の発見が可能になる。

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著者らは、この原稿を編集してくれたChildren's Mercy Kansas CityのMedical Writing Centerに感謝します。この研究は、ナタリーのART財団(TPへ)と、チルドレンズ・マーシー病院(CMH)とカンザス大学がんセンター(KUCC)からのMCAパートナー諮問委員会の助成金(TPへ)によって支援されました。

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著者には開示すべき利益相反はありません。

遊走と浸潤は腫瘍細胞の重要な特徴です。腫瘍細胞の運動性を測定し、腫瘍細胞の運動性を制御する根本的なメカニズムを理解することは、治療的介入に重要な洞察を提供します2,27。細胞遊走を研究するために、いくつかの方法が開発されている7。引っかき傷または培養インサートを使用した創傷治癒アッセイは、ギャップ閉鎖の対照的な画像を提供するシンプルで頻繁に使用される方法です。個々の細胞追跡アッセイでは、細胞を蛍光色素でタグ付けできるタイムラプスイメージングで個々の細胞をモニタリングする必要があります。創傷治癒アッセイと個々の細胞追跡アッセイはどちらも、細胞の自発的な動きを測定します。
タイムラプスイメージングと集中的な要求後のデータ処理の助けを借りて、両方のアッセイはサンプル間の定量的比較を提供することができます28。しかし、これらのアッセイは、ECMタンパク質層を介した細胞浸潤の研究に...

腫瘍細胞の運動性は転移に重要な役割を果たします1,2。腫瘍細胞が近隣や遠隔地の健康な組織に広がると、がん治療が困難になり、再発の一因となります3,4。したがって、腫瘍細胞の運動性のメカニズムを理解し、関連する治療戦略を開発することが不可欠です。多くの腫瘍細胞は遺伝子発現プロファイルを変化させているため、遺伝子発現プロファイルのどの変化が腫瘍細胞の運動性の変化につながるかを理解することは非常に重要です5,6。
in vitroで細胞遊走を測定するために、いくつかのアッセイが開発されています。一部のアッセイでは、特定の時点でしか測定できないため、限られた情報しか提供されませんが、他のアッセイでは、腫瘍細胞の運動性に関する包括的な情報がリアルタイムで提供されます7。これらの細胞運動性アッセイの多くは、特定の時間またはエンドポイントで定量的な結果を得ることができますが、実験期間中の細胞遊走速度の動的変化に関する十分な詳細情報を提供することができません。また、細胞遊走速度の潜在的な変化は、実験計画、細胞の種類、細胞数によっては検討が困難な場合があります。さらに、単純な治療の効果は、従来の運動性アッセイの単純な定量化によって調査することができるが、様々な組み合わせ治療の複雑な効果を研究するには、より高度な定量化が必要になるかもしれない8。
微小電極で覆われたマイクロタイタープレートウェル底の電流をモニターする装置が開発された9。ウェルの表面への細胞の接着は電子の流れを妨げ、インピーダンスは細胞の量的および定性的結合と相関します。坑井底に微小電極が存在することで、細胞の接着、拡散、増殖を測定できます。上部チャンバーの微多孔膜の下に微小電極が存在するため、下部チャンバーへの細胞移動と浸潤の測定が可能になり、上部チャンバーは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質でコーティングされ、侵入が可能になります10。
以前、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定は、実験全体を通してリアルタイムデータを提供し、さまざまな実験条件下で即座に比較および定量化できることが実証されました11。その方法の論文では、腫瘍細胞の遊走と浸潤における目的のタンパク質の役割をテストするために、遺伝子ノックダウンが誘導されました。試験された実験条件下での本格的な遺伝子ノックダウン効果は、低分子干渉RNA(siRNA)によるエレクトロポレーション後3〜4日を要したため8、エレクトロポレーション後に細胞を再プレーティングし、3日後に再採取して、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定を行いました。
キナーゼ(Crk)およびCrk様(CrkL)のCT10調節因子は、様々な成長因子受容体キナーゼ経路および非受容体チロシンキナーゼ経路の下流でタンパク質間相互作用を媒介するアダプタータンパク質である12。CrkおよびCrkLタンパク質のレベルの上昇は、神経膠芽腫を含むいくつかのヒト癌の予後不良に寄与する13。しかし、CrkおよびCrkLタンパク質の上昇がどのようにして予後不良につながるかは不明です。したがって、CrkおよびCrkLの過剰発現が腫瘍細胞機能に及ぼす影響を定義することが重要です。以前、遺伝子ノックダウン研究が実施され、膠芽腫細胞の遊走と浸潤には内因性のCrkおよびCrkLタンパク質が必要であることが実証されました8。ここでは、腫瘍細胞の遊走および浸潤に対するCrkおよびCrkLの過剰発現の影響に対処するために、修正されたアッセイシステムが開発されました。
近年、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの開発により、mRNAのin vitro合成とその治療応用が改めて注目されています(Verbekeらによるレビュー14)。さらに、がんやその他の疾患における合成mRNAの使用において、目覚ましい進歩が見られました15,16。細胞のエレクトロポレーションは、合成mRNAを送達し、一過性の遺伝子改変を誘導する効果的な方法であり(Campillo-Davoらによるレビュー17)、合成mRNAの使用により、不死化線維芽細胞における迅速かつ効率的な遺伝子発現が可能になります18。この方法論文では、合成mRNAを用いた遺伝子の過剰発現とリアルタイムの細胞解析を組み合わせて、腫瘍細胞の遊走と浸潤を研究しています。しかし、siRNAに用いられる実験スキームは、外因性タンパク質のレベルが合成mRNAトランスフェクションで急激に増加し、合成mRNAトランスフェクション時に徐々に減少するため、合成mRNAトランスフェクションでは機能しない18。そのため、トランスフェクション直後の細胞遊走や浸潤を、細胞を追加培養することなくリアルタイムに解析できるように改良しました。
この分析法論文は、インピーダンスベースのリアルタイム測定と、合成mRNAを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションを組み合わせることで、遺伝子のアップレギュレーションが腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を迅速かつ包括的に解析できることを実証しています。この方法の論文では、膠芽腫細胞の遊走と浸潤がCrkとCrkLの過剰発現によってどのように影響を受けるかを測定するための詳細な手順について説明します。この論文では、合成mRNAが腫瘍細胞の遊走に及ぼす影響を調べることで、タンパク質レベルの上昇が腫瘍細胞の遊走をどのように刺激するかを明確に説明しています。さらに、腫瘍細胞の浸潤に対する遺伝子発現の変化の影響を評価するために、ECMゲルの濃度を変化させるアプローチが提示されています。

<table><tbody><tr><td>AlphaImager HP</td><td>ProteinSimple</td><td>92-13823-00</td><td>アガロースゲルイメージングシステム</td></tr><tr><td>&-チューブリン抗体</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&α;-チューブリンタンパク質(希釈1:3,000)CIM</td></tr><tr><td>プレート 16</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>細胞浸潤および移動プレート</td></tr><tr><td>Crk抗体</td><td>BD Biosciences 610035</td><td></td><td>CrkIおよびCrkIIタンパク質の検出に使用(希釈率1:1,500)</td></tr><tr><td>CrkL抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-319</td><td>CrkLタンパク質の検出に使用(希釈率1:1,500)</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s 培地 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td>細胞の洗浄に使用される緩衝液</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30910.03</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>51030285</td><td>CO2 インキュベーター</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗マウスIgG二次抗体</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>ウェスタンブロット解析用二次抗体(希釈率1:10,000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ 抗ウサギIgG二次抗体</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>ウェスタンブロット解析用二次抗体&nbsp;(希釈率1:10,000)</td></tr><tr><td>塩化リチウム&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td>RNA沈殿</td></tr><tr><td>に使用 マトリゲル基質</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>細胞外マトリックス(ECM)ゲル</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td>RNA合成に使用</td></tr><tr><td>ミレニアムRNAマーカー</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td>ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に使用</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>ISC BioExpress</td><td>C1301P-ISC</td><td>細胞のスピンダウンに使用</td></tr><tr><td>マウス脳 QUICK-Clone cDNA</td><td>TaKaRa</td><td>637301</td><td>クローニング用遺伝子(インサート)の供給源</td></tr><tr><td>NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>M200PRO</td><td>核酸定量システム</td></tr><tr><td>ネオンエレクトロポレーションシステム&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>エレクトロポレーションシステム1</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 & micro;L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>エレクトロポレーションキット</td></tr><tr><td>Neon transfection system 100 &micro;L キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MPK10096</td><td>エレクトロポレーション キット</td></tr><tr><td>NorthernMax 変性ゲル緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>AM8676</td><td>ホルムアルデヒド アガロースゲル電気泳動に使用</td></tr><tr><td>NorthernMax ホルムアルデヒド負荷色素</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td>ホルムアルデヒド アガロースゲル電気泳動に使用</td></tr><tr><td>NorthernMax ランニング バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>AM8671</td><td>ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に使用</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>テクノバ</td><td>W3331</td><td>mRNA合成時の各種反応に使用</td></tr><tr><td>オデッセイ CLxイメージャー</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>ウェスタンブロット解析用イメージャー</td></tr><tr><td>pcDNA3.1/myc-His</td><td>Invitrogen</td><td>V80020</td><td>インサート(マウスCrkIおよびCrkL cDNAs)をクローニングしたベクター</td></tr><tr><td>pFLAG-CMV-5a</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E7523</td><td>FLAGエピトープタグの供給源</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P2069</td><td>DNA抽出に使用</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560L</td><td>mRNA合成のためのプラスミドの線形化に使用</td></tr><tr><td>ポリ(A)テーリングキット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td>ポリ(A)テール反応に使用</td></tr><tr><td>ポリスチレン組織培養皿(100×20mmスタイル)</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>前の細胞培養に使用ポリスチレン組織培養皿(35×10mmスタイル)</td><td>コーニング</td><td>353001</td><td>トランスフェクト細胞の培養に使用</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>反応混合物中のタンパク質の除去に使用</td></tr><tr><td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td><td>Labconco Corporation</td><td>304410001</td><td>細胞の無菌処理用バイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td>Reto Suspension Buffer R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>エレクトロポレーションキット、MPK1025、MPK10096に含まれるバッファーです。このバッファーは、エレクトロポレーション前に細胞を再増殖するために使用され、その組成は専有情報です。</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNA除染液</td></tr><tr><td>Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>ハンドヘルド自動セルカウンター&nbsp;</td></tr><tr><td>ScriptCap 2'-O-メチルトランスフェラーゼキット</td><td>Cellscript</td><td>C-SCMT0625</td><td>キャッピング反応に使用</td></tr><tr><td>ScriptCap m7G キャッピングシステム</td><td>Cellscript</td><td>C-SCCE0625</td><td>キャッピング反応に使用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td>プロテイナーゼK反応に使用</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004532</td><td>細胞をスピンダウンする卓上遠心分離機</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>細胞の解離に使用</td></tr><tr><td>U-118MG&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB15</td><td>ヒト膠芽腫患者由来の接着細胞株</td></tr><tr><td>ビンキュリン抗体</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>ビンキュリンタンパク質(希釈率1:100,000)の検出に使用</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>リアルタイム細胞解析</td></tr><tr><td>に使用さまざまな細胞株の1エレクトロポレーションパラメータおよびその他の関連情報は、メーカーのホームページで入手できます(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?)。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

合成mrnaトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

腫瘍細胞は運動性が高く侵襲性が高く、遺伝子発現パターンが変化します。遺伝子発現の変化が腫瘍細胞の遊走と浸潤をどのように制御するかについての知識は、腫瘍細胞が隣接する健康な組織に浸潤し、転移するメカニズムを理解するために不可欠です。これまで、遺伝子ノックダウンとそれに続くインピーダンスベースの腫瘍細胞の遊走と浸潤のリアルタイム測定により、腫瘍細胞の遊走と浸潤に必要な遺伝子を同定できることが実証されました。最近では、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの治療目的での合成mRNAの使用への関心が高まっています。ここでは、遺伝子の過剰発現が腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を研究するために、合成mRNAを用いた方法を改訂しました。この研究は、合成mRNAトランスフェクションとそれに続くインピーダンスベースのリアルタイム測定による遺伝子発現の上昇が、腫瘍細胞の移動と浸潤を刺激する遺伝子の同定に役立つ可能性があることを実証しています。この方法論文では、遺伝子発現の変化が腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を調べるための手順に関する重要な詳細を提供します。

CrkおよびCrkLタンパク質は、ニューロン22、T細胞23、線維芽細胞18,19、およびさまざまな腫瘍細胞13を含む多くの細胞タイプの運動性において重要な役割を果たします。膠芽腫ではCrkおよびCrkLタンパク質が上昇していることが報告されているため24,25,26、Crkのスプライス変異体であるCrkIの過剰発現が神経膠芽腫細胞遊走に及ぼす影響が本研究で研究された。U-118MG細胞を異なる濃度の合成CrkI mRNAでエレクトロポレーションし、タンパク質レベルと細胞遊走について分析しました。さまざまな濃度の合成CrkI mRNAを用いたU-118MG膠芽...

多くのアップレギュレーションされた遺伝子は、腫瘍細胞の遊走と浸潤を刺激し、予後不良につながります。どの遺伝子が腫瘍細胞の遊走と浸潤を制御しているかを決定することは非常に重要です。このプロトコルは腫瘍のセルの移動そして侵入に対する遺伝子の高められた表現の効果をリアルタイムで調査するための方法を示す。

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

このプロトコルはインピーダンスと感覚のメッセンジャーRNAトランザクションを結合し、細胞移動および浸潤のインピーダンスによって基づく実時間測定が腫瘍細胞の移動および侵入を刺激する遺伝子の同一証明を促進することを示す。インピーダンスベースのリアルタイム細胞解析システムは、遺伝子発現変化時の腫瘍細胞の移動を定量的、連続的、包括的にモニタリングすることができます。腫瘍を過剰発現させ、腫瘍細胞の遊走を刺激する遺伝子は、がん治療における転移を阻害する潜在的な標的として特定できます。まず、10x反応バッファー10マイクロリットル、PNE 1.5マイクロリットル、プラスミドDNA10マイクログラムをマイクロ遠心チューブに加え、プラスミドDNAを制限酵素で直鎖化します。ヌクレアーゼ遊離水を加えて、反応量を100マイクロリットルにします。反応混合物を摂氏37度で一晩インキュベートする前に、軽く叩いて回転させて混合します。ここでも、10%SDSを5マイクロリットル、RNAグレードのプロテイナーゼKを1ミリリットルあたり1マイクロリットル、1マイクロリットルの20ミリグラムを反応混合物にスピンダウンして加え、その後、混合してスピンダウンします。摂氏50度で30分間インキュベートした後、10倍転写バッファー、ATP、GTP、UTP、CTP、およびT7をそれぞれ2マイクロリットル、および1マイクログラムの直鎖状DNAをマイクロ遠心チューブに加え、T7 RNAポリメラーゼを介したRNA合成を行います。ヌクレアーゼフリー水を加えて、反応量を20マイクロリットルにします。スピンダウン後、反応混合物を摂氏37度で2時間インキュベートし、RNA合成を行います。次に、スピンダウンして1マイクロリットルのDNAを加え、37°Cで15分間インキュベートする前にタップしてテンプレートDNAを除去します。反応混合物に10マイクロリットルの7.5モル塩化リチウムを添加することにより、RNAの塩化リチウム沈殿を開始します。タップしてスピンダウンした後、反応混合物を摂氏マイナス20度で30分間インキュベートします。キャッピングには、RNAサンプルを摂氏65度で10分間加熱し、氷上に置いて冷却します。次に、キャッピング反応成分を添加し、タッピングして混合します。反応混合物をスピンダウンし、摂氏37度で1時間インキュベートします。ポリAテーリングの場合は、サンプルをスピンダウンし、ポリAテーリング反応成分を添加します。次に、反応混合物をタップし、スピンダウンし、摂氏37度で2時間インキュベートします。塩化リチウムの沈殿および合成mRNAの定量のために、50マイクロリットルの7.5モルの塩化リチウムを添加し、塩化リチウム沈殿を行う。ECMゲルストックのアリコートを冷凍庫から取り出し、氷上に保管します。マイクロ遠心チューブ内で990マイクロリットルのDMEMと10マイクロリットルのECMゲルを混合することにより、1リットルあたり10ミリグラムのECMゲルを使用濃度に希釈します。穏やかなピペッティングで混合します。60マイクロリットルの希釈ECMゲルを、CIMプレートの上部チャンバーの16ウェルのそれぞれに添加します。プレートカバーを外した状態でCIMプレートの上部チャンバーを、二酸化炭素インキュベーター内の保護用プラスチックシートの上に約4時間置き、ゲル層を形成します。エレクトロポレーションでは、各チューブの腫瘍細胞懸濁液に1ミリリットルのDPBSを加えます。細胞懸濁液をタップし、10秒間3回スピンダウンします。マイクロピペットを使用して上清を取り除きます。110マイクロリットルの再懸濁バッファーRを細胞ペレットに添加し、10マイクロリットルで10万個の細胞を得る。合成mRNAを細胞ペレットに添加して、所望の発現レベルに応じてマイクロリットルあたり0.2〜20ナノグラムの濃度を得る。細胞ペレットを混合し、軽く叩いて再懸濁します。次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液をエレクトロポレーションシステムで1, 350ボルトで10ミリ秒間、毎回3パルスでエレクトロポレーションします。完了したら、エレクトロポレーションした細胞を、0.5%FBSを含む1.1ミリリットルのDMEMが入った新しいマイクロ遠心チューブに移します。リアルタイム細胞解析ソフトウェアのアイコンをダブルクリックして解析プログラムを開きます。既定の実験パターン設定オプションを開いた後、3 つの実験を個別に実行するオプションを選択します。番号タブをクリックして、各クレードルを開きます。次に、[実験ノート] タブをクリックします。フォルダーを選択し、実験の名前を入力してデータを保存します。レイアウトタブをクリックし、一度に4つのウェルを選択して、各処理条件のクワッド重複ウェルを設定します。サンプル情報を入力し、[適用]をクリックします。スケジュールタブをクリックし、ステップを追加して、セルインピーダンス測定の2ステップモードを設定します。次に、「適用」をクリックして最初のステップを設定します。もう一度 [ステップの追加] をクリックし、間隔に 10 分、移行と侵入の期間に 48 時間を入力します。次に、「適用」をクリックして、2番目のステップを設定します。細胞インピーダンス測定の1時間前に、10%血清またはその他の化学療法誘引物質を含む160マイクロリットルのDMEMをCIMプレートの下部チャンバーのウェルに添加します。ECMゲルでコーティングされた侵入用のウェル、または移動用のコーティングされていないウェルを含む上部チャンバーを下部チャンバーで組み立てます。細胞遊走アッセイでは、50マイクロリットルの低血清培地をCIMプレートの上部チャンバーのウェルに添加します。CIM プレートとシステムのクレードルを CO2 インキュベーターに入れます。「メッセージ」タブをクリックします。接続に問題がなければ、CIMプレートは実験の準備が整いました。組み立てたCIMプレートを二酸化炭素インキュベーターで30〜60分間プレインキュベートしてから、リアルタイム細胞解析を行い、CIMプレートを培養条件に順応させます。ベースラインの読み取りについては、各クレードルのスタートボタンをクリックします。[名前を付けて保存]ウィンドウが表示されたら、実験ファイルを保存してベースラインの読み取りを実行します。セルを装着する場合は、クレードルからCIMプレートを取り外し、プレートホルダーのバイオセーフティキャビネットに置きます。次に、100 、 000 個の細胞を含む 100 マイクロリットルのエレクトロポレーションセルを CIM プレートの上部チャンバーのウェルに追加し、CIM プレートを室温で 30 分間バイオセーフティキャビネットの下に置いておきます。完全に組み立てられたCIMプレートをそれぞれのクレードルに戻して、セルインピーダンスを測定します。2番目のステップのセルインピーダンス測定は、クレードルスタートボタンとプロットタブをクリックして開始します。次に、[すべて追加] ボタンをクリックし、平均ボックスと標準偏差ボックスを選択して、データをリアルタイムで視覚化します。さまざまな濃度の合成クラック1 mRNAを用いたU 118 mg神経膠芽腫細胞のエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの翌日にフラグタグ付きクラック1タンパク質の濃度依存的な増加が見られました。マイクロリットルあたり0.2ナノグラムと2ナノグラムのmRNAは、外因性の亀裂1タンパク質の検出不能または控えめな発現をもたらした。マイクロリットルあたり20ナノグラムのmRNAは、内因性のクラックワンタンパク質よりも高い発現レベルをもたらしました。細胞遊走アッセイは、エレクトロポレーションが0.2または2ナノグラム/マイクロリットルの亀裂であり、1つのmRNAが細胞遊走に大きな影響を与えないことを示しました。しかし、1マイクロリットルあたり20ナノグラムの亀裂1 mRNAによるエレクトロポレーションは、2時間から13時間の間により多くの細胞が移動する細胞移動の明らかな刺激をもたらし、神経膠芽腫細胞の移動が亀裂1タンパク質レベルの増加によって刺激されたことが明らかになりました。合成クラックL mRNAによるエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの1日後にフラグタグ付きクラックLタンパク質が強固に発現しました。コントロール細胞への浸潤は、ECMタンパク質濃度の上昇とともに遅くなりました。クラックLを過剰発現する細胞は、細胞浸潤におけるECMゲル濃度依存的な減少を示しました。異なるECMゲル濃度でのコントロール細胞とクラックL過剰発現細胞の比較は、クラックLの過剰発現が一般的にECMゲル層を通る細胞浸潤を刺激することを示しました。また、この結果は、2つの細胞集団が、異なる時点でECMゲル濃度を増加させることによって異なる影響を受けることを示唆しています。再懸濁された気泡Rでの細胞の長時間のインキュベートは細胞を不健康にするため、細胞は再懸濁された気泡Rの人のエレクトロポレーションに素早く、穏やかに、そして完全に再懸濁されるべきです。高速および低速の遊走腫瘍細胞を単離して、2つの細胞集団間の違いを特徴付けることができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映...

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

このメソッドは、実時間、速度、変位、速度など、さまざまな細胞への移行パラメータの定量的測定の細胞のモニタリングが可能になります。従来の方法とは異なり、このリアルタイムのアプローチは、エンドポイントの定量的な移行の測定値に基づいてされていません。代わりに監視し、継続的にさまざまなパラメータを計算することができます。...

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。...

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。...

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。...

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。...

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。...

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

インビトロ細胞侵入アッセイは、タンパク質マトリックスを含む細胞培養インサートを用いて細胞侵入および移動の細胞電位を定量化することにより、癌転移の可能性を測定するために使用される。細胞は、タンパク質マトリックスと多孔質膜を通って、化学集化剤に向かって移動し、光顕微鏡で定量化することに挑戦される。...

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。...

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

学ぶ合成mRNAトランスフェクションとインピーダンスベースのリアルタイム測定を組み合わせた腫瘍細胞の遊走・浸潤解析法。この手法により、がん転移を促進する遺伝子の同定と治療標的の発見が可能になる。

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

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