P3HR1細胞株からのエプスタインバーウイルスの単離と定量
2022年9月28日
このプロトコルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテートでウイルス溶解サイクルを誘導する際に、ヒトP3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離することを可能にします。続いて、ウイルス調製物からDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供してウイルス粒子濃度を定量化する。
この方法により、P3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離し、ウイルスストックを定量して、さまざまな研究目的に使用することができます。この技術の主な利点は、EBウイルスストックを調製するための比較的容易で、安価で、高速で、信頼性の高い方法を提供することです。この技術によって製造されたバイタル粒子は、EB.To の診断のために多くのin vitroまたはin vivo実験モデルに使用でき、15ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液Aの体積を調製し、100ミリメートル培養プレートに対して細胞数が約220万細胞になるように体積を調整する。
5ミリリットルの完全培養液をチューブに加えます。80マイクロリットルのジメチルスルホキシドをチューブに加える。次に、1ミリリットルのPMAあたり1ミリグラムの350マイクロリットルをチューブに追加します。
PMAの最終濃度はミリリットルあたり35ナノグラム、DMSOの最終濃度は0.08%の総容量が10ミリリットルになるように4.27ミリリットルの培地を追加します。チューブの内容物を傾けて混合し、内容物を100ミリメートルの培養プレートに移します。プレートを細胞培養インキュベーターに摂氏37度、5%二酸化炭素で5日間放置します。
インキュベーター内で5日間後、プレートの内容物を120Gで8分間遠心分離して細胞をペレット化し、細胞ペレットを無細胞ウイルス含有上清を回収し、細胞ペレットを廃棄する。再び上清を摂氏4度で90分間16, 000Gで遠心分離し、ウイルス粒子をペレット化した。上清を廃棄し、ウイルスペレットを5ミリリットルの培養液に再懸濁し、ウイルス懸濁液をそれぞれ250マイクロリットルのウイルス懸濁液を含む20本のチューブに分注し、懸濁液を摂氏マイナス80度で保管します。
DNAからタンパク質を分離するには、ウイルス製剤を含むチューブの1つに500マイクロリットルのトリス飽和フェノールを加えます。100マイクロリットルの水とボルテックスをよく加えて、ピンク色のエマルジョンを得ます。9, 650 Gで15分間遠心分離し、上清を集めて新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
冷酢酸ナトリウムの上清量の10分の1に相当する量を加え、上下にピペッティングして混合します。次に、1ミリリットルのグリコーゲンあたり20ミリグラムの1マイクロリットルを加え、ピペッティングで混合します。上清の3倍の量の冷たい100%エタノールを加え、摂氏マイナス80度で一晩保存します。
ウイルスDNA遠心分離機を摂氏4度で15分間9, 650 gで単離する。上清を捨ててDNAペレットを得、ペレットを1ミリリットルの冷70%エタノールで3回洗浄した。再び9, 650 Gで15分間遠心分離し、上清を捨てます。
ペレットを約10分間風乾した後、ペレットを10〜50マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離蒸留水に再懸濁する。サンプルを摂氏マイナス20度で保存して後で処理するか、摂氏4度で一晩保存してDNAを最大限に溶解し、その後マイナス20°Cで保存します。繊細なタスクワイパーでマイクロ分光光度計の台座を洗浄した後、準備されたDNAサンプルを1マイクロリットルロードし、サンプル中のDNAの濃度をメモします。
260〜280ナノメートルと260〜230ナノメートルの両方の吸光度の比率を確認してください。DNAは260ナノメートル、タンパク質は280ナノメートル、フェノールなどの有機物は230ナノメートルで吸収します。リアルタイムPCRには1.8対2の比率で十分と考えられます。
PCR反応ミックスを調製するには、5マイクロリットルのサイバーグリーンリアルタイムPCRミックスを0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。各チューブに、フォワードプライマー1マイクロリットルあたり7.5ピコモルを1マイクロリットル、リバースプライマー1マイクロリットルあたり7.5ピコモルを1マイクロリットル加えます。ここで、EBV低分子RNA2遺伝子が増幅される。
EBVゲノムコピー数を決定する。次に、2マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と1マイクロリットルのウイルスDNAをチューブの1つに加えます。反応混合物の総容量は10マイクロリットルである。
既知のEBVゲノムコピー番号を持つ標準物質として使用される他のチューブを準備します。PCR混合物を、摂氏95度で5分間活性化する最初のステップから始めます。次に、摂氏95度で15秒間、摂氏58度で30秒間40サイクルします。
すべてのデータシートをCSVファイルとしてエクスポートし、標準チューブあたりのEBVゲノムコピー数と平均CQ値のログを計算します。ゲノムコピー数の対数に対して標準のCT値をプロットすることにより、qPCR標準曲線を生成します。標準曲線プロット式を採用して、誘導されたウイルスDNAを含むPCRチューブ内のEBVゲノムコピー数を導出する。
最後に、画面に表示される式を使用して、誘導されたウイルス製剤の濃度を計算します。ここで、Xは標準曲線に由来するEBVゲノムコピーの数であり、FはPCR反応ごとにDNAを設定するために使用される希釈係数です。血球計算盤チャンバーを用いた細胞計数がここに示されている。
4つの象限は、光学顕微鏡を使用してカウントされます。ここでは、青で示されているセルはカウントする必要がありますが、赤で示されているセルは、象限の上、右、下、または左の境界線に接触しているため、カウントしないでください。最も多くのEBV粒子を生成するPMAおよびジメチルスルホキシドの濃度を決定するために、最適化試験が実施された。
DMSO濃度0.8%、PMA濃度35ナノグラム/マイクロリットルが最適であり、EBV濃度が高くなりました。私たちの研究室では、この技術によって生成された重要な粒子を使用して、このウイルスに対する自己免疫または炎症反応を調べました。また、新規抗EBV剤の開発にも取り組んでいます。
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概要
このプロトコルでは、ヒトのP3HR1細胞株からウイルス溶解サイクルを誘導することによって、エプスタイン・バーウイルス粒子を分離することができます。分離されたウイルス粒子は、リアルタイムPCRを使用して定量化できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ウイルス学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- エプスタイン・バーウイルス（EBV）は様々な疾患と関連しています。
- P3HR1細胞株はEBVの研究に有用なモデルです。
- 溶解サイクルの誘導はウイルス分離に重要です。
- リアルタイムPCRはウイルス粒子を定量化するための信頼できる方法です。
研究の目的
- 研究用途のためのEBV粒子の分離。
- ウイルスストックの定量化方法の提供。
- 実験モデルにおけるEBVの使用を容易にすること。
使用された方法
- P3HR1細胞を使用した細胞懸濁液の調製。
- ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）を用いた溶解サイクルの誘導。
- 調製物からのウイルスDNAの抽出。
- リアルタイムPCRを用いたウイルス粒子の定量化。
主要な結果
- P3HR1細胞からのEBV粒子の成功的な分離。
- PCRによって達成されたウイルスストックの定量化。
- 方法の効率性と信頼性の実証。
- in vitroおよびin vivo研究における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルはEBV分離のための簡単な方法を提供します。
- ウイルス粒子の定量化は研究に不可欠です。
- この技術はEBV関連疾患の理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and quantification of Epstein-Barr virus (EBV) from the P3HR1 cell line enables standardized production of viral stocks for mechanistic studies and assay development. This protocol supports predictive confidence in EBV-related research by providing reproducible viral preparations for downstream applications. The method is positioned at the intersection of early discovery and translational research, facilitating portfolio decisions in virology and immunology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EBV-driven pathways in disease-relevant cellular models.
- Supports biological de-risking by providing consistent viral stocks for hypothesis testing.
- Facilitates functional target validation in EBV-associated tumorigenesis studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated EBV preparations for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative outputs through real-time PCR-based viral genome measurement.
- Supports scalable production of viral stocks for compound screening and mechanistic assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying EBV pathogenesis and immune responses.
- Ensures continuity from in vitro discovery to in vivo preclinical validation using standardized viral inputs.
- Reduces biological variability in translational biomarker and therapeutic agent development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying reproducible EBV stocks for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in EBV-related disease models.
- Screening: Delivers assay-ready viral preparations with quantitative genome copy outputs.
- Analytics: Provides real-time PCR data for precise viral quantification and condition comparison.
- Translational Research: Enables risk-adjusted advancement of EBV-targeted interventions using standardized viral inputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for EBV stock preparation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EBV research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable viral stock preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in EBV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EBV-related discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, virology, and quantitative PCR analysis.
- Needs access to cell culture facilities, centrifugation equipment, and real-time PCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of viral induction and quantification protocols.
- Adaptation may be needed for different EBV strains or alternative cell lines.
- Dependent on optimization of induction conditions for maximal viral yield and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:36
Preparing the Plate for Culture
1:49
Induction and Isolation of Epstein-Barr Virus Particles
2:45
DNA Extraction from Viral Particles
4:45
Checking DNA Concentration and Purity
5:34
Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction
7:54
Results: Cell Counting and Induction of P3HR-1 Cells with PMA and DMSO
8:48
Conclusion
