Name: 前臨床心臓リスク評価のためのヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化を評価するハイブリッド96ウェル解析システムを用いた前臨床心臓リスク評価法。電気生理学的パラメータと生存性を同時に測定し、創薬における心臓毒性スクリーニングの効率と信頼性を向上させます。

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この作業は、ドイツ連邦経済気候行動省(ZIM)およびドイツ連邦教育研究省(KMUinnovativ)からの助成金によって支援されました。本研究で使用した心筋細胞を提供してくださった富士フイルムセルラーダイナミクス社(米国ウィスコンシン州マディソン)と心筋細胞を提供してくださったNcardia B.V.(オランダ、ライデン)に感謝します。

注:収縮性とインピーダンス/ EFP測定のワークフローは、 補足図2に記載されています。
1.プレートコーティング
<ol><li>真空シールされたパッケージを開き、96ウェルプレートを取り出します。両モジュールの96ウェルプレートの取り扱い手順は同じです。収縮性モジュールで測定するまで、収縮プレートを追加で供給されたメンブレンガードで覆ったままにします。</li>
	<li>心筋細胞を播種するための柔軟な96ウェルプレートをコーティングします。<ol><li>2.75 mLのEHSゲルすぐに使用できる溶液を滅菌遠沈管に移して、希釈したEHSゲルコーティング溶液を調製します。次に、Ca2+ およびMg2+を含む8.25mLのDPBSを追加します。溶液を注意深く混ぜます。 注:オプションで、フィブロネクチンはウェルのコーティングにも使用できます:650 μLのフィブロネクチンストック溶液(1 μg/mL)を13 mLのDPBSでCa 2+およびMg2+で希釈することにより、滅菌遠心チューブで13 mLのフィブロネクチンコーティング溶液を調製し、50 μg/mLの作業溶液を生成します。溶液を注意深く混ぜます。</li>
	</ol></li>
	<li>コーティング溶液をラボオートメーションロボットに配置された滅菌試薬リザーバーに移します。</li>
	<li>プログラム「ADD100μL」を使用して、ラボオートメーションロボットでウェルあたり100 μLのコーティング溶液を追加します。蓋を96ウェルプレートに戻し、37°Cで3時間インキュベートします。 注意: ラボオートメーションロボットのプログラムは、事前に手動でプリセットする必要があります。</li>
</ol>2. ヒトiPS細胞由来心筋細胞の柔軟な96ウェルプレートへの播種(0日目)
<ol><li>製造元のガイドラインに従ってセルを解凍します。</li>
	<li>手動計数チャンバーで細胞をカウントし、細胞メーカーの指示に従って推奨プレーティング培地(例:1 x 105 細胞/ウェル)で細胞を調整すると、96ウェルプレート全体を播種するために11 x 106 細胞/ 11 mLが得られます。</li>
	<li>プログラム「REMOVE100μL」を使用して、ラボオートメーションロボットでウェルからEHSゲル溶液を取り除きます。分注されたコーティング溶液を含む試薬リザーバーをロボットから取り外します。</li>
	<li>細胞懸濁液(合計11 mL)をラボオートメーションロボットに設置した滅菌試薬リザーバーに移し、プログラム「CELLS_ADD100 μL」を使用して細胞に100 μL/ウェルを播種します。</li>
	<li>細胞播種直後に、フレキシブル96ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度制御)に移し、細胞を一晩沈降させます。</li>
</ol>3. フレキシブル96ウェルプレートの培地交換(1日目)
<ol><li>プレートあたり少なくとも22mLの心筋細胞維持培地を50mL遠沈管で37°Cに温め、プレートを播種してから18〜24時間後。</li>
	<li>新鮮な培地(少なくとも22 mL)を滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットのすぐ隣に置いておきます。空の試薬リザーバーをロボットに入れ、プログラム「REMOVE100μL」で培地除去を行います。その後、廃液を入れた試薬リザーバーをフレッシュ培地を入れた試薬リザーバーと交換し、プログラム「ADD100μL」で1ウェルあたり200μLのフレッシュ培地を分注します。このステップを2回実行して、200 μL/ウェルに到達します。</li>
	<li>培地交換後すぐに、プレートをインキュベーターに戻します。</li>
	<li>化合物が添加されるまで、1日おきに培地交換(200 μL/ウェル)を行います。</li>
</ol>4.化合物添加前の最終培地交換(5-7日目)
<ol><li>化合物添加の4〜6時間前に最終的な培地交換を行います。</li>
	<li>1枚の柔軟な96ウェルプレートに対して少なくとも22 mLのアッセイバッファーを温めます。アッセイバッファーは、維持培地またはその誘導体(例:低/無血清培地、フェノールレッド遊離培地、またはその他の等張バッファー)で構成されています。</li>
	<li>新鮮な培地を滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットのすぐ隣に置いておきます。空の試薬リザーバーをロボットに置き、培地の除去を行います。その後、廃液を含む試薬リザーバーをフレッシュ培地を含む試薬リザーバーと交換し、フレッシュ培地を200 μL/ウェル分注します。</li>
	<li>培地交換後すぐに、フレキシブルプレートをインキュベーターに戻します。</li>
</ol>5.化合物の添加とデータ記録(5〜7日目)
注:実験の測定計画の例を 補足図3に示します。
<ol><li>無菌の通常の深さ96ウェルプレートを使用して、層流フード内の4倍の濃度で化合物あたりの作業溶液を調製します。化合物溶液は、ステップ4で使用したアッセイバッファーに基づく。化合物溶液を含む深さ96ウェルプレートを少なくとも1時間インキュベーターに移し、フレキシブルプレートと同じ状態に調整します。 注:すべての実験に使用される各薬物の1倍の濃度は、図と凡例に記載されています。</li>
	<li>ベースライン測定を行う1時間前にプレートを各測定装置に移す。</li>
	<li>制御ソフトウェア(ハイブリッドセル解析システムの一部)で [プロトコルの編集 ]を開き、それぞれの測定モードの 収縮性またはインピーダンス/ EFPを選択します。</li>
	<li>掃引時間(1回の測定の長さ、30秒など)と繰り返し間隔(測定間の時間、5分など)を定義し、プロトコル番号を保存します。</li>
	<li>[ プロトコルの開始] > [続行 ] を選択し、要求されたフィールドに入力します。</li>
	<li>最後に、[ 測定の開始] を選択します。化合物添加の直前に、5分間隔で最低3回のベースライン測定(スイープ)を実行します。 注:化合物添加前の収縮性モジュールを使用した収縮性ベースライン測定のデータ例は、補足図4に示されています。</li>
	<li>フレキシブルな96ウェルプレートを測定装置から取り外さずに、各ウェルから50 μLのアッセイバッファーを除去します。</li>
	<li>測定計画に従って、50 μLの4倍濃縮化合物溶液をプレートの各ウェルに追加します。</li>
	<li>[領域マーカーの追加]を選択し、複合プレートのレイアウトと、化合物添加後の化合物溶液の体積を定義します。</li>
	<li>最後に、実験計画に従って[ 標準測定 を続行]または [測定シリーズを続行 ]を選択します。</li>
</ol>6.データ分析
<ol><li>記録ソフトウェアでは、長さと繰り返し間隔がユーザーによって定義されるスイープを測定します。</li>
	<li>解析ソフトウェアを使用すると、振幅、ビートレート、パルス幅などのパラメータを自動的に読み取って信号の形状をキャプチャできます。 注:標準偏差を含む平均信号、いわゆる平均拍動は、1回のスイープのデータに基づいて自動的に計算されます。ユーザーは、ソフトウェアが計算して表示する収縮性/IMP/EFPパラメータを定義できます。</li>
	<li>分析ソフトウェアを使用して、各化合物の用量反応曲線とIC50 / EC50を計算します。 注:分析ソフトウェアで生成された生データと分析結果は、さまざまな形式で簡単にエクスポートできます。最後に、実験結果を要約してアーカイブするためのデータレポートが自動的に生成されます。EFP信号が何をどのように測定するかについての包括的な説明は 、17で議論されています。</li>
</ol>

<ol><li>Weaver, R. J., Valentin, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Today%27s+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+%26%2334%3Bmind-the-gap%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &#34;mind-the-gap&#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li>
<li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology%3A+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Validation+studies+and+best+practice+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).</li>
<li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells%3A+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892(2020).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Methods+in+Cardiovascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Cardiac+cell+culture%3A+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).</li>
<li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li>
<li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline+cardiotoxicity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li>
<li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline-induced+cardiotoxicity%3A+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+%28hiPSC-CMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225(2018).</li>
<li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li>
<li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li>
<li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li>
<li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li>
<li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li>
<li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workshop+report%3A+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+cardiac+%C2%B5GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li>
<li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906(2019).</li>
</ol>

B.L.、M.GO.、およびPLは、フレキシブルプレートのメーカーであるinnoVitro GmbHで採用されています。U.T.、E.D.、M.L.、M.Ge.、N.F.、およびS.S.は、ハイブリッドデバイスのメーカーであるNanion Technologies GmbHで雇用されています。

インピーダンス/EFP/収縮性ハイブリッドシステムは、前臨床医薬品開発のための心臓負債のハイスループット安全性薬理学的および毒物学的評価のための包括的な方法論です。動物モデルを使用せずに前臨床安全性試験のための最新のアプローチを提供しますが、時間とコストを大幅に削減するより高いスループット機能を備えています。このシステムは、前臨床の機能的および構造的毒性評価のためのランゲンドルフ心臓および他の動物モデルの補完的なアプローチとして使用される可能性があります。
動物フリーアプローチとして、ハイブリッド系20にはヒトiPSC-CMが採用されている。ここで、ヒトiPSC-CMに対する成熟促進効果を有する特別な柔軟な96ウェルプレートは、スループットと生理学的環境がより成人様のヒト心臓リスク評価のために一意に組み合わされているため、他の細胞ベースのアッセイ21,22と比較して重要な利点を提供する<sup class="xref"...

現代の医薬品開発の主要な目標の1つは、創薬パイプラインにおける新しい治療法のベンチからベッドサイドまでの成功率の向上です。これらの新薬の安全性薬理学的試験では、前臨床段階での薬物減少率のほぼ4分の1を占める心血管系への副作用が明らかになることがよくあります1。新しいアプローチ方法論(NAM)の開発と統合は、前臨床評価、特に心臓などのコアバッテリー器官の近代化において重要な役割を果たします。これらの方法論は動物を使用しないアプローチであるため、人工多能性幹細胞(iPSC)起源の心筋細胞(CM)のようなヒトベースの細胞モデルの使用は、安全性の薬理学的および毒物学的問題の最新の評価のための過去10年間の主力製品になりました2。このような研究に広く使用されているアッセイシステムは、微小電極アレイ(MEA)および電位感受性色素ベースの実験アプローチです3。
それにもかかわらず、この細胞型の表現型および機能的未熟さが主張されていることは、理想的なヒトベースの細胞モデルの障害となり、非臨床試験と臨床試験の間の翻訳ギャップを減らす可能性があります4。
暗黙の未熟な表現型の理由を理解し、ヒトiPSC-CMの成熟プロセスを in vitroで推進する方法を見つけるために、長年にわたって多大な研究が行われてきました。
細胞培養時間の延長、近傍に他の細胞型がない、ホルモン刺激の欠如などの心臓成熟の手がかりの欠如は、成熟プロセスに影響を与えることが示されました5。また、通常の細胞培養プレートの非生理学的環境は、天然のヒト心臓の生理的基質剛性の欠如に起因して、ヒトiPSC-CMの成熟を妨げる重大な原因として同定された5,6。
この問題に取り組むために、典型的な2次元細胞培養の代わりに、細胞が天然の心臓構造に似せて3次元的に整列される3D細胞培養システムを含む、天然の生理学的条件に焦点を当てたさまざまなアッセイシステムが開発されました7。3Dアッセイでは成熟度が向上しますが、熟練した労働力の必要性とこれらのシステムのスループットの低さは、時間とコストが財務レベルでの新しい治療法の評価において基本的な役割を果たすため、医薬品開発プロセスでのこれの豊富な使用を妨げます8。
新しい治療法の安全性薬理学的および毒物学的評価のための重要な読み出しは、心血管系の化合物誘発性副作用が通常これらの特性の一方または両方に影響を与えるため、ヒトiPSC-CMの機能的および構造的特性の変化です1,9。そのような広範な有害反応のよく知られた例は、アントラサイクリンファミリーの抗癌剤である。ここで、心血管系に対する危険な機能的および有害な構造的影響は、患者における癌治療中および治療後、ならびにin vitro細胞ベースのアッセイを用いて広く報告されている10、11。
本研究では、hiPSC-CMに対する機能性および構造的化合物の両方の副作用を評価するための包括的な方法論について説明します。この方法論には、心筋細胞の収縮力の分析とインピーダンス/細胞外電界電位(EFP)分析が含まれます。収縮力は生理学的機械的条件下で測定され、細胞は柔らかい(33 kPa)シリコーン基板上で培養され、天然のヒト心臓組織の機械的環境を反映しています。
このシステムには、前臨床心臓安全性薬理学的および毒物学的研究のためのヒトiPSC-CMのハイスループット分析用の96ウェルプレートが装備されているため、ランゲンドルフ心臓や心臓スライス12,13などの現在使用されている3Dアプローチに利点を提供します。
詳細には、ハイブリッドシステムは、生理学的条件下での心収縮性の評価またはリアルタイムの細胞構造毒性の分析のいずれかのための2つのモジュールで構成されています6,14。どちらのモジュールも、特殊なハイスループット96ウェルプレートで動作し、高速で費用対効果の高いデータ収集を実現します。
3D構造を必要とせずに、収縮性モジュールは、通常の細胞培養プレートが通常構成する硬いガラスやプラスチックの代わりに、細胞の基板として柔軟なシリコーン膜を含む特別なプレートを採用しています。膜は典型的なヒトの生体力学的心臓特性を反映しているため、in vivo条件をハイスループット方式で模倣します。ヒトiPSC-CMは、他の細胞ベースのアッセイでは、化合物誘発陽性変力性に関して成体心筋細胞の挙動を示さないことが多いが14、細胞を収縮性モジュールのプレート上で培養すると、より成体様反応を評価することができる。以前の研究では、iPSC-CMは、イソプロテレノール、S-Bay K8644、またはomecamtiv mecarbil6,15などの化合物で処理すると、正の変力効果を示すことが実証されています。ここでは、収縮力の振幅(mN/mm2)、拍動持続時間、拍動速度などの一次パラメータと、曲線下面積、収縮、緩和勾配、拍動率変動、不整脈などの収縮サイクルの二次パラメータなど、複数の収縮性パラメータを評価することができます(補足図1)16。.すべてのパラメータにおける薬物誘発性の変化は、容量性距離センシングによって非侵襲的に評価される。生データは、その後、専用のソフトウェアによって分析されます。
構造毒性モジュールは、構造細胞毒性および電気生理学的特性の分析の読み出しとして、独自のインピーダンスおよびEFPパラメータを追加します17,18。電気インピーダンス分光法技術は、既知の心毒性化合物で処理されたヒトiPSC-CMで示されているように、細胞密度の化合物誘発性変化または細胞および単層の完全性をリアルタイムで監視します13。異なる周波数(1〜100kHz)でのインピーダンス読み出しにより、生理学的応答をさらに解剖することが可能であり、したがって、膜トポグラフィー、細胞間、または細胞-マトリックス接合部の変化を明らかにすることが達成可能である。ヒトiPSC-CMの追加のEFP記録は、CiPA研究17,19に照らして示されたように、化合物処理によって誘発される電気生理学的効果の分析をさらに可能にします。
本研究では、ヒトiPSC-CMを使用し、心毒性アントラサイクリンとしてよく知られているエピルビシンとドキソルビシン、および心血管毒性のリスクがかなり低いチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)であるエルロチニブで処理しました。エピルビシン、ドキソルビシン、およびエルロチニブによる慢性評価を5日間行った。結果は、細胞をエルロチニブで処理した場合の収縮性と塩基インピーダンスのわずかな変化を示していますが、エピルビシンとドキソルビシンで処理した場合の収縮振幅と塩基インピーダンスの時間および用量依存的な毒性の減少を示しています。カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンを用いて急性測定を行い、収縮振幅、電界電位持続時間、および塩基インピーダンスの減少を示し、機能レベルおよび構造レベルに対するこの化合物の心毒性副作用を示した。

<table><tbody><tr><td>市販のヒトiPS細胞由来心筋細胞&nbsp;</td><td>富士フイルムセルラーダイナミクスインターナショナル(FCDI)</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機(50 mLチューブ)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15878722</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネル調整可能ピペット(100-1250 &mu;L)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td><td>GE Healthcare HyClone</td><td>SH304264.01</td><td></td></tr><tr><td>96 ディープウェルプレート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43075</td><td></td></tr><tr><td>EHS gel</td><td></td><td></td><td>Extracellular Matrix</td></tr><tr><td>Gel FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td><td>Nanion Technologies&nbsp;</td><td>19 1004 1005</td><td>ハイブリッド細胞解析システム&nbsp;</td></tr><tr><td>FLX-96 FLEXcyteセンサープレート</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;フィブロネクチンストック溶液(Geltrexのオプション)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex hESC認定、すぐに使用できる、低成長因子 基底膜マトリックス</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>ヒトiPS細胞由来心筋細胞 プレーティングおよびメンテナンス培地</td><td>FCDI</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター (37 °;C、5% CO2)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51032678</td><td></td></tr><tr><td>NSP-96 CardioExcyte 96 センサープレート 2.0 mm 透明</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1011</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (1250&micro;L)</td><td>Integra Biosciences</td><td>94420813</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>Integra Biosciences</td><td>8096-11</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット(例:25 mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16440901</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル調整可能ピペット(例:100-1000 &mu;L)</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>真空吸引システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15567479</td><td></td></tr><tr><td>オプション VIAFLO ASSIST</td><td>Integra Biosciences</td><td>4500</td><td>ラボオートメーション</td></tr><tr><td>ロボット ウォーターバス (37 °;C)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15365877</td><td></td></tr></tbody></table>

前臨床心臓リスク評価のためのヒトips細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

心臓収縮性の評価は、新しい治療法の開発と臨床段階への安全な移行にとって非常に重要です。ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、創薬および安全性薬理学の前臨床段階においてヒト関連モデルとして機能することが期待されていますが、その成熟度は科学界で依然として議論の余地があり、絶えず開発されています。収縮性とインピーダンス/細胞外電界電位(EFP)のハイブリッド技術を紹介し、業界標準の96ウェルプラットフォームに重要な成熟促進機能を追加します。
インピーダンス/EFPシステムは、セルラー機能をリアルタイムで監視します。収縮細胞の拍動速度に加えて、電気インピーダンス分光法の読み出しは、細胞密度や細胞単層の完全性などの化合物誘発形態学的変化を検出します。ハイブリッド細胞分析システムの他のコンポーネントでは、細胞は、実際の心臓組織の機械的環境を模倣する生体準拠膜上で培養されます。この生理学的環境は、 in vitroでのhiPSC-CMの成熟をサポートし、イソプロテレノール、S-Bay K8644、またはomecamtiv mecarbilによる治療後の陽性変力効果を含む、より成人のような収縮反応をもたらします。収縮力の振幅(mN/mm2)や拍動持続時間などのパラメータも、電気生理学的特性とカルシウム処理に影響を与える化合物の下流効果を明らかにします。
ハイブリッドシステムは、全体的な細胞分析に理想的なツールを提供し、ヒトに関連する細胞ベースのアッセイの現在の視点を超えた前臨床心臓リスク評価を可能にします。

hiPSC-CMの収縮性に対するキナーゼ阻害剤エルロチニブの効果を 図1に示す。細胞を10nMから10μMの範囲の濃度で5日間処理し、拍動パラメータを毎日記録した。EGFR(上皮成長因子受容体)およびチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブは、心毒性のリスクが比較的低く、マイクロモル範囲の濃度でのみhiPSC-CMに対してわずかな用量および時間依存的な影響を及ぼしました。最低濃度(10nM)では、エルロチニブは化合物塗布後の最初の測定(1時間)で統計的に有意でない振幅の減少を誘導した。その後のすべての測定において、この濃度で同等の効果は測定されなかった。一時的な減少は、複合効果の結果である可能性がありますが、複合添加手順中のビートパターンの一時的な歪み、たとえば熱的または機械的性質の結果でもあります。エルロチニブのマイクロモル濃度は、わずかではあるが有意な時間および用量依存的な心毒性効果を示した。効果の発現は1 μMのエルロチニブで96時間から見られましたが、10 μMは化合物添加後わずか24時間で有意な減少をもたらしました。
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ヒトiPS細胞由来心筋細胞の収縮機能や細胞完全性の変化の解析は、非臨床医薬品開発にとって非常に重要です。ハイブリッド96ウェル細胞解析システムは、両方のパラメータをリアルタイムかつ生理学的な方法で処理し、臨床段階への安全な移行に必要な信頼性の高いヒト関連の結果を実現します。

前臨床心臓リスク評価のためのヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

この方法は、新薬候補を臨床段階に安全に移行するための実際のヒトベースのデータを使用して、前臨床心臓の安全性と毒性に関連する質問に答えるのに役立ちます。このハイブリッドシステムの主な利点は、一連の異なるインビトロおよびインビボ技術を使用する代わりに、ヒトiPC由来の心筋細胞、電気生理学的および生存率パラメータの同時評価、および生理学的条件下での収縮特性の分析です。この方法は、心筋細胞の電気生理学的、構造的、収縮的変化と、69ウェルの同時試験を可能にするハイスループットシステムをカバーするため、創薬に適用できます。プレートコーティングを開始するには、収縮性モジュールで測定するまで、収縮プレートの底部を追加供給のメンブレンガードで覆ったままにします。心筋細胞を播種するには、2.75ミリリットルのEHSゲルのすぐに使用できる溶液と8.25ミリリットルのDPBSをカルシウムとマグネシウムを含む滅菌遠心チューブに移して、希釈したEHSゲルコーティング溶液を調製します。それから溶液を混ぜる。収縮プレートからメンブレンガードを取り外します。調製したコーティング液をラボオートメーションロボットの滅菌試薬リザーバーに移します。プログラムを使用して、ラボオートメーションロボットで100マイクロリットルを追加し、ウェルごとに100マイクロリットルのコーティング溶液を追加します。次に、蓋を96ウェルプレートに戻し、摂氏37度で3時間インキュベートします。細胞を解凍してカウントした後、細胞メーカーの指示に従って推奨プレーティング培地で細胞を調整し、96ウェルプレート全体を播種するために11ミリリットルあたり10〜6番目の細胞を11倍にします。プログラムを使用して100マイクロリットルを除去し、ラボオートメーションロボットでウェルからEHSゲル溶液を除去します。次に、11ミリリットルの細胞懸濁液をラボオートメーションロボットに設置した滅菌試薬リザーバーに移し、ウェルあたり100マイクロリットルの懸濁液を細胞に播種します。プログラムを使用して、セルは100マイクロリットルを追加します。細胞播種直後に、柔軟な96ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の湿度制御インキュベーターに移し、細胞を一晩沈降させます。各プレートに添加する心筋細胞維持培地22ミリリットルを50ミリリットルの遠沈管で摂氏37度に温める。プレートを播種してから18〜24時間後に、新鮮な培地を滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットの横に置いておきます。次に、プログラムで培地の除去を実行し、100マイクロリットルを除去します。次に、新鮮な培地を含む試薬リザーバーをラボオートメーションロボットに入れ、プログラムでウェルあたり200マイクロリットルの新鮮な培地を分注し、100マイクロリットルを追加します。このステップを2回実行して、ウェルあたり200マイクロリットルに到達します。培地交換直後に、プレートをインキュベーターに移します。化合物添加まで1日おきに培地交換を行う。化合物添加の4〜6時間前に、22ミリリットルの新鮮で温かいアッセイバッファーを滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットの横に置いたままにして、最終的な培地交換を行います。培地交換直後にフレキシブルプレートをインキュベーターに戻します。ベースライン測定の1時間前に、プレートをそれぞれの測定装置に移します。制御ソフトウェアで[プロトコルの編集]を開き、それぞれの測定モード、フレックスサイト、またはインピーダンスEFPを選択します。プロトコル番号を保存する前に、1回の測定のスイープ期間または長さを30秒に、繰り返し間隔を10分に定義します。次に、[プロトコルの開始]を選択し、要求されたフィールドに入力し続けます。パラメータを設定したら、[測定の開始] を選択します。化合物添加の直前に、5分間隔で最低3回のベースライン測定を実行します。可撓性96ウェルプレートを測定装置から取り出すことなく、各ウェルから50マイクロリットルのアッセイバッファーを除去し、続いて、測定計画に従ってプレートの各ウェルに50マイクロリットルの4倍濃縮化合物溶液を添加した。コンパウンド添加後、[試薬マーカーの追加]を選択して、コンパウンドプレートのレイアウトとコンパウンド溶液の容量を定義します。次に、実験計画に従って標準測定を続行するか、測定シリーズを続行を選択します。代表的な分析は、ヒトiPS細胞由来心筋細胞の収縮性に対するキナーゼ阻害剤エルロチニブの効果を示しています。最低濃度では、エルロチニブは統計的に有意でない振幅の減少を誘発したが、エルロチニブのマイクロモル濃度は時間および用量依存的な心毒性効果を示した。効果の発現は、1マイクロモルのエルロチニブで96時間から見られましたが、10マイクロモルのエルロチニブで処理すると、化合物添加後24時間で有意な減少が見られました。.10マイクロモルのエピルビシンの適用後、細胞は24時間以内に拍動を停止した。1マイクロモルのエピルビシンを適用すると、24時間後に振幅が劇的に減少し、その後48時間まで完全に拍動が停止しました。.100ナノモルでは、拍動振幅の時間依存的な減少が観察された。10ナノモルの最低濃度では、振幅は着実に変動し、エピルビシンの効果が用量依存的であることを確認した。ドキソルビシンとニフェジピンによる24時間の治療は、濃度と時間に依存する方法で細胞の生存率を低下させます。.増加したニフェジピン濃度を適用すると、細胞上の電界電位記録は、正規化された野外持続時間の濃度依存的な短縮を明らかにする。心収縮性に関するニフェジピンの評価も、10ナノモルおよび13ナノモル濃度の急性測定時に有意な濃度依存振幅減少を示しました。.細胞は一般に、温度やpHの変化などの環境パラメータや、収縮プレートで特にサポートされている機械的シミュレーションに敏感であることを覚えておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

人工多能性幹細胞（hiPSC）が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。...

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

幹細胞は、人間の心臓の生理学および薬理学の有用なモデル人間誘導された多能性から派生した心筋細胞の分離を自発的に契約です。周波数を破って、Ca 感受性蛍光色素と温度制御のイメージング ウェル プレート リーダーを使用してに外因性の化合物の効果を定量化するハイスループットス クリーニング...

人間-iPSC 由来心筋細胞分離の収縮測定 384 ウェル プレートの温度制御の Ca 感受性蛍光色素

ここでは、堅牢なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を一貫して生成し、その機能を特徴付ける方法を記述し、検証する。これらの技術は、シグナル伝達経路に対する機械的洞察を開発するのに役立ち、大規模な薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供し、心臓疾患を確実にモデル化する。...

カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。...

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルを、虚血による組織損傷の定量的評価方法と共に提示する。このモデルは、薬物スクリーニングおよび虚血性心疾患に関するさらなる研究のための有用なプラットフォームを提供することができる。...

hiPSC由来心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルと心筋細胞収縮の映像的比較

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。...

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。...

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro...

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

学ぶ ヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化を評価するハイブリッド96ウェル解析システムを用いた前臨床心臓リスク評価法。電気生理学的パラメータと生存性を同時に測定し、創薬における心臓毒性スクリーニングの効率と信頼性を向上させます。

前臨床心臓リスク評価のためのヒトiPS細胞由来心筋細胞の構造・収縮変化評価のためのハイブリッド細胞解析システム

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