Name: ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2-デオキシウリジン標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumにおける幹細胞様細胞の蛍光in situハイブリダイゼーションとEdU標識法。単一細胞レベルで増殖細胞と非増殖細胞を区別し、幹細胞の異質性を解明する。

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本研究は、AMEDの課題番号JP22gm6110025(Y.N.宛)およびJSPS科研費22H02762(Y.N.宛)の支援を受けて行われました。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. プローブ合成
<ol><li>RNA抽出<ol><li>人工海水(ASW)で培養した生きたクラ ドネマ ・メデューサ3種を、先端を切り落とした3.1mLトランスファーピペットを用いて1.5mLチューブに入れ、できるだけ多くのASWを除去します。 注:ASWは、ミネラル塩の混合物を水道水に塩素中和剤で溶解することによって調製されます。最終的な比重(SG)は1.018または1000分の1(ppt)は~27です。</li>
		<li>1.5 mLチューブを液体窒素で凍結して、RNase活性を阻害します。2-メルカプトエタノール(1 μL/100 μLの溶解バッファー)を添加したトータルRNA単離キットから30 μLの溶解バッファーを追加し、ホモジナイザーを使用して溶解バッファーでサンプルをホモジナイズします。 注:バッファーとサンプルがチューブからオーバーフローするのを防ぐために、少量の溶解バッファーによる均質化をお勧めします。</li>
		<li>570 μLの溶解バッファーを加え、トータルRNAアイソレーションキットのプロトコルに従ってトータルRNAを抽出します(図1)。</li>
		<li>抽出したRNAの濃度を分光光度計で測定し、使用するまで-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>cDNA合成<ol><li>キットを用いて、メデューサから抽出した全RNAを鋳型としてcDNAを合成する(図 1及び 表1)。</li>
		<li>65°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>氷の上で急速に冷却します。</li>
		<li>ステップ1.2.1の混合物を用いてcDNA合成を行う(表1)。ピペッティングで十分に混合し、42°Cで60分間インキュベートします。</li>
		<li>95°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>氷の上で急速に冷却します。</li>
		<li>分光光度計を使用して合成されたcDNAの濃度を測定し、使用するまで-20°C以下で保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>PCR産物合成<ol><li>PCRテンプレートを作成するには、プライマー-BLASTを使用して特定のプライマーを設計します。NCBIデータまたはRNA-seqデータから参照配列を調達します。 注:このプロトコルで使用されるプライマーについては、 材料表 を参照してください。</li>
		<li>標的配列を増幅するには、制限酵素の使用を必要としないTAクローニングを行う。3'末端にアデニンが付加されたPCR産物を得るには、次の設定を使用します:98°Cで2分間;98°Cで10秒間、55-60°Cで30秒間、72°Cで1分間の35サイクル。 反応にはTaq DNAポリメラーゼを使用してください(表1)。 注:PCR条件を決定するには、使用するDNAポリメラーゼに付属のプロトコルに従い、一般的に推奨されるアニーリング温度と延長時間を提供します。</li>
		<li>PCR産物を1%アガロースゲルに通し、目的のバンドを切り取ります。ゲル抽出キットを使用して、カットゲルからPCR産物を抽出します。</li>
	</ol></li>
	<li>結紮<ol><li>試薬を混合し(表1)、37°Cで30分間インキュベートすることにより、PCR産物を3'チミンオーバーハングでベクターにリゲートします(図1)。 注:ベクター:PCRの分子比は1:>3である必要があります。pTA2 のベクトル サイズは約 3 KB です。PCR産物(インサート)がA(kb)およびB(ng/μL)の場合、採取されるインサート( 表1のX)の容量は、([50 ngのベクター×1 kbのインサート])/(3 kbのベクター×[1/3])= 50·挿入のng。インサートの濃度がB ng / μLの場合、採取量は50·A/B μLのインサート。</li>
	</ol></li>
	<li>変態とめっき<ol><li>形質転換のために、コンピテントセルを氷上で解凍し、それぞれ20 μLのアリコートに分注します。PCR産物(コンピテントセルボリュームの5%未満)を含むプラスミドを1 μL加え、ボルテックスを1秒間加えます。氷上で5分間インキュベートした後、42°Cで45秒間インキュベートし、1秒間ボルテックスします。</li>
		<li>カタボライト抑制(SOC)培地(栄養豊富な細菌培養培地)を含む180 μLのスーパーオプティマルブロスをコンピテントセルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。30分後、コンピテントセルをアンピシリン、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)、イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む寒天プレートに広げ、37°Cで12〜16時間インキュベートします(図1)。 注:X-galとIPTGは、青と白のコロニーを選択するために使用されます。</li>
	</ol></li>
	<li>液体培養<ol><li>プレート上の白と青のコロニーから白いコロニーを選びます。それをアンピシリンを含む3〜5 mLのLB培地に加え、シェーカーで37°Cで12〜16時間インキュベートします(図1)。</li>
	</ol></li>
	<li>ミニプレップ<ol><li>プラスミドミニプレップを用いてLB培地からプラスミドを抽出します(図1)。</li>
		<li>分光光度計を用いてプラスミド濃度を定量する。</li>
	</ol></li>
	<li>シーケンスを読みます。<ol><li>プラスミドのDNA配列を読み取るには、サンガーシーケンシングのためにプラスミドを送り、ソフトウェアを使用してゲノム/トランスクリプトーム配列とアラインメントし、ターゲット配列が適切に合成されているかどうかを確認し、ターゲット配列がプラスミドに挿入される方向(5'から3'または3'から5')を評価します。 注:標的配列が3'末端近くのRNAポリメラーゼ結合部位から5'〜3'方向にプラスミドに挿入されている場合、アンチセンスプローブは in vitro 転写によって生成できます。ターゲット配列が逆の3'〜5'方向に挿入されると、センスプローブ(ネガティブコントロール)を生成できます。pTA2などのベクターを用いる場合、目的に応じて2つの転写結合部位を用いることができる。</li>
	</ol></li>
	<li>インビトロ 転写<ol><li>プラスミド内のRNAポリメラーゼ結合部位(T7/T3結合部位など)の外側のプライマーを用いてPCRを行うことにより、作成したプラスミドからDNA鋳型を調製します(図1)。 注:M13-20フォワードプライマーやM13リバースプライマーなどのユニバーサルプライマーを使用して、RNAポリメラーゼ結合部位を含むDNAテンプレートを調製できます。</li>
		<li>PCR増幅後にゲル/PCR抽出キットを使用してテンプレートを精製します。</li>
		<li>以下に示す試薬を混合し、37°Cで3時間転写反応を行う(図 1及び 表1)。</li>
		<li>1.5 μLのDNaseを添加し、37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>RNaseフリーの水10 μLを加え、クリーンアップカラムを使用して転写反応溶液からプローブを精製します。</li>
		<li>1%アガロースゲルに1 μLをロードして合成したRNAのサイズを確認し、分光光度計を使用して濃度を決定します。 注:合成されたRNAプローブの濃度は少なくとも100 ng / μLである必要があります。</li>
		<li>ホルムアミドを30 μL添加し、-20°C以下で保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. EdUの組み込みと固定
<ol><li>3.5 mLトランスファーピペットを使用して、 Cladonema medusae(チューブあたり5〜10匹)を1.5 mLチューブに入れ、ASWを総容量500 μLまで加えます。 7.5 μLの10 mM EdUストック溶液を加え、サンプルを22°Cで1時間インキュベートします(図2)。EdUの最終濃度は150μMです。 注意: 5〜7日齢のメデューサを使用して、3番目の枝の形成を監視します(図3A)。メデューサがポリープから剥離する日は1日目としてカウントされ、5日目に、メデューサは通常、主触手に3番目の枝を示し始めます。</li>
	<li>1時間後、EdUを含むASWをできるだけ多く取り除きます。</li>
	<li>メデューサを麻酔するには、H 2 Oに7%MgCl2を加え、5分間インキュベートします。</li>
	<li>H2O中の7%MgCl2を除去し、ASW中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いてメデューサを4°Cで一晩固定します(図2)。 注:EdUを組み込まずにFISHを実行する場合、麻酔後にEdUで処理されたものと同様にサンプルを固定できます(ステップ2.3-2.4)。</li>
</ol>3. 蛍光in situ ハイブリダイゼーション
<ol><li>プロテイナーゼ処理と固定後<ol><li>PFAを取り出し、0.1%トゥイーン-20(PBST)を含むPBSでサンプルを3 x 10分間洗浄します。洗浄ごとに300〜500μLのPBSTを使用してください。 注:このステップからハイブリダイゼーションの終わりまで、実験は手袋とマスクを着用してRNaseフリー環境で実行する必要があります。このステップの1x PBSは、DECC処理水で作成する必要があります。ハイブリダイゼーション後、DEPC処理なしで水で作った1x PBSを使用できます。一部のISHおよびFISHプロトコルでは、メタノールステップを使用してサンプルを脱水するため、固定サンプルを-20°Cで使用まで保存できます。余分な作業を避けるために、特にサンプルをPBSTに数日間保持できるため、脱水プロセスはこのプロトコルから省略されています。</li>
		<li>固定後、抗DIG-POD抗体O.N.インキュベーションステップ(ステップ3.4.2)を除き、サンプルをシェーカー上の1.5 mLチューブに入れます。洗浄後、PBST中のプロテイナーゼKストック溶液10 mg/mLを加え、メデューサをプロテイナーゼK(最終濃度:10 μg/mL)とともに37°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>プロテイナーゼK溶液を除去し、PBSTでサンプルを2 x 1分間洗浄します。</li>
		<li>メデューサをポストフィックスするには、1x PBSに4%PFAを加え、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>PFA溶液を取り出し、PBSTでサンプルを2 x 10分間洗浄します。 注:標的遺伝子が低バックグラウンドシグナルで高発現している場合は、ステップ3.1.2〜3.1.5をスキップできます。</li>
	</ol></li>
	<li>雑種形成<ol><li>PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファー(HBバッファー、 表1)を追加します。サンプルをHBバッファー中で室温(RT)で15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションを成功させるのに十分な容量を提供する300〜400 μLのHBバッファーを使用してください。 注:HBバッファー、洗浄バッファー1、および洗浄バッファー2は、20x SSCストックで調製されます。HBバッファーは-20°C以下で保存されており、使用前にRTに持ち込む必要があります。</li>
		<li>HB バッファを削除し、新しい HB バッファを追加します。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で55°Cで少なくとも2時間プレハイブリダイズする。</li>
		<li>HBバッファーを除去し、ステップ1.9.7で保存したプローブを含むHBバッファーでインキュベートします(最終プローブ濃度:HBバッファー中の0.5-1 ng / μL)。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で55°Cで18〜24時間ハイブリダイズする(図2)。 注:FISHシグナルの強度と特異性は、ターゲット遺伝子の発現、プローブの長さと特異性によって異なる場合があります。強度を上げるために、ハイブリダイゼーション期間(18〜72時間)や温度(50〜65°C)などのパラメータを調整し、さまざまなプローブを試験することができます。非特異的シグナルを回避するために、プロテイナーゼK処理(濃度および持続時間)を改変することができる19。</li>
	</ol></li>
	<li>プローブの取り外し<ol><li>プローブを含むHBバッファーを取り外し、洗浄バッファー1を追加します(表1)。サンプルを洗浄バッファー1で55°Cで2 x 15分間洗浄します。 300〜400μLの洗浄バッファーを使用してください。 注:プローブを含むHBバッファーは、最大約10回まで繰り返し使用できます。廃棄する代わりに、使用済みのHBバッファーを含むプローブを-20°C以下に保管してください。 使用前に、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2、2x SSC、およびPBSTを55°Cで予熱します。</li>
		<li>洗浄バッファー1を除去し、次に洗浄バッファー2を追加します(表1)。サンプルを洗浄バッファー2で55°Cで2 x 15分間洗浄します。</li>
		<li>洗浄バッファー2を取り外し、次に2x SSCを追加します。サンプルを2x SSCで55°Cで2 x 15分間洗浄します。</li>
		<li>2x SSCを取り外し、予熱したPBSTを追加します。サンプルをRTでPBSTで1 x 15分間洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>抗DIG抗体インキュベーション<ol><li>PBST を削除し、1% ブロッキング バッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、RTで少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。 注:5%ブロッキングバッファーストックを希釈して、1%ブロッキングバッファーを新たに調製します(表1)。振とうの結果としてサンプルが蓋の後ろや壁にくっつく傾向があるため、次の抗体反応の前にサンプルを確認してください。</li>
		<li>ブロッキング後、1%ブロッキングバッファーを除去し、抗DIG-POD溶液(1:500、1%ブロッキングバッファー中)を添加し、サンプルO.N.を4°Cでインキュベートします(図2)。 注意: 非特異的シグナルの検出を防ぐために、インキュベーション時間を12〜16時間以内に保つように注意してください。</li>
	</ol></li>
	<li>DIG標識プローブの検出<ol><li>アンチ DIG-POD ソリューションを削除し、トリス-NaCl-トゥイーンバッファーを追加します(TNT、 表 1)。サンプルをTNTでRTで3 x 10分間洗浄します。 注:チラミドシグナル増幅(TSA)技術を使用すると、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識試薬(抗DIG-PODなど)に対する解像度の高い画像が得られます。</li>
		<li>蛍光色素結合チラミド(Cy5-チラミド)ストック溶液(1:50)を増幅希釈バッファーで希釈し、活性Cy5-チラミド溶液を作ります(図2)。</li>
		<li>できるだけ多くのTNTを除去してから、活性Cy5-チラミド溶液を追加します。サンプルを暗所で10分間インキュベートします。</li>
		<li>サンプルをPBSTで暗所で3 x 10分間洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>EdUの検出 注:EdUキットは、組み込まれたEdUを蛍光シグナルとして検出します(図2)。<ol><li>EdU検出カクテルを調製するには、 表1に示すように成分を混合します。各サンプルに100 μLのEdU検出カクテルを使用してください。 注:10倍反応緩衝液添加剤を超純水で希釈して、1x反応緩衝剤を準備します。</li>
		<li>PBST を削除してから、EdU 検出カクテルを追加します。暗闇の中で30分間インキュベートします。</li>
		<li>暗所でPBSTで3 x 10分間洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>DNA染色<ol><li>ヘキスト33342(1:500)をPBSTで希釈して、ヘキスト溶液を調製します。PBST を削除し、ヘキスト ソリューションを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします(図2)。</li>
		<li>暗所で3〜4 x 10分間PBSTでサンプルを洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>マウンティング<ol><li>サンプルが押しつぶされるのを防ぐために、スライドガラスにバンクを作ります。スライドガラスにビニールテープを貼り、中央をくり抜きます。</li>
		<li>チップを切り落とした状態で3.1 mLトランスファーピペットを使用して、メデューサをスライドガラス上のバンクに移します。 注意: 触手が重ならないように注意してください。</li>
		<li>P200ピペットでPBSTをすべて取り出し、封入剤として70%グリセロールをゆっくりと加えます(図2)。 注:70%グリセロールの代わりに、退色防止封入剤を使用して蛍光の退色を防ぐことができます。</li>
		<li>鉗子でメデューサの上にカバーガラスをそっと置き、カバーガラスの側面を透明なマニキュアで密封します。</li>
		<li>すぐに顕微鏡観察を行わない場合は、スライドを暗所で4°Cに保ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>イメージング<ol><li>レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。シングルセル解像度の場合は、40倍のオイルレンズまたは高倍率のレンズを使用します。</li>
		<li>画像取得後、ImageJ/FIJIソフトウェアを使用して画像を開き、マルチポイントツール20でEdU+および/またはNanos1+に陽性のセルをカウントします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は開示する利益相反を持っていません。

増殖細胞および幹細胞は、形態形成、成長、および再生などの様々な過程において重要な細胞源である21,22。この論文では、クラドネマメデューサにおけるFISHおよびEdU標識によって幹細胞マーカーNanos1を共染色する方法について説明しています。EdUまたはBrdU標識を用いた以前の研究では、増殖細胞が触手球根に局在することが示唆されています16,17が、それらの分子特性は不明でした。本研究は、増殖細胞の分布とNanos1+幹細胞様細胞の局在を同時に決定することを示しています(図4)。結果は、いくつかの増殖細胞がNanos1を発現しているが、他の細胞はEdUのみでマークされており、Nanos1を発現していないことを示しており、幹細胞の不均...

刺胞動物は、神経と筋肉を持つ動物を含む基本的に分岐した後生動物門と考えられており、動物の発生と生理学の進化を理解するためのユニークな位置にあります1,2。刺胞動物は2つの主要なグループに分類されます:アントゾア(イソギンチャクやサンゴなど)はプラヌラ幼虫と固着性ポリープステージのみを持っていますが、メドゥソゾア(ヒドロゾア、スタウロゾア、シフォゾア、キュボゾアのメンバー)は通常、遊泳するメデューサ、またはクラゲ、およびプラヌラの幼虫とポリープの形をとります。刺胞動物は一般的に高い再生能力を示し、その根底にある細胞メカニズム、特に成体幹細胞と増殖細胞の所有が大きな注目を集めています3,4。Hydraで最初に同定されたヒドロ虫幹細胞は、外胚葉上皮細胞間質間質に位置し、一般に間質細胞またはi細胞と呼ばれます3。
ヒドロ虫i細胞は、多能性、広く保存されている幹細胞マーカー(Nanos、Piwi、Vasaなど)の発現、および遊走の可能性3,5,6,7,8を含む共通の特徴を共有しています。機能的な幹細胞として、i細胞はヒドロ虫動物の発生、生理学、環境応答に広く関与しており、その高い再生能力と可塑性を証明しています3。幹細胞は、i細胞と同様に、ヒドロ虫以外では同定されていませんが、確立されたモデル種である線虫でさえ、増殖細胞は依然として体細胞組織および生殖系列の維持と再生に関与しています9。刺胞動物の発生と再生に関する研究は、主にヒドラ、ヒドラクチニア、ネマトステラなどのポリープ型動物で行われてきたため、クラゲ種の幹細胞の細胞動態と機能はほとんど取り上げられていません。
ヒドロ虫クラゲ Clytia hemisphaerica は、地中海や北米を含む世界中で異なる生息地を持つ国際的なクラゲ種であり、いくつかの発生および進化研究で実験モデル動物として利用されています10。サイズが小さく、取り扱いが簡単で卵が大きいため、 Clytia は実験室でのメンテナンスや、最近確立されたトランスジェネシスやノックアウト法などの遺伝ツールの導入に適しており11、クラゲの生物学の根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な分析の機会を開きます。 Clytia medusa触手では、i細胞は球根と呼ばれる近位領域に局在し、線虫などの前駆細胞は線虫細胞を含む異なる細胞型に分化しながら遠位先端に移動します12。
クラゲの口腔器官であるClytia manubriumの再生中に、生殖腺に存在するNanos1+ i細胞は、損傷に応答してマヌブリウムが失われる領域に移動し、マニュブリウム7の再生に関与します。これらの知見は、Clytiaのi細胞が、形態形成と再生に関与する機能的な幹細胞としても振る舞うという考えを支持している。しかし、ヒドラやヒドラクチニア3などの代表的なポリープ型動物ではi細胞の性質が異なることから、クラゲ種間で幹細胞の特性や機能が多様化している可能性があります。さらに、Clytiaを除いて、他のクラゲの実験技術は限られており、増殖細胞と幹細胞の詳細な動態は不明です13。
ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、ウォーターポンプやろ過システムなしで実験室環境で保管できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは、クラドネマ科に共通する特徴である枝分かれした触手と、球根14近くの外胚葉層に卵子と呼ばれる光受容体器官を持っています。触手分岐プロセスは、触手の軸方向に沿って現れる新しい分岐部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端15に向かって押し出されます。さらに、クラドネーマの触手は切断後数日以内に再生する可能性があります。最近の研究では、クラドネーマの触手の分岐と再生における増殖細胞と幹細胞のような細胞の役割が示唆されています16,17。しかし、従来のin situハイブリダイゼーション(ISH)は、クラドネーマの遺伝子発現を可視化するために利用されてきましたが、分解能が低いため、幹細胞の動態を細胞レベルで詳細に観察することは現在のところ困難です。
この論文では、FISHによってクラドネーマの幹細胞様細胞を可視化し、細胞増殖のマーカーであるEdUと共染色する方法について説明しています18。幹細胞マーカー5,17であるNanos1の発現パターンをFISHで可視化することで、幹細胞様細胞の分布を1細胞レベルで同定することができます。さらに、Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方をモニタリングするこの方法は、クラドネーマにおける触手の分岐、組織の恒常性、臓器再生など、幅広い研究分野に適用でき、同様のアプローチは他のクラゲ種にも適用できます。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>和光</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>3.1 mL トランスファーピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシド (X-Gal)</td><td>和光</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>抗 DIG-POD</td><td>ロシュ</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>クラドネマ パシフィカム ナノス1 フォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>クラドネマ・パシフィカム ナノス1リバースプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi フォワード プライマー</td><td></td><td></td><td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwiリバースプライマー5</td><td></td><td></td><td>'-GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>Click-iT EdU 細胞増殖イメージング用キット、Alexa Fluor 488 色素</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10337</td><td>EdUキット</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>N / A</td><td>塩素中和剤</td></tr><tr><td>DIG核酸検出キットブロッキング試薬</td><td>ロシュ</td><td>11175041910</td><td>ブロッキングバッファー&nbsp;</td></tr><tr><td>DIG RNA標識ミックス&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOSコンピテントセルDH5&alpha;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>コンピテントセル</td></tr><tr><td>Fast遺伝子 Fast遺伝子ゲル/PCR抽出キット</td><td>Fast遺伝子</td><td>FG-91302</td><td>ゲル抽出キット</td></tr><tr><td>Fast遺伝子プラスミドミニキット</td><td>Fast遺伝子</td><td>FG-90502</td><td>プラスミドミニプレップ</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>和光&nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>豚由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル-&β;-D(-)-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>和光</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>寒天板</td></tr><tr><td>LB Broth Base</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB 中</td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>和光</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini Quick spin RNA カラム</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>クリーンアップコラム</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>和光&nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC 微量 UV-Vis 分光光度計 Wi-Fi Thermo</td><td>Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノラウレート (Tween-20)</td><td>和光&nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>パワーマッシャー2</td><td>ニッピ&nbsp;</td><td>891300</td><td>ホモジナイザー</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>ナカライ テスク&nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74004</td><td>total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 クエン酸ナトリウム バッファー 20x 粉末 (20x SSC)</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>ミネラル塩</td></tr><tr><td>T3 RNA ポリメラーゼの混合物&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>ハイブリダイゼーションインキュベーター</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st鎖cDNA合成キット</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td><td>cDNA合成キット</td></tr><tr><td>ターゲットクローン</td><td>東洋紡&nbsp;</td><td>TAK101</td>、<td>pTA2</td></tr>、<tr><td>ベクターtRNA</td>、<td>ロシュ</td><td>10109541001</td><td></td></tr>、<tr><td>TSAプラス、シアニン5</td>、<td>アコヤバイオサイエンス、</td><td>NEL745001KT</td><td>チラミド信号増幅(TSA)技術</td></tr>、<tr><td>ツァイスLSM、880</td><td>、ゼイス</td><td>、N/A</td><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td></tr></tbody></table>

ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光in situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

イソギンチャク、サンゴ、クラゲなどの刺胞動物は、固着性ポリープや自由に泳ぐメデューサに現れる多様な形態とライフスタイルを示します。 ヒドラ や ネマトステラなどの確立されたモデルに例示されるように、幹細胞および/または増殖細胞は刺胞動物ポリープの発生と再生に寄与します。しかし、ほとんどのクラゲの根底にある細胞メカニズム、特にメデューサの段階はほとんど不明であるため、特定の細胞タイプを特定するための堅牢な方法を開発することが重要です。この論文は、ヒドロ虫クラゲ Cladonema pacificumにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコルを記載する。 Cladonema medusaeは、成体期を通じて継続的に成長し、再生能力を維持する分岐触手を備えており、増殖細胞および/または幹細胞様細胞によって調整される細胞メカニズムを研究するための独自のプラットフォームを提供します。幹細胞マーカーを用いたホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は幹細胞様細胞の検出を可能にし、S期マーカーである5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)によるパルス標識は増殖細胞の同定を可能にします。FISH標識とEdU標識を組み合わせることで、固定動物で活発に増殖している幹細胞を検出することができ、この手法は非モデルクラゲ種を含む他の動物にも広く適用できます。

クラドネーマ触手は、形態形成と再生の細胞プロセスを研究するためのモデルとして使用されています15,16,17。触手構造は、触手球と呼ばれる近位領域に幹状細胞(i細胞)が位置する上皮管で構成され、鰗茎の遠位領域の後部に軸側に沿って新しい枝が順次追加されます(図3A)15。以前の報告では、細胞増殖は触手球と新しい分岐部位の両方で、EdUまたはBrdU標識のいずれかを使用して活発であることが示されています16,17。しかし、in situハイブリダイゼーションの分解能により、幹細胞様細胞が本当に増殖性であるかどうかは不明である。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方を細胞レベルで同時に可視化するために、同じサン...

ここでは、クラゲ クラドネーマにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコールについて述べる。幹細胞マーカーとのホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーションは幹細胞様細胞の検出を可能にし、5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識は増殖細胞の同定を可能にします。一緒に、活発に増殖している幹細胞様細胞を検出することができる。

ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。クラゲクラドネマの単一細胞レベルで幹細胞の分布を特定できます。同じクラゲサンプル中の幹細胞様細胞と増殖細胞を可視化することができ、増殖性幹細胞と非増殖性幹細胞の検出が可能となり、幹細胞の不均一性の理解につながります。幹細胞を含む動物モデルを用いた発生生物学・再生研究ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、特別なシステムなしで実験室環境で維持できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは枝分かれした触手を持っています。分岐は、触手の軸方向に沿った新しい部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端に向かって押し出されます。触手は切断後数日以内に再生することもできます。サイズが小さく、取り扱いが簡単で、成体幹細胞または幹細胞様細胞が存在するため、クラドネーマはさまざまなプロセスにおける幹細胞の役割を調査するのに適したシステムです。まず、3.5ミリリットルのトランスファーピペットを使用してCladonema medusaeを1.5ミリリットルのチューブに入れ、ASWを最大500マイクロリットルまで加えます。7.5マイクロリットルの10ミリモルEdUストック溶液を加え、サンプルを摂氏22度で1時間インキュベートします。1 時間待ってから、EdU を含む ASW をできるだけ多く削除します。メデューサを麻酔した後、5分間インキュベートします。ASWに4%パラホルムアルデヒドを入れて摂氏4度で一晩メデューサを固定します。プロテイナーゼ処理および固定後、パラホルムアルデヒドを除去し、0.1%Tweenを含むPBSでサンプルを20回ずつ10分間洗浄します。PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファーを追加します。サンプルをハイブリダイゼーションバッファー中で室温で15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新鮮なハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で少なくとも2時間摂氏55度でプレハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーと共にインキュベートします。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で摂氏55度で18〜24時間ハイブリダイズする。次に、プローブの取り外しに進みます。プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーを除去することから始め、次に洗浄バッファー1を追加します。サンプルを洗浄バッファーで摂氏55度で15分間2回洗浄します。洗浄バッファー1を除去し、洗浄バッファー2を追加します。サンプルを洗浄バッファー2で摂氏55度で15分間2回洗浄します。洗浄バッファー2を除去し、次に2X SSCを追加します。サンプルを2X SSCで摂氏55度で15分間2回洗浄します。2X SSCを取り外してから、予熱したPBSTを追加します。サンプルを室温でPBSTで15分間洗浄します。抗DIG抗体のインキュベーションでは、まずPBSTを除去し、次に1%ブロッキングバッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、室温で少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。ブロック後、1% ブロッキング バッファーを削除します。抗DIG-POD溶液を加え、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。DIG標識プローブを検出するには、抗DIG-POD溶液を除去し、トリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを追加します。サンプルを塩化トリスナトリウムトゥイーンバッファーで室温で10分間3回洗浄します。蛍光色素結合チラミドストック溶液を増幅希釈バッファーで希釈し、活性型Cy5チラミド溶液を作ります。できるだけ多くのトリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを除去してから、活性Cy5チラミド溶液を追加します。サンプルを暗所で10分間インキュベートします。サンプルをPBSTで暗所で10分間3回洗浄します。EdU検出カクテルを準備するには、成分を混合します。PBSTを削除してから、EdU検出カクテルを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。暗所で10分間PBSTで3回洗います。DNA染色の場合は、ヘキストをPBSTで希釈してヘキスト溶液を調製します。PBST を削除し、ヘキスト ソリューションを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。サンプルをPBSTで3〜4回、暗所で10分間洗浄します。次に取り付けるために、先端を切り取ったトランスファーピペットを使用して、メデューサをスライドガラス上の土手に移します。鉗子でメデューサの上にカバーガラスをそっと置き、カバーガラスの側面を透明なマニキュアで密封します。Nanos1発現とEdU陽性細胞の共標識により、触手内の幹細胞と増殖細胞の空間パターンが明らかになりました。EdU陽性細胞は触手球全体に広く分布し、Nanos1陽性細胞は触手球と新しい分岐部位に局所的に蓄積し、発生時期や病期によって幹細胞と増殖細胞の明確な分布が検出されることが示唆されました。EdUとNanos1の共標識は19.79%の細胞で観察され、これらの細胞が活発に増殖する幹細胞集団であることを示唆しています。興味深いことに、細胞の14.46%が球根の中央と新しい分岐部位でEdU陽性のNanos1陰性であることが判明し、非幹様増殖細胞の存在を示唆しています。対照的に、26.32%の細胞が球根の基部と新しい分岐部位でEdU陰性のNanos1陽性であることが観察され、遅いサイクルまたは静止した幹細胞集団の存在を示しており、どちらもEdUパルス標識では検出されません。短いインキュベーション時間のEdUパルス標識により、幹細胞様細胞と非幹細胞様細胞のうち増殖細胞のみを検出することができます。EdUのインキュベーション時間を変更し、長時間の追跡実験を組み合わせる場合、ゆっくりとしたサイクリング幹細胞または子孫および分化細胞を含む他の細胞タイプをマークすることができます。

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識

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