Name: マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶマウスの騒音性難聴モデル構築法。C57BL/6Jマウスを用いた騒音曝露、聴性脳幹反応測定、外有毛細胞損傷評価の詳細プロトコル。難聴機構解明と治療戦略最適化に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

台湾政府の科学技術部(MOST)からの助成金(MOST 110-2314-B-715-005、MOST 111-2314-B-715-009-MY3)、およびマッカイ医科大学(MMC-RD-110-1B-P030、MMC-RD-111-CF-G002-03)からの壁内研究助成金に感謝します。

本研究における動物実験は、マッカイ医科大学の動物管理委員会によって承認された。8週齢の雄性C57BL/6Jマウスを国立実験動物センター(台湾新北市)から購入した。全てのマウスを、標準的な動物プロトコールに従って飼育および飼育した。
1. マウスにおけるNIHLの誘導
<ol><li>実験用マウス用のケージを準備する<ol><li>これを行うには、14 cm×17 cm×24 cmの寸法のラットトラップケージを使用します。4枚の段ボールを適切なサイズに切り、ケージに収まるようにします(13 cm × 23 cmおよび13 cm × 16 cm)。</li>
		<li>マウスがメッシュグリッドで足を切るのを防ぐために、2つのピースをそれぞれ底面と裏面に置きます。他の2つのピースを互いに垂直に連動させて配置し、ケージ内のスペースを四分の一に分割します。</li>
	</ol></li>
	<li>防音ボックスでこの調査を実施してください。ケージの前にスピーカーを8.5cm置き、スピーカーとケージの両方を防音ボックスに入れます。</li>
	<li>CLIOアプリケーションソフトウェアを開きます</li>
	<li>カーソルをスピーカーアイコンに移動し、[TwoSin]をクリックします。Freq 1 を 1000 Hz に、Freq 2 を 6000 Hz に入力して変更し、[OK] をクリックしてサウンドの再生を開始します。</li>
	<li>Leq タブで、dBV を dBSPL に変更します。ソフトウェアインターフェイスで時間を設定した後、緑色の三角形のボタンをクリックしてサウンドを再生します。</li>
	<li>マイクをスピーカーの前に8.5 cm離して置き、ノイズレベルを調整します( 補足ファイル1を参照)。ノイズレベルを125 dB SPL-Aに調整し、3分以上継続的に監視して、ノイズレベルが十分に安定していることを確認します。発生器、アナライザ、アンプを使用して、ノイズを生成および制御します。(図1) 注意: オペレーターの聴覚への損傷を避けるために、防音ボックスでこの手順を実行してください。</li>
	<li>4匹の雄のC57BL / 6Jマウスをケージに入れます(各四半期に1匹)。ノイズ曝露中の各四半期にマウスをランダムに割り当てます。ケージの上部にマイクロホンを置き、騒音にさらされている間の騒音レベルを監視します(図2)。 注意: オペレーターの聴覚への損傷を避けるために、防音ボックスでこの手順を実行してください。</li>
	<li>マウスを1 kHzおよび6 kHzの周波数のノイズに1日あたり6時間、5日間連続してさらします。</li>
	<li>ABRを測定することにより、騒音曝露の1日後(すなわち、6日目 )にマウスの聴力閾値を測定する。 騒音曝露の1週間後(すなわち、13日目 )にこれらのABR測定を再度繰り返す。ABR測定後、関与するすべてのマウスを犠牲にし、蝸牛を収穫します(図3)。</li>
</ol>2. 聴覚脳幹反応(ABR)に基づく聴力閾値の評価
<ol><li>小動物用に特別に設計された市販のABR試験システムを使用する10.</li>
	<li>全身麻酔のために、チレタミンとゾラゼパム(40 mg / kg)およびキシラジン(9.3 mg / kg)の混合物をマウスに腹腔内注射します。. 注:ABR評価には~2時間かかります。マウスが麻酔下にある間、必ず加熱パッドを介して熱サポートを提供し、目の軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。</li>
	<li>全身麻酔下でマウスのABRを測定します。皮下針電極(12 mm)を頂点、左耳介の後ろ、尾の近くに配置して、聴力閾値を測定します。</li>
	<li>動物の左耳から1 cm離れた場所に置かれたスピーカーを使用して音響刺激を提示します。</li>
	<li>オシロスコープを使用して音響刺激を制御します。刺激には 正弦波 を選択し、ウィンドウスケールには 10k を選択します。周波数ノブを回して、音響刺激の目的の 周波数 を取得します。</li>
	<li>ファンクションジェネレーターの AMLP ノブを回して刺激強度を調整します。 AMLP ノブをキャリブレーションから計算された適切な電圧に回して、目的の刺激強度を取得します。</li>
	<li>10 dB SPL から 100 dB SPL までの一連の刺激強度で、10 dB ステップサイズで ABR 測定値を収集します。 注意: 防音ボックスで聴覚閾値を測定します。収集された信号に識別可能な波Vを生じさせることができる最小刺激強度レベルは、ABR閾値10,11であると仮定された(図4)。ABR評価後、麻酔から回復するまで(~1時間)動物を監視します。</li>
</ol>3.顕微鏡検査
<ol><li>収穫した組織の固定<ol><li>ABR測定後、顕微鏡検査のためにチレタミンとゾラゼパム(100 mg / kg)およびキシラジン(23.25 mg / kg)の混合物を腹腔内注射することにより、マウスを犠牲にします。</li>
		<li>マウスから蝸牛を採取し、直ちに10%ホルムアルデヒド(FA)に浸して固定します(2つの蝸牛/ mL)4°Cで少なくとも8時間。</li>
		<li>固定後、FA溶液を10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液に交換し、4°Cで3〜4日間脱灰します。 次に、ピンセットで各蝸牛をチェックして、蝸牛が十分に柔らかくなっていることを確認します。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填したシャーレに蝸牛を置き、螺旋状のコルチ(OC)器官(それぞれ脱灰蝸牛)を基底ターン、中ターン、頂端ターンの3つのセクションに切断して組織染色します。</li>
		<li>解剖顕微鏡(倍率8倍-35倍)で脱灰蝸牛の骨構造(前庭窩骨、鱗膜、モディオラス)を除去し、OCを含む軟組織(厚さ約40μm)を得る。</li>
	</ol></li>
	<li>蝸牛免疫蛍光染色<ol><li>ブロッキングバッファーの調製:PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.2%Triton X-100溶液を調製します。</li>
		<li>染色する組織をシャーレからマイクロ遠心チューブに移し、組織を0.1 mLのブロッキングバッファーに室温(RT)で2時間浸漬します。</li>
		<li>Myo7A一次抗体バッファーの調製:ブロッキングバッファーでMyo7A一次抗体を1:200の容量比で希釈します。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブ内の組織を100 μLのMyo7A一次抗体バッファーでRTで2時間処理します。</li>
		<li>組織をPBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。</li>
		<li>Myo7A二次抗体(Myo7A-Rb-488)およびファロイジン抗体(ファロイジン-594)バッファーの調製:ブロッキングバッファーでMyo7A二次抗体(1:400)およびファロイジン抗体(1:200)を希釈します。</li>
		<li>組織を100 μLのMyo7A二次抗体およびファロイジン抗体バッファーでRTで2時間処理します。</li>
		<li>抗体+ファロイジン抗体処理後、組織をPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。</li>
		<li>切断先端付きの1 mLプラスチックトランスファーピペットを使用して、すすぎた組織をマイクロ遠心チューブからPBSで満たされたペトリ皿に移します。</li>
		<li>顕微鏡検査の準備をするには、組織を広げてスライドガラスの上に置き、15 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)フルオロマウント培地を組織に添加して完全に覆います。ガラスのカバーガラスをティッシュの上に置きます。マニキュアで密封する前に、スライドをRTで一晩放置します。</li>
	</ol></li>
	<li>画像取得<ol><li>正立型蛍光顕微鏡と画像取得ソフトウェアを使用して2D画像を取得します。</li>
		<li>顕微鏡検査を行う前に、組織を視野の中央に配置し、感度をISO100に調整します。最初にソフトウェアの [自動モード ]ボタンをクリックして露出時間を調整し、次に [調整 ]ボタンをクリックして手動で微調整し、信号対雑音比を最適化します。</li>
		<li>入射光の波長を調整し、蛍光キューブを回転させて蛍光色素を励起します。異なる蛍光標識(青色光:DAPI;緑色光:Myo7A;赤色光:ファロイジン)からの発光をマークするために擬似色を使用した。</li>
		<li>組織サンプルをスキャンすることで、画像データを.tifおよび.jpg画像ファイルとして生成および収集します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

開示する利益相反はありません。

NIHLは、聴力閾値の時間的シフトを示す一時的なNIHLと、永続的な聴力閾値シフトを特徴とする永続的なNIHLの2つのタイプに分けることができます。6日目 (騒音曝露の1日後)に観察された難聴は、これら2つのタイプの組み合わせであると考えられています。この場合、聴力閾値は、難聴の時間的要素のために、時間の経過とともに徐々に回復します。我々の予備的な実験的研究では、同じセットアップおよび動物で得られた結果は、2日間の騒音曝露によって生成された難聴は2週間で完全に回復し、永久的なNIHLが実際に生成されなかったことを示しています。それどころか、この研究では、5日間の騒音曝露によって生じる難聴は、聴力閾値が13日目 (騒音曝露の1週間後)の対照レベルよりも有意に高かったため、永続的な要素を含むことが示唆されています。
現在のプロトコルの制限の1つは、12kHzで検出された聴力閾値を使用して、蝸牛の頂端回転に対応するマウスの低周波聴力閾値を表すことです。厳密に言えば、蝸牛の頂端回転は4 kHzから8 kHz12...

世界中で約13億人が騒音曝露による難聴に苦しんでいます1。本研究では,騒音性難聴(NIHL)の誘導・確認プロセスを明確に確立することを目的とした。NIHLは、有毛細胞(HC)およびらせん神経節ニューロン(SGN)の変性/破壊、HCステレオ繊毛の損傷、および/または蝸牛内部HCとSGNの間のシナプスの喪失に起因します。このような異常は、NIHLに加えて、耳鳴りや音声知覚障害(特に複雑な音響環境)を引き起こす可能性もあります。社会的、心理的、および認知機能は、これらの生理学的欠陥によって順次影響を受ける可能性があります2,3,4,5,6。
マウスを用いたNIHL関連の前臨床試験では、最も一般的なマウス系統はCBA/CaJ 2,3,6,7およびC57BL/6 4,5,8です。さらに、雄の3,4,7匹のマウスは、エストロゲンが聴覚を保護する効果があるため、雌のマウスよりも一般的に使用されています。したがって、この研究では雄マウスのみを使用しました9。文献を参照した後、印加ノイズの周波数として1kHzと6kHzを選択しました。印加されたノイズの強度は、115 dB SPL-A(ケージの周囲)から125 dB SPL-A(ケージの中央)でした。実験マウスを1日当たり6時間連続して騒音にさらした後、5日間連続して、聴覚閾値の最適な増加は、NIHLの最適な範囲が実験マウスにおいて生成されたことを示した。動物の取り扱い、実験セットアップの構築、およびノイズの誘導のための操作はすべて、提供されたプロトコルで段階的に明確に説明されています。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;1/4インチ CCP フリーフィールド スタンダードマイクセット</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>ノイズ曝露用</td></tr><tr><td>アンプ入力モジュール、AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>バイオアンプ、BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>免疫蛍光</td></tr>染色 <tr><td>Cellsens software</td><td>オリンパスのライフサイエンス</td><td></td><td>画像取得</td></tr><tr><td>波形プラスチック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPIフルオロマウント</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>免疫蛍光染色</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>脱灰</td></tr><tr><td>誘発応答増幅器、ERS100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>APLHA</td><td>F030410</td><td>蝸牛の固定</td></tr><tr><td>高性能データ収集システム、MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>モジュラー延長ケーブル、MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴性脳幹反応用</td></tr><tr><td>Myo7A 一次抗体</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>免疫蛍光染色</td></tr><tr><td>Myo7A 二次抗体</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-545-152</td><td>免疫蛍光染色</td></tr><tr><td>針電極、ユニポーラ 12 mmTp、EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹応答</td></tr>ファ<tr><td>ロイジン抗体</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>免疫蛍光染色リン酸</td></tr><tr><td>緩衝生理食塩水</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ラットトラップケージ</td><td></td><td></td><td>14 cm x 17 cm x 24cm</td></tr><tr><td>ROMPUN-キシラジン注射、溶液&nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サウンドアンプ, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>騒音暴露用</td></tr><tr><td>サウンドジェネレーター/アナライザー/その他, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>騒音暴露用</td></tr><tr><td>防音チャンバー</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>騒音暴露用・ABR</td></tr><tr><td>スピーカー&nbsp;</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>騒音曝露用</td></tr><tr><td>刺激装置モジュール、STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td>免疫蛍光染色</td></tr><tr><td>チューブフォンセット、OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>聴覚脳幹反応用</td></tr><tr><td>正立顕微鏡、BX53</td><td>オリンパス</td><td></td><td>画像取得</td></tr><tr><td>ゾレチル</td><td>・ヴィルバック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

騒音性難聴(NIHL)の動物モデルは、病理学者、セラピスト、薬理学者、および聴覚研究者がNIHLのメカニズムを完全に理解し、その後対応する治療戦略を最適化するのに役立ちます。この研究は、NIHLのマウスモデルを開発するための改良されたプロトコルを作成することを目的としています。この研究では、雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。麻酔をかけていないマウスを、大きな騒音(1および6kHz、115〜125dB SPL−Aで同時に提示)に1日6時間連続して5日間連続して曝露した。聴覚機能は、聴覚脳幹反応(ABR)を使用して、騒音曝露の1日後および1週間後に評価されました。ABR測定後、マウスを屠殺し、免疫蛍光染色のためにコルチの器官を採取した。聴性脳幹反応(ABR)測定から、騒音曝露の1日後に重大な難聴が観察されました。1週間後、実験マウスの聴力閾値は~80 dB SPLに低下し、対照マウス(~40 dB SPL)よりも有意に高いレベルであった。免疫蛍光イメージングの結果から、外有毛細胞(OHC)が損傷していることが示されました。要約すると、雄のC57BL / 6Jマウスを使用してNIHLのモデルを作成しました。純音ノイズを生成・配信するための新しいシンプルな装置を開発し、採用しました。聴力閾値の定量的測定とOHC損傷の形態学的確認は、いずれも印加された騒音が予想される難聴を誘発することに成功したことを示した。

ABR聴力閾値の変化 マウスの聴力閾値は、騒音曝露の1日後または1週間後にトーンバーストABRを使用して測定されました。試験した3つの周波数すべてで聴力閾値の有意な増加が観察された(12 kHz:84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 kHz:91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 kHz:98.57 ± 1.43 dB SPL)騒音曝露の1日後(すなわち、6日目)。部分的な聴力回復は騒音曝露の1週間後(すなわち、13日目)に起こったが、対照群(12 kHz:±41 ± 0 dB SPL、24 kHz: 41 0 dB SPL、24 kHz: 24 kHz: 84.29 ± 2.77 dB SPL、32 kHz: 87.14 ± 4.21 dB SPL)と比較して、すべての周波数で30 dB以上上昇した(12 kHz: 41 0 dB SPL; 24 kHz: 51 ± 0デシベルSPL;32 kHz: 51 ± 0 dB SPL)。この研究では、聴覚は高周波でより損傷を受けました(図5</str...

ここでは、騒音性難聴(NIHL)のマウスモデルのプロトコルを提示します。NIHLを誘導するために、波形プラスチック、ラットトラップケージ、スピーカーを使用した新しいシンプルなデバイスを開発しました。聴覚脳幹反応と免疫蛍光イメージングを使用して、それぞれ聴覚機能と外有毛細胞の損傷を評価しました。

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

騒音性難聴に関する研究はあるが、これほど詳細に記録したものはなく、重要な手技である。この方法は、マウスに騒音性難聴を効果的に引き起こし、ABRによる聴力閾値の実際の変化を観察します。騒音性難聴の動物モデルは、科学者が騒音性難聴のメカニズムを完全に理解し、その後、対応する治療戦略を最適化するのに役立ちます。手順を実演するのは、私の研究室の非常に才能のある学生であるDian-Shiue Leeです。実験マウス用のケージを準備するには、ラットトラップケージを使用し、4枚の波形プラスチックボードを適切なサイズにカットして、ケージに収まるようにします。マウスがメッシュグリッドで足を切るのを防ぐために、2つのピースをそれぞれ底面と裏面に置きます。他の2つのピースを互いに垂直に連動させて配置し、ケージ内のスペースを四分の一に分割します CLIOアプリケーションソフトウェアを開きます。カーソルをスピーカーアイコンに移動し、TwoSinをクリックします。周波数1を1, 000ヘルツ、周波数2を6, 000ヘルツの値を入力して変更し、[OK]をクリックしてサウンドの再生を開始します。Leq タブで、dBV を dBSPL に変更します。ソフトウェアインターフェイスで時間を設定した後、緑色の三角形のボタンをクリックしてサウンドを再生します。スピーカーの前にマイクを8.5センチメートルの距離に置いて、ノイズレベルを調整します。ノイズレベルを125デシベルSPL-Aに調整し、少なくとも3分間継続的に監視して、ノイズレベルが十分に安定していることを確認します。発生器、アナライザ、アンプを使用して、ノイズを生成および制御します。4匹の雄のC57ブラック6Jマウスを、騒音にさらされるために、各四半期に1つずつケージに入れます。ノイズ曝露中にマウスを各四半期にランダムに割り当てます。ケージの上部にマイクを置き、騒音にさらされている間の騒音レベルを監視します。ケージをスピーカーの前に防音ボックス内に置き、スピーカーがケージから8.5センチメートル離れた位置にあることを確認します。マウスを1キロヘルツと6キロヘルツの周波数で1日6時間、5日間連続してノイズにさらします。ABRを測定することにより、6日目および13日目のマウスの聴力閾値を測定する。 ABR測定用に小動物用に特別に設計された市販のABR検査システムを使用し、動物を全身麻酔下に維持します。左耳介の背後、尾付近の頂点に12mmの皮下針電極を配置し、聴力閾値を測定した。スピーカーを動物の左耳から1センチ離した後、スピーカーを使用して音響刺激を提示します。刺激には正弦波を選択し、ウィンドウスケールには10kを選択します。周波数ノブを回して、音響刺激の目的の周波数を取得します。ファンクションジェネレーターのAMLPノブを回して刺激強度を調整します。AMLPノブをキャリブレーションから計算された適切な電圧に回して、目的の刺激強度を取得します。10デシベルステップサイズで、10〜100デシベルSPLの一連の刺激強度の下でABR測定値を収集します。識別可能な波Vを引き起こす可能性のある最小刺激強度レベルをABRしきい値としてマークします。ABR測定後にマウスを屠殺し、安楽死させたマウスから蝸牛を採取した。組織を採取した直後に、固定のために10%ホルムアルデヒドに浸し、摂氏4度で少なくとも8時間休ませます。本文で説明されているように、脱灰にはEDTAを使用します。PBSで満たされたペトリ皿に蝸牛を置きます。組織染色のために、コルティ(OC)のらせん状の器官を、基底ターン、中ターン、および頂端ターンの3つのセクションに切断します。8倍から35倍の倍率で解剖顕微鏡下で、脱灰した蝸牛のスカラ前庭、スカラティンパニ、モディオラスを含む骨構造を取り除き、OCを含む軟組織を取得します。騒音曝露の1日後に、12キロヘルツ、24キロヘルツ、および32キロヘルツで聴覚閾値の有意な増加が観察されました。部分的な聴力回復は騒音曝露の1週間後に起こったが、聴力閾値は対照群と比較してすべての周波数で30デシベル以上上昇した。この研究では、聴覚は高周波でより損傷を受けました。6日目と13日目の両方で、対照群と実験群の間で12キロヘルツと32キロヘルツの聴力閾値に有意差が観察されました。NIHLマウスから取得した顕微鏡画像では、対照マウスと比較して、外有毛細胞の損失が一貫して観察されました。すべての画像で内有毛細胞は無傷のままでしたが、OCの基底および中ターンの外有毛細胞は深刻な損傷を受けました。対照的に、頂端ターンの外有毛細胞はほとんど無傷でした。このプロトコルの最も重要なステップには、ノイズ曝露、ABI測定、蝸牛の収穫が含まれます。この手順は、さまざまな種類の音を使用して、難聴に対するさまざまな周波数での騒音曝露の影響を調べるために適用できます。

modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

減損またはファントム認識（自覚的耳鳴り）を聞いて、聴覚しきい値などのパラメータを聞いての行動決定のための高速かつ安価な方法が記載されている。これは、音響驚愕反応のプレパルス抑制を使用し、簡単にプログラムのAD /...

げっ歯類における行動聴力検査のための低コストのセットアップ

このビデオでは、マウス蝸牛の特定の領域にあるリボンシナプスを評価する方法を示します。免疫染色と共焦点イメージング技術を利用して、各蝸牛回転の異なる周波数領域にわたる機能的なシナプスを同定します。...

マウス蝸牛の特定の周波数領域におけるリボンシナプスの評価

出典:Lee, D. et.al., マウスの騒音性難聴の実験条件の変更と、聴覚機能と外有毛細胞の損傷の評価。J. Vis. Exp.

長時間の大音量音ばく露によるマウスの難聴誘発

出典:Lee, D., et.alです。マウスの騒音性難聴の実験条件の変更と、聴覚機能と外有毛細胞の損傷の評価。J. Vis.

マウスの聴覚脳幹反応の測定

説明されている耳介後の外科的アプローチは、失血と動物の死亡率を最小限に抑えながら、マウスの蝸牛スカラティンパニへの迅速かつ直接的な送達を可能にします。この方法は、丸い窓の膜を介して出生後のマウスに分子、薬理、およびウイルスを送達する蝸牛療法に使用できます。...

円窓膜を介してマウスインナーイヤーにウイルスにより媒介遺伝子送達のための手術方法

動物モデルの蝸牛に耳毒性物質を導入するための様々な方法が存在します。提示されているのは、丸い窓のニッチに耳毒性物質を送達するための外科的プロトコルです。この手順は信頼性が高く、標的を絞った蝸牛内病変を作成し、マイクロアーキテクチャへの機械的損傷を回避します。蝸牛の自己修復・再生の検討が可能です。...

蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

&gt;jove_content&lt;ここでは、内耳への局所的な薬物送達のための2つのマイクロサージェリーアプローチについて説明し、聴覚パラメータ、蝸牛細胞構造、および炎症マーカーの発現への影響の観点から比較します。...

マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション

人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。...

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。...

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

脳幹誘発応答オーディオメトリーは、臨床神経生理学における重要なツールである。今日では、脳幹誘発応答オーディオメトリーは、薬理学的および遺伝的動物モデルの両方を含む基礎科学および前臨床試験にも適用される。ここでは、聴覚脳幹応答をマウスで正常に記録および分析する方法の詳細な説明を提供します。...

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。...

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

学ぶマウスの騒音性難聴モデル構築法。C57BL/6Jマウスを用いた騒音曝露、聴性脳幹反応測定、外有毛細胞損傷評価の詳細プロトコル。難聴機構解明と治療戦略最適化に有用です。

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

さらに動画を探す