Name: 微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ微小管とキネシンモーターを用いたアクティブネマティクスの形成と閉じ込め方法。フローセル構築と表面処理技術により、複雑流体の動態を可視化する実験アプローチを習得できます。

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著者らは、寛大な資金提供に対して全米科学財団(NSF)の賞DMR-1808926に感謝したいと思います。このプロジェクトは、カリフォルニア大学マーセド校の細胞および生体分子機械センター(HRD-1547848)およびブランダイス生体材料施設材料研究科学工学センター(DMR-2011486)を通じてNSFによっても支援されました。金型の3Dプリントを支援してくれたカリフォルニア大学マーセド校のビン・リュー博士と、反転実験法の開発中に科学的アドバイスをしてくれたジョルディ・イグネス博士に感謝します。

1.活物質の準備
注:2Dアクティブネマティックは、3段階のプロセスで組み立てられます。最初に、2つの別々の溶液を調製する:a)重合され、安定化された微小管およびb)MIX(キネシンモーターを含む溶液)。これらが組み合わされ、アデノシン三リン酸(ATP)を添加すると活性が開始されます。次に、材料は適切な形状に限定され、その密度はネマティック秩序が出現するのに十分なほど高くなります。必要なすべてのコンポーネントの準備とアクティブフェーズの組み立て方法に関するプロトコルが含まれています。
<ol><li>キネシンモータータンパク質クラスター調製<ol><li>Edgar C. Young20のプロトコルに従って、大腸菌由来の組換えK401-BIOモータータンパク質(K401モーター)を発現および精製します。 注:K401-BIOモータータンパク質は二量体であり、らせん状の茎で接続された2つのヘッドで構成されています。モーターはブランダイスバイオマテリアル施設から供給され、以前に報告されたように使用されました16。活性ネマチックを形成する目的で、キネシン分子はビオチン化され、次いでストレプトアビジン結合を介して連結されて、最大4つのモーター13、15、21、22のキネシンクラスターを形成する。キネシンを緑色蛍光タンパク質(GFP)タグで発現させると便利です。</li>
		<li>ストレプトアビジンとモーターを氷上で40分間精製およびインキュベートした後、K401モーターを液体窒素中で5 μLアリコート、最終濃度0.7 mg/mLで瞬間凍結し、-80°Cで保存します。 注: ここでテストを一時停止できます。必要に応じてキネシンを静かに解凍し、再凍結しないでください。</li>
		<li>46 vol% M2Bバッファー(80 mM PIPES [1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸、pH 6.8]、2 mM MgCl2、および1 mM EGTA [エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸])。KSAを氷上で40分間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>微小管溶液の調製 注:グアノシン-5'-[(α,β)-メチレン]三リン酸ナトリウム塩(GMPCPP)は、グアノシン三リン酸(GTP)のゆっくりと加水分解可能な類似体であり、GMPCPPの存在下で形成される微小管は、GTP微小管23 の3倍硬く、より短い。短くて硬い微小管の使用は、これらの要因が組み合わさって液晶秩序を促進するため、活性ネマチック相の形成に有利です。<ol><li>0.6 mM GMPCPPを使用して、標識されていない環状チューブリン(99%、 材料表を参照)をチューブリン濃度6 mg/mLで重合します。 注:高品質のチューブリンは、確立されたプロトコルに従ってウシまたはブタの脳から精製することも、損傷を防ぐために材料を冷凍して出荷できるブランダイスバイオマテリアル施設などの別の信頼できるソースから入手することもできます。ウシの脳からのチューブリン精製については、Bateら24から公開されているプロトコルを参照してください。ブタの脳からのチューブリン精製については、Castoldi et al.25およびTayar et al.26の公開プロトコルを参照してください。</li>
		<li>重合の準備として、37°Cのヒートバスを用意し、遠心分離機を4°Cに予冷します。 500 μL超遠心管内のM2Bバッファー中の非標識チューブリン溶液(ステップ1.1.3)と4 mol%ローダミン標識チューブリン( 材料表を参照)を混合して、重合後に4%標識微小管を生成します。</li>
		<li>ブラッドフォードアッセイ27を使用してチューブリン濃度を確認します。遠沈管内の総チューブリン濃度は6.5〜6.9 mg / mLである必要があります。</li>
		<li>チューブリン混合物を氷上で10分間インキュベートし、超遠心機で4°Cで352,700 x g で10分間インキュベートします。 このステップは、ペレットに含まれる機能不全のチューブリンを除去します。</li>
		<li>ピペットを使用して、機能性チューブリンを含む上清を微量遠心チューブに注意深く抽出します。GMPCPPを最終濃度0.6 mMに添加してチューブリン重合を誘導し、DTTを最終濃度1 mMに添加してタンパク質凝集を防ぎます。</li>
		<li>混合物を37°Cのヒートバスで30分間インキュベートし、その後、室温で14,000 x g で10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットをM2Bバッファーで希釈して、最終微小管濃度6 mg/mLに到達します。 注意: この溶液は、使用前に少なくとも4時間室温で保存できます。</li>
		<li>微小管が正常に重合したことを確認するには、顕微鏡スライド上で1 μLの微小管溶液をM2Bバッファーとピペットで100:1に希釈します。40倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡( 材料の表を参照)を使用してイメージングするためのカバースリップでカバーします。 注:励起波長と発光波長は、微小管に使用される蛍光標識に従って選択されます。このプロトコルでは、ローダミン標識が使用されるため(ステップ1.2.2を参照)、515〜560 nmの励起バンドと590 nmのロングパスフィルターを使用してイメージングが実行されます。 図1 に代表例を示す。</li>
		<li>重合が完了したら、微小管を液体窒素中で2 μLアリコートとして滴下凍結し、-80°Cで保存します(必要な場合)。</li>
	</ol></li>
	<li>ミックスの調製 注:MIXは、キネシン-ストレプトアビジンクラスター(KSA)を含む水溶液です。調製したMIXは、実験前に4 μLのアリコートで-80°Cで保存する必要があります。MIXが室温でステップ1.2に記載されるATPおよび微小管溶液と組み合わされると、活性が開始される。MIXは以下のようにして調製される13、19。<ol><li>2つの抗酸化溶液を混合して、蛍光退色防止(ANTIFADE)用の溶液を調製します。AO1(250 mM DTT、65 mMカタラーゼ)とAO2(750 μMカタラーゼ、3 mMグルコースオキシダーゼ)を1:1の容量比で組み合わせます。蛍光顕微鏡による損傷を軽減するために使用される別の抗酸化剤である20 mM Troloxを含めます。</li>
		<li>微小管の束ねを誘導するための6 wt%20 kDaポリエチレングリコール(PEG)、ATP再生のための70 mg/mLの3 vol%アンチフェード、および5 vol%ピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ(PKLDH)を含むKSAの溶液(ステップ1.1.3に記載)を調製してMIXを調製します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. アクティブネマティックの作成
注記: 品目内の活動は、ATP 添加によって開始されます。活性ネットワークは、運動活動を誘発するのに十分な濃度でATPを添加することによって、各実験のために新鮮に調製される。均一で完全に発達した活性ネマチック相を形成するためには、微小管は十分に高密度でなければならない。これは、微小管を2つの非混和性流体の間に閉じ込めて、2次元(2D)活性ネマティック層を形成することによって達成することができる。この方法はもともとブランダイス大学13 で開発され、均質で高品質の活性ネマチック相を生成するための一般的な手法であり続けています。
<ol><li>活性ネマチック形成のためのフローセル法<ol><li>アクリルアミドコーティングを施した親水性カバーガラスを準備します。<ol><li>石鹸水、エタノール、および0.1 M NaOHでカバーガラスを完全に洗浄し、ナノピュア水を使用して交互にすすぎます。すすぎたら、エタノール100 mL、酢酸1 mL、3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート500 μLからなるシラン溶液でカバーガラスを15分間コーティングし、ナノピュア水ですすいでください。</li>
			<li>95 mLのナノピュア水と5 mLの40 wt%アクリルアミドからアクリルアミド溶液を調製し、真空オーブンで30分間脱気します。</li>
			<li>35 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を加えて最終濃度2.3 mMにし、次に0.07 gの過硫酸アンモニウムを加えます。アクリルアミド溶液を表向きにしながらカバーガラスの上に注ぎ、室温で一晩インキュベートします。</li>
		</ol></li>
		<li>疎水性顕微鏡スライドを準備します。100 μLの撥水液( 材料の表を参照)を清潔なガラス顕微鏡スライドにピペットで入れ、その上に別の清潔なスライドガラスを置きます。これにより、撥水液が2分間置かれている表面に撥水液が均一にコーティングされます。2分後、2番目のスライドガラスを取り外し、最初のスライドをナノ純水で十分にすすぎ、窒素ガスで乾燥させます。テープが配置される領域(パターンの周り)をアセトンでそっときれいにして、撥水液がガラスへの付着を妨げないようにします。</li>
		<li>1.8%(v / v)008-フッ素界面活性剤を含むエンジニアリングオイルの混合物を準備します( 材料の表を参照)。</li>
		<li>スライドガラスとカバーガラスをフローセルの下部にある疎水性スライドガラスと親水性カバースリップを上面として、40μmの両面接着剤スペーサーを使用してサンドイッチ形状で組み立てます。スペーサーを疎水性顕微鏡スライド上に1.5mm離して配置します。次に、アクリルアミドコーティングされたカバーガラスをスペーサーの上に置き、処理された側を下にして接着します。鈍い物体からの圧力で接着が完了していることを確認してください。 注意: 目標は、内部に平らな油/水界面を備えたフローセルを組み立てることです(図2A、B)。これは、アクティブレイヤーが形成される場所です。代替のスペーサーテープおよびフィルムを使用して、同様のセル厚さを生成することもできます。</li>
		<li>フローセルが構築されたら、すぐにオイル混合物をフローセルにピペットで入れ、密閉されたスペースを満たします。</li>
		<li>ピペットを使用して、別のバイアルで6 μLの活性材料を3.73 μLのMIXと穏やかに混合し、1 μLの微小管溶液、0.6 μLのATP溶液(濃度は微小管速度を変えるように変えることができます)、および0.67 μLのM2Bバッファー。</li>
		<li>新たに混合した活性材料をフローセルの一方の開放端にピペットで入れると、容量は変動するがフローセルの体積(およそ3〜6μL)を超えるべきである。一部のオイルは、チャネルに注入されるときに水溶液によって置換されます。これは、小さなティッシュペーパーを使用して流路の反対側の端で吸い上げることができます。</li>
		<li>充填後、フローセルの両側を、UV光に20秒間さらされると硬化するエポキシ接着剤( 材料の表を参照)でシールします。 注: この時点で、活物質は水層に浮遊したままの 3D ネットワークを形成します。</li>
		<li>準2D層の2つの非混和性流体の間に活性層を閉じ込めるには、フローセルをスイングバケット遠心分離機(材料表を参照)に入れ、水相を上に、より密度の高い油層を下に置きます。212 x gで10分間遠心分離します。このステップが完了したら、フローセルを落射蛍光顕微鏡に持ち込み、10倍または20倍の倍率の対物レンズでイメージングすることができます。図2C,Dは、このステップの前後の典型的な画像を示しています。</li>
	</ol></li>
	<li>アクティブネマティック形成のための反転法 注:ステップ2.1で説明した別の方法は、深いPDMSウェル28に限定された厚い油層の下にアクティブネマチック層を組み立てることです。この方法でも同様の結果が得られ、習得がやや簡単です。ただし、この方法を使用した画質は、通常、フローセル法ほど良くありません。<ol><li>エラストマー硬化剤とエラストマーベースを使用してポリジメチルシロキサン(PDMS)を調製します( 材料表を参照)。金属スパチュラを使用して2つの成分を1:10の比率で混合します。混合中に除去が困難な小さな泡が現れ、混合物は乳白色に見えます。これらの気泡を除去するには、混合物を真空下に置き、1時間脱気すると、未硬化のPDMSが透明に見えるようになります。 注:PDMSは、金型を使用して任意の形状を形成する準備ができており、容器内で硬化してから、目的のパターンに切断またはパンチすることができます。</li>
		<li>PDMSを適切な型に流し込み、60°Cで一晩放置して硬化させます。 注:未処理の場合、硬化PDMSの表面は疎水性ですが、表面処理により親水性にすることができます。</li>
		<li>親水性PDMS表面を作製するために、PDMSをアクリルアミドポリマーブラシ29で被覆する。このステップはまた、タンパク質が表面に付着するのを防ぎます。<ol><li>まず、エタノールとイソプロパノールの両方でPDMSを10分間洗浄し、次に脱イオン水で3回完全にすすぎ、乾燥させます。プラズマクリーナーを5分間使用して、乾燥した硬化したPDMSを洗浄します。このステップにより、表面がより親水性になります。</li>
			<li>次に、シラン溶液(98.5重量%エタノール、1重量%酢酸、および0.5重量%トリメトキシシリルプロピルメタクリレート)を準備し、その溶液に基板を15分間浸漬してアクリルアミドコーティングの準備をします。基板を脱イオン水で十分にすすぎ、アクリルアミド溶液(2 wt%アクリルアミド/ビス溶液、2.3 mM TEMED、および3 mM過硫酸アンモニウム)に浸します。 注:これらの基板は、ガラスペトリ皿のアクリルアミド溶液で覆われた室温で保存でき、2週間以内に使用する必要があります。</li>
		</ol></li>
		<li>使用する準備ができたら、表面を脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥させてすぐに使用してください。活性混合物(ステップ2.1.6で説明)をウェルに加え、すぐに上部にシリコーンオイルを約2mmの厚さまで加えます。 注:この段階では、活性混合物はPDMS上のオイルと親水性コーティングの間に挟まれますが、それでもある程度3次元になります。</li>
		<li>材料をさらに2D層に押し込むには、PDMSデバイスをスライドガラスに接着し、スイングバケット遠心分離機に入れて、212 x gで12分間回転させます。デバイスは、シリコーンオイルが水層の上部になるように配置する必要があります。代表的な結果を 図3に示す。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 限られた形状でのアクティブネマティクスの準備
注:この準2次元システムのようなアクティブネマティクスは、井戸やチャネルなどの小さなマイクロ流体形状に限定するのが難しい場合があります。ここでは、材料を異なる形状のPDMSウェルに閉じ込めるための信頼できる方法が説明されています。
<ol><li>まず、PDMSのマスターモールドを設計します。これは、基板上にピラーを3D印刷することによって達成することができる。樹脂マスターモールドを3Dプリントした後、イソプロパノールで洗浄し、UVランプ下で45分間、オーブンで120°Cで2時間硬化させます(図4)。 注:UV下での硬化および熱後硬化は、樹脂30からモノマーおよび光阻害剤残留物を除去することにより、PDMSにおける複製の品質を向上させる。</li>
	<li>マスターモールドを使用して、PDMSからウェルを作成します。ステップ 2.2.1 の説明に従って PDMS を準備します。マスターモールドを未硬化のPDMSに浸し、60°Cのオーブンで一晩硬化させます。</li>
	<li>PDMSの硬化が完了したら、マスターモールドを慎重に取り外し、必要に応じてPDMSを切断してウェルを処理します(図4)。PDMSサーフェスをステップ2.2.3の説明に従って処理します。実験の前に、表面をエポキシ接着剤でスライドガラスに取り付けて、イメージングを容易にすることができます。</li>
	<li>ステップ2.1.6に記載の活性混合物1μLをPDMS基板上にピペットし、活性ネットワーク液滴の上に100〜1000cSt粘度28 のシリコーンオイルを直ちに加える。アクティブなネットワークは井戸に移動します。このプロセスには最大60分かかります(図4)。ステップ2.2.5で説明したように、2Dネットワークは、スイングバケット遠心分離機でPDMSウェルを212 x gで12分間スピンダウンすることによって強化できます。</li>
</ol>

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この作品で使用された一部の資料は、Cytoskeleton Inc.(米国デンバー)から無料で提供されました。

プロトコル全体を通して、実験者がいくつかの重要なチェックを行うことができるいくつかのポイントがあります。いずれかのデバイスに活物質を充填する前に、蛍光顕微鏡( 図1を参照)を使用して、微小管が重合し、理想的には長さが~2〜3μmであることを確認する必要があります。微小管が顕微鏡下で見えない場合、微小管は解重合している可能性があり、活性ネマティックは形成されません。個々の微小管は非常に小さいため、顕微鏡で直接観察するのは難しい場合があります。この研究では、困難な低照度アプリケーション用に設計された高品質の蛍光カメラを、関連するソフトウェアとともに使用して、フィラメントの成長を検証しました。重要な蛍光凝集体は、解重合または変性タンパク質の存在を示している可能性があるため、この段階では存在すべきではありません。また、微小管、MIX、ATPをプロトコルに記載されているのと同じ比率で組み合わせて、簡単な顕微鏡テストスライドを作成することもお勧めします。コンポーネントを組み合わせることでアクティビティが開始され、材料は 図2C に示すようなものになり、バンドルが存在し、全体に顕著なフィラメントの動きが見えるはずです。
フローセル法を使用する場合、フローセルの遠心分離時間と配向は、均一な活性層の形成にとって重要です。この手順では、使用する遠心分離機の種類によっては微調整が必要になる場合があります。回転面に垂直な方向を向いた活性面でフローセルを遠心分離すると、材料を流体界面に均一に押し込むことができるため、最良の結果が得られます。遠心分離する前に、フローセルが慎重に密閉されていることを再確認してください。
反転法を使用して閉じ込められたアクティブネマティクスを生成する場合、最適化するためのいくつかのステップがあります。まず、高解像度の構造を生成する3D印刷方法を使用することが重要です。不均一な側壁は微小管を引っ掛ける原因となり、流れを乱す可能性があります。井戸は深すぎてはいけません(この研究では、厚さ2 mmの油層を持つ深さ150〜200 μmの井戸を使用しました)。実験者は、最良の結果を得るために、試行錯誤によってこれらのパラメータをわずかに調整する必要がある場合があります。
フローセル法および反転法は、異なる油12および水中構造13を含む、活性流に影響を与える様々な効果を調べるために異なる著者によって使用されてきた。方法の選択は実験目的によって異なります。フローセル法を使用すると、活性層の上方からの光学イメージングは、上にある流体が異なるため、反転法よりも鮮明になります。フローセル法では、ガラスカバースリップと薄い水層を介してイメージングが行われますが、反転法は油層を上に持つように設計されています。これは、反転法では長い作動距離の対物レンズが必要であり、画質が低下することを意味します。画質の違いは、図2D(フローセル法)と図3(反転法)、およびムービー1とムービー2をそれぞれ比較することで確認できます。図3では、図2よりも作動距離の長い低倍率レンズが必要でした。倒立法のこれらのイメージングの欠点は、顕微鏡スライド基板の適切な作動距離を持つ対物レンズと組み合わせて、適切な倒立顕微鏡が利用可能であれば回避できます。より薄いガラスを基板として使用して、標準的な作動距離対物レンズを使用できます。
利点として、反転形状により、より広い範囲のオイル粘度の使用が可能になり、必ずしもスイングバケット遠心分離を必要とせず(これが利用できない場合)、金型が準備されるとシステムの準備が比較的容易になります。ただし、反転法を使用してウェルに閉じ込めるには、材料を明確に定義された2D層にするために遠心分離が重要な場合があります。
フローセル法は、最近、連続活性層が必要な実験で非常にうまく使用されています。私たちの最近の研究では、高品質のイメージングとテクスチャ解析が重要な活性層のトポロジカル欠陥のダイナミクスを調べました19。また、フローセル法は、油沈下微細構造が活性流16 および柱に及ぼす影響を調査して、活性流31の欠陥をトラップするために使用されている。この方法は、連続活性層の形成に非常に適しており、画質が優れています。ただし、最終的な2D活性層の生成に使用される遠心分離ステップは実行が困難な場合があり、フローセルは漏れや気泡が発生しやすくなります。反転法は、成功率が高く、構築が容易で、高解像度の3Dプリントマスターモールドを作成できれば、あらゆる基板パターンまたは形状に使用できる非常に有用な代替手段です。この方法は、充填井を比較的簡単にするため、活性ネマティックダイナミクスに対する幾何学的閉じ込めの影響を調べるのにも役立ちます。
本論文では、微小管とキネシンモーターから活性ネマチックを形成する2つの方法と、材料をウェルに閉じ込める技術について説明します。提示されたシステムは、現在文献にあるアクティブなネマチック相の最もクリーンな例を表しており、世界中のいくつかのグループによって再現されています。この材料の重要性は、その成分の生物学的起源にあるだけでなく、活性秩序流体のまったく新しい方向性を開くことにもあります。このシステムを使用してその基本的な特性を解明することにより、科学者は完全に合成された活性相の設計に進むことができます。
閉じ込めが能動ネマティクスに及ぼす影響に着目した実験は、トポロジカル閉じ込め下での能動流の挙動やトポロジカル欠陥ダイナミクスに関する根本的な疑問に答える可能性を秘めています。ここで紹介する方法は、マイクロフルイディクスやアクティブミキシングなど、形状に焦点を当てたさまざまな実験とその分析の実行に役立ちます。

活性流体は、局所環境から燃料を引き出すエネルギー駆動の粒子または要素で構成されています。適切な条件下では、これらの運動活性要素は集合的に作用して、長い長さスケールにわたって創発的な流体力学を生み出すことができます。このような非平衡相の振る舞いの文献にはさまざまな例があり、活動期は生命系のスペクトル全体で見つけることができます。いくつかの注目すべき例は、細菌1のコロニー、細胞シート2,3、および生物4,5の群れまたは群がりである。活性相はまた、細胞骨格フィラメントの凝縮相において、細胞6の一部として、または生物学的に抽出された成分を利用するように設計された合成系において広く研究されている7、8、9。生物学的抽出物から組み立てられた天然および合成システムの両方における液晶秩序化およびトポロジカル欠陥の形成は、研究コミュニティにとって特に興味深いものです。近年、研究グループはそのようなシステム、それらの基本的な物理的特性、および生物学との関連性を調べてきました2,3,10,11。
この論文は、微小管とキネシンモータータンパク質の組み合わせからの活性ネマチック状態の形成に焦点を当てています。従来のネマチック液晶は、構成分子が配向秩序を示す物質の平衡相です。例えば、比較的剛直な棒状分子からなる流体は、ネマチック相と、より高い温度では、無配向等方性流体相12の両方を示し得る。活性ネマチック相の最初の実験例は、Sanchezら13によって開発され、モータータンパク質のクラスターを使用して隣接する微小管束間のせん断運動を生成する初期のin vitro実験14を適応させた。この微小管系が薄い層に限定されると、自発的なネマティック秩序が出現した。近年、活動的なネマチック状態は、いくつかの実験的15,16および理論的17,18の研究グループによって集中的に研究されており、能動的乱流(流体が自己駆動のカオス流を生成する状態19)や移動トポロジカル欠陥などの現象に焦点を当てています。この論文では、さまざまな実験形状の微小管とキネシンモーターから活性ネマチック状態を調製して形成する方法について説明します。最初に、異なる成分溶液の調製方法が説明され、続いて、2つの異なるフローチャンバ形状を使用して活性ネマチックを形成する方法が説明される。典型的なイメージング結果を示す。最後に、活性ネマチックをウェルおよびチャネル内に閉じ込めるための方法が記載されている。

<table><tbody><tr><td>20 kD PEG(ポリエチレングリコール))</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1419109</td><td>枯渇剤 CAS番号:125061-88-3</td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514-50ML</td><td>CAS番号:2530-85-0</td></tr><tr><td>3Dプリンター &レジン</td><td>フローゼン</td><td></td><td>フローゼン ソニック ミニ 8K 3D プリンター - アクア グレー 8K 樹脂</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド溶液</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>CAS 番号: 7732-18-5, 79-06-1</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>CAS 番号: 64-19-7</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>CAS 番号: 67-64-1</td></tr><tr><td>粘着シート (注: 「パラフィルム」は代替品です)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>620001</td><td>SecureSeal</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>CAS 番号: 7727-54-0</td></tr><tr><td>アクアペル (注: "RainX" は代替手段です)</td> <td>アクアペル ガラス処理</td><td></td><td>疎水性ガラス処理</td></tr><tr><td>ATP (アデノシン三リン酸)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A1852</td><td>CAS 番号: 34369-07-8</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9322</td><td>CAS 番号: "9001-05-2"</td></tr> <tr><td>デシケーター</td><td>Bel-art</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタル CMOS カメラ</td><td>浜松</td><td>ORCA - Flash4.0 LT+</td><td></td></tr><tr><td>DTT (ジチオスレイトール)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>CAS 番号: "3483-12-3"</td></tr> <tr><td>EGTA (3,12-ビス(カルボキシメチル)-6,9-ジオキサ-3,12-ジアザテトラデカン-1,14-二酸)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>MFCD00004291</td><td>CAS番号:67-42-5</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td>CAS番号:64-17-5</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM2500P</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G7021</td><td>CAS番号:50-99-7</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>345386</td><td>CAS番号:9001-37-0</td></tr><tr><td>GMPCPP(グアニル5'-&α;、ベータ;-メチレンジホスホネート)</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>NU-405S</td><td>CAS番号:14997-54-7</td></tr><tr><td>HFE7500オイル</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>Thermixホットプレートモデル100M</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl(塩化カリウム)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>CAS番号:7447-40-7</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CAS番号:67-56-1</td></tr><tr><td>MgCl2(塩化マグネシウム)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>CAS番号:7786-30-3</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Eppendorf - Thermo Fisher</td><td>1.5 mL</td><td></td></tr><tr><td>ナノ純水清浄器</td><td>ザルトリウス</td><td>アリウムミニ</td><td></td></tr><tr><td>NaOH(水酸化ナトリウム)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>SX0603</td><td>CAS番号:1310-73-2</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHメーター</td><td>サーモサイエンティストオリオン</td><td>3つ星</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸(PEP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>MFCD00044476</td><td>CAS番号:4265-07-0</td></tr><tr><td>パイプ(1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CAS番号:5625-37-6</td></tr><tr><td>ピペット(0.2-1000 &micro;l)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>RAN界面活性剤(注:Emulsoの「FluoSurf」は代替品です)</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>シリコンオイル(100mpa s-1000 mpa s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CAS番号:63148-52-7</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofisher</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット 遠心分離機</td><td>サーモサイエンティスト</td><td>ソーバルレジェンド RT+</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 エラストマーベース</td><td>ワールドプレシジョンツ</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 エラストマー硬化剤</td><td>ワールドプレシジョンツ</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>MiniSpin Plus</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (テトラメチルエチレンジアミン)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610800</td><td>CAS番号:110-18-9</td></tr><tr><td>Trolox(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00006846</td><td>CAS番号:53188-07-1</td></tr><tr><td>Tubulin</td><td></td><td>Cytoskeleton T240-B</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin(ローダミン標識)</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL590M-A</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Optima Max-TL</td><td></td></tr><tr><td>UVライト</td><td>RapidFix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV硬化型接着剤(注:「Norland NO81」は代替品です)</td><td>RapidFix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>セルコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワットマン フィルターペーパー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr></tbody></table>

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

Forming, Confining, and Observing Microtubule-Based Active Nematics

生体高分子ベースの活性相の形成は、活性液晶の新興分野と細胞生物学におけるそれらの可能な役割を探求することに関心のある研究者にとって重要な技術となっています。これらの新しいシステムは、エネルギーを局所的に消費し、非平衡の動的流体を生成する自己駆動サブユニットで構成されています。本報告に記載の活性液晶相を形成するには、生体高分子や分子モーターなどの精製タンパク質成分が結合し、アデノシン三リン酸(ATP)の存在下で活性ネマチック相が自発的に形成されます。ネマチック状態を観察するには、材料を顕微鏡に適した形状に十分に高い密度で閉じ込める必要があります。この記事では、微小管とキネシンモーターを使用して活性ネマチック相を形成するための2つの異なる方法について説明します:油と水の界面での2次元活性層の組み立てと、エラストマーウェルを使用した油層の下での組み立て。異なる形状の小さなウェルに活性材料を挿入する技術も記載される。

図1は、GMPCPPチューブリンから調製された単一微小管の代表的な画像を示す。画像は、同様の長さの短い微小管を示しています(ある程度の分散性があります)。微小管溶液を十分に希釈すると、長さの検証のために十分に分離された微小管の画像が生成されます。個々の微小管は、サイズが小さいため、画像化が困難な場合があります。このアプリケーションには、蛍光顕微鏡用に設計された高感度カメラの使用が最適です。図2および図3は、それぞれフローセル法(セクション2.1)および反転法(セクション2.2)を使用して行われた成功した実験の蛍光顕微鏡画像の例を示しています。整形成された活性ネマチック層は、テクスチャが均一であり、有意な空隙領域および可動トポロジカル欠陥は存在しない。ただし、欠陥コアに許容できる小さなボイドがある可能性があることに注意してください。図2と図3に示す例に加えて、3つの補足映画(映画1、動画2、動画3)が含まれており、成功した実験で活性ネマティックがどのように現れるべきかを示しています。すべての動画は、アクティブなネマチック相の滑らかな連続運動を示しています。微小管濃度の変動は、材料が定常状態に達した後は見られません。十分なATPがシステム内に存在する限り、材料は均一に移動し続けます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig01.jpg"> 図1:GMPCPP微小管の蛍光顕微鏡画像。 GMPCPP微小管をローダミンチューブリンで4%標識し、37°Cで20分間重合した。 イメージングは室温で行った。スケールバー = 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig02.jpg"> 図2:フローセル内の微小管ネマティクス 。 (A)フローセルの断面概略図、1 mm x 18 mmの形状。(B)フローセルの上面図概略図。(C)油/水界面での組み立て前の活性溶液の典型的な外観を示す蛍光顕微鏡画像。(D)フローセル内の油/水界面に集合した活性ネマチック相の蛍光顕微鏡画像。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig03.jpg"> 図3:倒立法を用いて作製した活性ネマチックを示す蛍光顕微鏡像。 スケールバー= 200μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig04.jpg"> 図4:金型製作と表面処理を含む、PDMSウェル内のアクティブなネマチック閉じ込めの方法を示すフロー図。右画像のスケールバー(閉じ込められた活物質)= 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:フローセル法を用いて調製した活性ネマチックの代表的な結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE1_JOVE.avi" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画2:反転法を用いて調製した活性ネマティックの代表結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE2_JOVE.avi" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画3:楕円ウェルに閉じ込めた倒立法を用いて調製した活性ネマティックの代表的な結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE3_JOVE.avi" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。

The formation of biopolymer-based active phases has become an important technique for researchers interested in exploring the emerging field of active ...

アクティブネマティクスは、非線形ダイナミクスと液晶の分野を拡大するエキサイティングな研究トピックとして浮上しています。致命的なトポロジカル欠陥とカオスダイナミクスを示す複雑な流体があります。限られたアクティブネマティクスに焦点を当てた文献の最近の理論的研究がたくさんあります。しかし、実験家が材料をマイクロスケールの幾何学的形状に限定することは困難でした。私たちの技術は、実験のセットアップをより簡単にし、新しいグループがフィールドに入り、これらのエキサイティングな材料を試すことができるようにします。この技術は、他のEQUIS活性物質系に適用することができ、例えば、効果の相構成を形成し、 将来、より活性な相が開発されるにつれて、実験者は同様のネマティクスを使用して材料を閉じ込める方法を理解する必要があります。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるデレク・ハマーとフェレシュテ・メマリアンです。アクリルアミドコーティングを施した親水性カバースリップを調製するには、まず、石鹸水、エタノール、0.1モルの水酸化ナトリウムでカバースリップを徹底的に洗浄し、ナノ純水を使用して交互にすすぎます。すすぎたら、カバースリップを100ミリリットルのエタノール、1ミリリットルの禁欲酸、500マイクロリットルのトリメトキシシリルプロピルメタクリレートからなるシラン溶液で15分間コーティングします。その後、ナノ純水ですすいでください。95ミリリットルのナノ純水と5ミリリットルの40重量パーセントアクリルアミドからアクリルアミド溶液を調製します。次に、溶液を真空オーブンで30分間脱気し、亜硫酸塩あたり0.07グラムのアンモニウムと35マイクロリットルのテトラメチルエチレンジアミンを加えて、最終濃度を2.3ミリモルにします。アクリルアミド溶液を上向きにカバースリップの上に注ぎ、室温で一晩インキュベートします。100マイクロリットルの撥水溶液をピペットできれいなガラス顕微鏡スライド上に疎水性顕微鏡スライドを作製した。次に、別のきれいなスライドガラスを上に置きます。これにより、撥水液が2分間置かれている表面に均一なコーティングが保証されます。2番目のスライドガラスを取り外し、最初のスライドをナノ純水で十分にすすぎます。その後、窒素ガスで乾燥させます。1.8%フルオロ界面活性剤を含むエンジニアリングオイルの混合物を準備します。スライドガラスとカバースリップを40マイクロメートルの両面接着剤スペーサーを使用して組み立てます。スペーサーを疎水性顕微鏡スライド上に1.5ミリメートル離して配置します。次に、アクリルアミドコーティングされたカバースリップをスペーサーの上に置き、処理された側面を下にして接着します。フローセルが構築された後、すぐに別のバイアル内のピペットを使用して密閉空間を満たすフローセルにオイル混合物をピペットで入れ、6マイクロリットルの活物質を3.73マイクロリットルの混合物と穏やかに混合します。1マイクロリットルの微小管溶液、0.6マイクロリットルのATP溶液、および0.67マイクロリットルのM2B緩衝液ピペット6マイクロリットルの新たに混合された活性材料をフローセルの一方の開口端に入れる。一部のオイルは、チャネルに注入されるときに水溶液によって置換されます。これは、小さなティッシュペーパーを使用して流路の反対側の端で吸い上げることができます。充填後、フローセルの両側を、UV光に20秒間さらされると硬化するエポキシ接着剤で密封します。活性層を準2D層内の2つの許容流体の間に閉じ込めること。フローセルをスイングバケット遠心分離機に入れ、水相を上に、より密度の高い油層を遠心分離機の下に212 Gで10分間置きます。このステップが完了したら、フローセルを落射蛍光顕微鏡に持ち込み、10倍または20倍の倍率対物レンズでイメージングすることができます。まず、PDMSのマスターモールドを設計します。これは、基板上にピラーを3D印刷することによって達成することができる。樹脂マスターモールドを3Dプリントした後、イソプロパノールで洗浄し、UVランプ下で45分間、摂氏120度のオーブンで2時間硬化させ、エラストマー硬化剤とエラストマーベースを使用してポリ染料メチルシアンを調製します。金属スパチュラを使用して、2つの成分を1〜10の比率で混合します。これらの気泡を除去するには、混合物を真空下に置き、1時間脱気した後、未硬化のPDMSが透明に見えるようにします。PDMSを適切な型に流し込み、一晩放置して摂氏60度で硬化させます。親水性PDMS表面を調製するには、エタノールとイソプロパノールの両方でPDMSを10分間洗浄し、次にイオン交換水で3回完全にすすぎ、乾燥させます。プラズマクリーナーを5分間使用して、乾燥硬化PDMSを洗浄します。これにより、表面がより親水性になります。次に、シラン溶液を調製し、その溶液に基板を15分間浸漬してアクリルアミドコーティングを調製し、基板をイオン交換水で十分にすすぎ、アクリルアミド溶液に浸します。使用する準備ができたら、表面を脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥させてすぐに使用してください。PDMSをエポキシ接着剤でスライドガラスに取り付け、1マイクロリットルの活性混合物をPDM基板上にピペットで貼り付け、すぐに活性ネットワーク液滴の上にシリコーンオイルを追加します。アクティブなネットワークが井戸に移動します。このプロセスには最大 60 分かかります。PDMSデバイスを水層の上に油層を入れたスイングバケット遠心分離機に入れ、212 Gで12分間回転させます。平衡化します。代表的な画像は、同様の長さの短い微小管を示しています。個々の微小管は、サイズが小さいため、画像化が困難な場合があります。このアプリケーションには、蛍光顕微鏡用に設計された高感度カメラの使用が最適です。適切に形成されたアクティブな空気圧層は、テクスチャが均質であり、大きなボイド領域や可動トポロジカル欠陥は存在しません。ただし、欠陥コアに許容できる小さなボイドがある場合があることに注意してください。適切な表面処理は親水性または疎水性の表面を有する。この方法では、形状のロールを簡単に議論でき、物理的な閉じ込めを変更するだけでアクティブな構造を制御できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。...

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。...

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。...

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。...

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。...

微小管タクトイドの自己組織化

この論文では、共絡アクチンフィラメントと微小管の調整可能な3次元複合ネットワークをエンジニアリングおよび特性評価するためのプロトコルを紹介します。複合材料は、ミオシンIIおよびキネシンモーターによって駆動される能動的再構成および弾道運動を受け、アクチン、微小管、モータータンパク質、および受動架橋剤の相対濃度によって調整される。...

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

この研究では、制御された条件下でのアクトミオシンゲルの多孔弾性を研究するために 、in vitro...

細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

ここでは、精製されたタンパク質から準2次元(2D)エンタングル、架橋、および液晶アクチンアセンブリを調製する方法を紹介します。...

活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

このプロトコルでは、微小管ポリマーの力学を調査するのに適したマイクロ流体デバイスの設計と製造について詳しく説明します。マイクロファブリケーション、自動フロー制御、および計算モデリング技術の合成により、 in...

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶ微小管とキネシンモーターを用いたアクティブネマティクスの形成と閉じ込め方法。フローセル構築と表面処理技術により、複雑流体の動態を可視化する実験アプローチを習得できます。

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

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