ペプチドポロキサミンナノ粒子を用いた培養細胞における in vitro 転写mRNAの効率的なトランスフェクション

ペプチド-ポロキサミンナノ粒子は、潜在的な肺mRNA送達システムの1つです。私たちのプロトコルは、ペプチドポロキサミンナノ粒子をより高い生産性と効率で作成し、粘膜mRNAワクチンの開発を容易にします。この技術に必要な材料は低コストであり、プロトコルは短時間で完了することができます。

ペプチドポロキサミンナノ粒子は、効率的なmRNAトランスフェクションを媒介する能力を有する。ペプチドポロキサミンナノ粒子は、ヒト気管支上皮細胞におけるmRNAトランスフェクションに成功し、粘膜COVID-19ワクチン、肺がんの治療、嚢胞性線維症遺伝子治療への追加応用が示唆されました。私は、個人が実験を開始する前に、関連分野、プロトコル、および多くの技術に関する基本的な知識を持っていることを期待しています。

メトリディア・ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを合成し、pUC57ベクターにクローニングした後、BamHIとKpnIを使用して摂氏37度で1時間、線状化DNAテンプレートを調製します。原稿に記載されているように、T7転写キットとシュードウリジンを使用して、mRNA合成のために20マイクロリットル容量の反応を準備します。成分を完全に混合し、摂氏37度で3時間インキュベートします。

次に、50マイクログラムのキャップされていないIVT mRNAの二次構造を摂氏65度で10分間加熱して除去します。IVT mRNAキャッピングにはCap 1キャッピングシステムを使用し、S-アデノシルメチオニンと2'O-メチルトランスフェラーゼを使用して摂氏37度で30〜60分間、7-メチルグアノシンキャップ構造を修飾してキャップ1を調製します。キャップされたIVT mRNAの濃度を紫外可視分光光度計で測定します。

RNAマーカーを使用して、18%ホルムアルデヒドを含む1%ホルムアルデヒド変性アガロースゲル中のキャップされたIVT mRNAの分子サイズを分析します。T704をヌクレアーゼフリーの水に可溶化することにより、ポロキサミン704の1ミリリットルあたり10ミリグラムのストック溶液を調製します。ペプチドをヌクレアーゼフリーの水に可溶化することにより、ペプチドの1ミリリットルあたり2ミリグラムのストック溶液を調製します。

調製した溶液を摂氏4度で保管する。IVT mRNAを氷上で解凍します。チューブを開く前に、チューブを300倍Gで室温で3秒間遠心分離し、IVT mRNA溶液をヌクレアーゼフリー水で希釈します。

T704溶液を8マイクログラム/マイクロリットル濃度に、合成ペプチド溶液を0.555マイクログラム/マイクロリットル濃度に希釈し、T704および合成ペプチド混合溶液をそれぞれヌクレアーゼフリー水で調製する。さらに使用する前に、混合溶液を室温で15分間インキュベートします。IVT mRNA溶液を1ミリリットルのシリンジに引き込み、シリンジ先端のエアギャップや気泡を避けます。

回転ブロックの横にあるカートリッジの片側にシリンジをロードします。次に、1ミリリットルのシリンジにT704と合成ペプチドミックス溶液を満たし、シリンジ先端の気泡やエアギャップを取り除きます。シリンジをポンプのもう一方の入口に配置し、ポンプの総流量を毎分4〜10ミリリットルに設定します。

10ミリリットルのRNaseフリーコニカルチューブを配置して、混合IVT mRNA/PP-sNp溶液を混合装置の流路の端に収集します。ポンプを運転して混合を開始し、パラメータが正しく入力されていることを確認します。ポンプを6秒間運転した後、円錐管からIVT mRNA/PP-sNpサンプルを採取します。

ヒト気管支上皮細胞および樹状細胞株をトランスフェクションの24時間前に96ウェルプレートにプレート化します。10%熱不活化ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した培地で細胞を増殖させます。増殖培地を除去した後、播種した細胞をウェル当たり0.2ミリリットルのPBSで洗浄する。

播種した細胞培養物を含む各ウェルに170マイクロリットルの無血清培養液を追加します。次に、0.4マイクログラムのメトリジウムルシフェラーゼmRNAを含む30マイクロリットルのIVT mRNA/PP-sNp製剤を各ウェルに滴下します。IVT mRNA/PP-sNp 製剤を含む細胞を、加湿した 5% 二酸化炭素富化雰囲気中、摂氏 37 度で 4 時間インキュベートします。

トランスフェクション培地を吸引し、10%熱不活化ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した0.2ミリリットルの新鮮な培養培地を加えます。前に示したように、トランスフェクトした細胞を24時間インキュベートし、各ウェルから検出する上清を収集します。セレンテラジン基質にPBSを添加して、新しいアッセイ溶液を調製する。

10秒間ボルテックスして溶液を完全に混合します。採取した上清50マイクロリットルを96ウェルプレートに加える。1, 000ミリ秒の読み取り時間でマイクロプレートリーダーをセットアップし、手動または自動注入によって各ウェルに30マイクロリットルのセレンテラジン溶液を追加します。

上清にセレンテラジン溶液を加えた直後に、[開始]をクリックして発光シグナルを測定します。組換えプラスミドを単離し、消化して、直鎖化DNA鋳型を生成した。インビトロ転写は、アップキャップおよびキャップされたMetLuc mRNAを産生した。

メトリジウム・ルシフェラーゼmRNA/PP-sNpを導入した細胞は、市販の脂質ベースのトランスフェクション試薬、裸のメトリジウム・ルシフェラーゼmRNA、PBS、またはT7044合成ペプチド、ヒト気管支上皮細胞の混合溶液、16 HBE、および樹状細胞株DC2.4でトランスフェクトした細胞と比較して、ルシフェラーゼの発現が有意に高かった。 MetLuc mRNAを分解から保護し、外因性メトリジウムルシフェラーゼmRNAのトランスフェクション効率を促進します。キャップされていないMet-mRNAの合成構造が正常に除去されていることを確認してください。Met-mRNA T704とペプチド化合物を慎重に計算してダウンロードし、ポロキサミンナノ粒子を調製して圧縮します。

透過型電子顕微鏡法は、ペプチドポロキサミンナノ粒子の形態を観察するために行うことができる。この技術は、研究者が粘膜mRNAワクチンを開発し、関連するすべての細胞の遺伝子治療製剤のハイスループットスクリーニングを可能にするのに役立ちます。