オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築
2022年9月28日
このプロトコルは、システインとメチオニンの間のビスアルキル化と、プロパルギルスルホニウム中心によって引き起こされる簡単なチオール-イン反応 を介した 環状ペプチドの合成を提示します。
このプロトコルでは、特別な近接でタンパク質システインと反応する新しい手として作用できるスルホニウム塩が構築されました。この技術の利点は、この反応が迅速かつ効率的であり、メット触媒を含まず、ペプチドを安定化するための簡単で効率的な方法を開発したことでした。まず、20%ピペリジンまたは50%モルホリンとDMFのN末端9-フルオリニル-メチルオキシカルボニル脱保護溶液を500ミリリットルのビーカーまたはフラスコに調製します。
次に、10ミリリットルの脱保護溶液をカラムに加え、窒素を溶液に30分間または2回5分間バブリングします。真空ポンプで溶液を排出し、ジクロロメタンとN,N-ジメチルホルムアミドで樹脂を5回連続洗浄します。樹脂を濃い黄色の溶液として検出するには、少量の樹脂に1ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、ガラス管に200マイクロリットルの5%ニンヒドリンを加えます。
130°Cで3分間加熱し、樹脂の色の変化を評価します。ペプチドのカップリングのために、ポリプロピレンチューブ中の原稿に記載されているように混合溶液を調製し、それを3ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解する。次に、173マイクロリットルのN,N-ジイソプロピルエチルアミンまたは154マイクロリットルのN,N'-ジイソプロピルカルボジイミドを溶液に加えて、アミノ酸を不活性化します。
次に、混合物を樹脂と共にカラムに加え、窒素で2時間泡立てる。カップリング後、少量の樹脂に1ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、ガラス管に200マイクロリットルの5%ニンヒドリンを加えます。樹脂が無色に変化している間、摂氏130度で3分間加熱し、脱保護ステップの前に遊離アミノ基がないことを確認します。
溶液を排出した後、前述のように樹脂を洗浄し、10ミリリットルの脱保護溶液をカラムに加えます。次に、窒素で30分間または2回5分間泡立てます。そして再び、新しい解決策を追加します。
脱水のために樹脂と共に10ミリリットルの無水メタノールをカラムに加え、次の使用のために窒素で乾燥させる。100ミリグラムの樹脂をカラムに計量し、カップリングステップの前にジクロロメタンとN,N-ジメチルホルムアミドで樹脂を洗浄します。保護基を除去するための100ミリリットルのビーカーまたはフラスコにトリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、およびジクロロメタン混合物を加えて、トリチル-L-システイン保護基を除去するための溶液を調製します。
調製した溶液を5〜10ミリリットルカラムに加え、保護基を10分間除去します。黄色が完全に消えるまで窒素バブリングで6回繰り返します。真空ポンプで溶液を排出した後、前述のように樹脂を洗浄します。
次いで、N,N-ジメチルホルムアミドと共に50ミリリットルのビーカーまたはフラスコにジハロゲン化リンカーとN,N-ジイソプロピルエチルアミンを加えて脱保護システインと反応させるための溶液を調製する。5〜10ミリリットルの反応溶液をカラムに加え、保護されたシステインと窒素バブリングで少なくとも3時間反応させます。再度、真空ポンプで溶液を排出し、前述のように樹脂を順次洗浄します。
ペプチド環化溶液を調製するには、ペプチド環化用のドラフト内の20ミリリットルのビーカーまたはフラスコにトリフルオロ酢酸混合物を追加します。次に、5〜10ミリリットルの混合溶液をポリプロピレンチューブに加え、トリフルオロ酢酸カクテルの下で樹脂を3時間切断します。カップリング工程が実証される前に樹脂を脱水および洗浄した後、1%ギ酸水溶液と1ミリモルの臭化プロパルギルを調製し、メチオニンペプチド溶液に加えます。
次に、メチオニンと臭化プロパルギルのカップリング反応を室温で12時間振とうする。反応後、生成物をポリプロピレンチューブとアセトニトリルに溶解し、0.22マイクロメートルのフィルター膜でろ過します。その後、直ちに逆相HPLCで溶液を精製し、次の使用のために粉末に凍結乾燥します。
システインとメチオニンの間のビスアルキル化を用いて合成された環状ペプチドは、HPLCおよびLCMSスペクトルによって特徴付けられ、エピマーは明確な保持時間と同一の分子量を示したことを示しています。エピマーとそのコンジュゲート生成物のHPLCトレースは、環状ペプチドとその生成物との間の時間依存的な変換を示しました。チオール-イン型反応を用いて合成した環状ペプチドの分子量をLCMSにより測定し、ペプチドをHPLCにより単離精製した。
ペプチドはさらに、プロトンNMRとヘテロ核単一量子コヒーレントスペクトルによって特徴付けられ、化学シフトを明らかにしました。環状ペプチドとジチオスレイトールおよび酸化重水素との間の時間依存的変換のプロトンNMRスペクトルが得られ、スルホニウム環の開環によるペプチドの安定性を調べた。結果は、24時間後に付加または開環生成物が形成されないことを示した。
この手順は、環状ペプチドを合成するための効果的な戦略を確立しました。この反応は、環化ペプチドを安定化させることの確認を形成することにより選択性も増強したと言い、環状ペプチドが有望な薬物触媒であったことを示している。
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概要
このプロトコルは、システインとメチオニン間のビスアルキル化とプロパルギルスルホニウム中心によって引き起こされる容易なチオール-アルキン反応を通じた環状ペプチドの合成を提示しています。この方法は効率的で、Met-触媒を必要とせず、ペプチドの安定化への簡単なアプローチを提供します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- ペプチド合成
背景
- スルホニウム塩はシステインと反応する種として機能します。
- この技術は迅速で効率的な反応を提供します。
- ペプチドの安定化を簡素化します。
- 樹脂の準備に脱保護溶液を使用します。
研究目的
- 環状ペプチドを合成する新しい方法を開発すること。
- ペプチド安定化の効率を向上させること。
- プロセスでMet-触媒の必要性を排除すること。
使用した方法
- ピペリジンまたはモルホリンを使用した脱保護溶液の調製。
- ジクロロメタンとDMFによる樹脂の連続洗浄。
- ニンヒドリンを用いた樹脂の色変化の検出。
- 反応を促進するための窒素の泡立ての適用。
主要な結果
- この方法は環状ペプチドを成功裏に安定化させます。
- Met-触媒なしで高速な反応時間が達成されました。
- 樹脂は合成の成功を示す明確な色変化を示しました。
- このプロトコルは研究者にとって簡単で効率的です。
結論
- このプロトコルは環状ペプチド合成への新しいアプローチを提供します。
- ペプチド安定化技術の効率を向上させます。
- この方法は分野の研究者にとってアクセスしやすいものです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cyclic peptides are increasingly prioritized in drug discovery pipelines due to their stability and bioactivity, but scalable, efficient synthesis remains a bottleneck. The on-tether sulfonium center protocol enables rapid, catalyst-free cyclization, supporting robust generation of structurally diverse cyclic peptides. This capability enhances early-stage target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables efficient synthesis of cyclic peptides for probing biological pathways and target engagement.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing stable, well-defined peptide scaffolds.
- Supports predictive confidence in target validation through reproducible peptide generation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized cyclic peptide libraries suitable for high-throughput screening workflows.
- Ensures reproducibility and purity via HPLC and LC-MS characterization.
- Provides quantitative outputs for reliable compound evaluation and assay calibration.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery to preclinical studies by generating peptides with confirmed stability profiles.
- Supports translational biomarker alignment through structurally consistent peptide reagents.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming peptide integrity under physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This synthesis protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a scalable route to cyclic peptide generation for downstream screening and preclinical validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway interrogation with rapid access to cyclic peptide probes.
- Screening: Supplies assay-ready peptides with validated purity and molecular weight for robust screening campaigns.
- Analytics: Employs HPLC, LC-MS, and NMR for quantitative assessment and structural confirmation.
- Translational Research: Maintains peptide stability and integrity for preclinical model evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synthesis platform adaptable to diverse peptide sequences and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in peptide-based target validation.
- Operational Value: Streamlines synthesis, purification, and characterization for scalable peptide production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by enabling early, reliable peptide evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of peptide-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in solid-phase peptide synthesis and analytical chemistry.
- Needs access to HPLC, LC-MS, and NMR instrumentation for quality control.
- Demands cross-team standardization of synthesis and purification protocols.
- Adaptable to various peptide sequences but may require optimization for specific residues.
- Stability and reactivity should be confirmed for each new peptide scaffold synthesized.
