透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化

Plasmodiophora brassicaeは、アブラナ科の植物を攻撃する土壌媒介性の必須生物栄養病原体です。感染すると、病原体は植物の地下部分でゴールの発生を引き起こすため、病気のクラブルートの名前が付けられます。ゴールの開発は非常に複雑な再プログラミングを伴います。

したがって、病気の間の内部変化を追跡する可能性は、この植物と病原体の相互作用を理解するために重要です。私たちのプロトコルは、複雑で厚い、およびゴールのイメージングを改善します。遺伝子発現、生理応答、植物ホルモンバランス、疾患進行、胞子分布、局所木質の変化の可視化を容易にします。

このプロトコルは、サンプル内の蛍光タンパク質を保存し、長期間にわたるオブジェクトの保存と処理を可能にします。また、疾患の進行に伴う生化学的および構造的変化の追跡も可能になります。手順を実演するのは、私たちのグループのポスドク研究員であるサラ・ブリチャーツ、私たちの研究室の博士課程の学生であるディークシャ・シン、アダム・ミツキェヴィチ大学のアグニエシュカ・バグニエフスカ・ザドウォルナ教授グループの博士課程の学生であるコルネル・ミチャラックです。

植物組織を準備することから始めます。クラブルートに感染した植物と感染していない植物の根系から土壌を慎重に取り除きます。水で徹底的に洗浄し、胚軸とゴールを微量遠心チューブに集めます。

真空ポンプを使用して700ミリバールの一定真空を適用することにより、室温で1時間、200〜500マイクロリットルのパラホルムアルデヒド固定液にサンプルを固定します。対象物がパラホルムアルデヒド溶液に完全に浸されていることを確認してください。非感染胚軸と感染した胆汁を埋め込むために4%アガロースを使用してください。

溶液を沸騰させてアガロースを溶かし、粘性のあるうちに冷めたら注ぎます。ティッシュ上でオブジェクトを数秒間わずかに乾燥させて、余分なパラホルムアルデヒドを取り除きます。つまようじまたは鉗子を使用して、植物オブジェクトをアガロースに慎重に埋め込み、向きを変えます。

斜めの部分を防ぐには、オブジェクトの軸がビブラトームブレードの平面に垂直になるように、オブジェクトが正しく配置および成形されていることを確認してください。アガロースの固化を促進するには、ペトリプレートまたはマルチカルチャープレートを摂氏4度で10分間置きます。ブレードを使用して、アガロースブロック内のオブジェクトを慎重に切断して成形し、切片作成の好ましい方向に注意してください。

アガロースブロックまたは大きなゴールを貼り付け、シアノアクリレートまたはインスタント接着剤とマスキングテープを使用して検体ホルダーに正しく取り付けます。ゴールの厚さとサイズに応じて、セクションの厚さ、速度、振動振幅を調整します。蒸留水を水浴に加え、切片化から始めます。

鉗子またはブラシを使用して切片を慎重に収集し、1ミリリットルの1X PBSバッファーを含むマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブから1X PBSを取り出し、200〜500マイクロリットルの透明化溶液を追加します。サンプル処理中にしばらくしてから色が変わった場合は、透明溶液を新しいものと交換してください。

透明化液に5%のカルコフルオール白色染色剤を調製することにより、産卵植物細胞の細胞壁に対してカルコフルオール白色染色を行います。次に、暗所で細胞を少なくとも5分間染色します。テキスト原稿に記載されているように、脂質をナイルレッドで染色し、リグニンを塩基性フクシンリグニン染色で染色し、クリアされたセクションを顕微鏡スライドにマウントします。

次に、落射蛍光または共焦点顕微鏡で細胞を観察します。複数の蛍光スペクトルを同時にイメージングするには、複数の取得モードを使用します。病原虫の動態と病原菌の蓄積をマラリアブラナ属のコロニー形成で追跡し、ナイルレッド染色後にP.brassicaeの休止胞子を持つ大きな細胞が観察されました。

P.brassicae感染時の木部分化の変化は、基本フクシン染色を用いて可視化した。pHCA2:erRFPコンストラクトを有するシロイヌナズナ植物を用いて、師部組織におけるHCA2遺伝子発現を内根ゴール内の可視化した。HCA2は、アブラナ属の胆汁発生の後期に師部と共局在し、その遺伝子活性は、アブラナ属の師部複雑さを増加させるメカニズムを反映していました。

接種後16日目に、発育中のゴールにおけるTCS:GFPマーカーの発現を確認することにより、感染した植物と非感染植物の間のサイトカイニン応答の違いを評価しました。サイトカイニン応答は、感染したゴールでは有意に減少しているように見えますが、特に師部プールでは、非感染植物では強いままでした。最も重要なステップは、PFAの固定、埋め込み、およびセクショニングです。

ビブラトーム切片の場合、高品質の切片を得るために、速度、振幅、および厚さのパラメータを最適化し、慎重に調整する必要があります。ビブラトーム切片作成と組織クリアリング技術は、植物と微生物の相互作用中の生理学的応答と複雑な細胞解剖学的構造を伴う二次成長を示す組織の顕微鏡分析を強化するための道を開いた。