透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化
August 5th, 2022
本プロトコルは、 Plasmodiophora brassicae によって誘導されるゴールの組織学的観察のための最適化された方法を記載する。胚軸のビブラトーム切片は、蛍光イメージングの前に除去され、疾患進行中の転写因子と植物ホルモンの関与を研究します。このプロトコルは、樹脂包埋の制限を克服し、蛍光タンパク質の プランタ 可視化を可能にします。
Plasmodiophora brassicaeは、アブラナ科の植物を攻撃する土壌媒介性の必須生物栄養病原体です。感染すると、病原体は植物の地下部分でゴールの発生を引き起こすため、病気のクラブルートの名前が付けられます。ゴールの開発は非常に複雑な再プログラミングを伴います。
したがって、病気の間の内部変化を追跡する可能性は、この植物と病原体の相互作用を理解するために重要です。私たちのプロトコルは、複雑で厚い、およびゴールのイメージングを改善します。遺伝子発現、生理応答、植物ホルモンバランス、疾患進行、胞子分布、局所木質の変化の可視化を容易にします。
このプロトコルは、サンプル内の蛍光タンパク質を保存し、長期間にわたるオブジェクトの保存と処理を可能にします。また、疾患の進行に伴う生化学的および構造的変化の追跡も可能になります。手順を実演するのは、私たちのグループのポスドク研究員であるサラ・ブリチャーツ、私たちの研究室の博士課程の学生であるディークシャ・シン、アダム・ミツキェヴィチ大学のアグニエシュカ・バグニエフスカ・ザドウォルナ教授グループの博士課程の学生であるコルネル・ミチャラックです。
植物組織を準備することから始めます。クラブルートに感染した植物と感染していない植物の根系から土壌を慎重に取り除きます。水で徹底的に洗浄し、胚軸とゴールを微量遠心チューブに集めます。
真空ポンプを使用して700ミリバールの一定真空を適用することにより、室温で1時間、200〜500マイクロリットルのパラホルムアルデヒド固定液にサンプルを固定します。対象物がパラホルムアルデヒド溶液に完全に浸されていることを確認してください。非感染胚軸と感染した胆汁を埋め込むために4%アガロースを使用してください。
溶液を沸騰させてアガロースを溶かし、粘性のあるうちに冷めたら注ぎます。ティッシュ上でオブジェクトを数秒間わずかに乾燥させて、余分なパラホルムアルデヒドを取り除きます。つまようじまたは鉗子を使用して、植物オブジェクトをアガロースに慎重に埋め込み、向きを変えます。
斜めの部分を防ぐには、オブジェクトの軸がビブラトームブレードの平面に垂直になるように、オブジェクトが正しく配置および成形されていることを確認してください。アガロースの固化を促進するには、ペトリプレートまたはマルチカルチャープレートを摂氏4度で10分間置きます。ブレードを使用して、アガロースブロック内のオブジェクトを慎重に切断して成形し、切片作成の好ましい方向に注意してください。
アガロースブロックまたは大きなゴールを貼り付け、シアノアクリレートまたはインスタント接着剤とマスキングテープを使用して検体ホルダーに正しく取り付けます。ゴールの厚さとサイズに応じて、セクションの厚さ、速度、振動振幅を調整します。蒸留水を水浴に加え、切片化から始めます。
鉗子またはブラシを使用して切片を慎重に収集し、1ミリリットルの1X PBSバッファーを含むマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブから1X PBSを取り出し、200〜500マイクロリットルの透明化溶液を追加します。サンプル処理中にしばらくしてから色が変わった場合は、透明溶液を新しいものと交換してください。
透明化液に5%のカルコフルオール白色染色剤を調製することにより、産卵植物細胞の細胞壁に対してカルコフルオール白色染色を行います。次に、暗所で細胞を少なくとも5分間染色します。テキスト原稿に記載されているように、脂質をナイルレッドで染色し、リグニンを塩基性フクシンリグニン染色で染色し、クリアされたセクションを顕微鏡スライドにマウントします。
次に、落射蛍光または共焦点顕微鏡で細胞を観察します。複数の蛍光スペクトルを同時にイメージングするには、複数の取得モードを使用します。病原虫の動態と病原菌の蓄積をマラリアブラナ属のコロニー形成で追跡し、ナイルレッド染色後にP.brassicaeの休止胞子を持つ大きな細胞が観察されました。
P.brassicae感染時の木部分化の変化は、基本フクシン染色を用いて可視化した。pHCA2:erRFPコンストラクトを有するシロイヌナズナ植物を用いて、師部組織におけるHCA2遺伝子発現を内根ゴール内の可視化した。HCA2は、アブラナ属の胆汁発生の後期に師部と共局在し、その遺伝子活性は、アブラナ属の師部複雑さを増加させるメカニズムを反映していました。
接種後16日目に、発育中のゴールにおけるTCS:GFPマーカーの発現を確認することにより、感染した植物と非感染植物の間のサイトカイニン応答の違いを評価しました。サイトカイニン応答は、感染したゴールでは有意に減少しているように見えますが、特に師部プールでは、非感染植物では強いままでした。最も重要なステップは、PFAの固定、埋め込み、およびセクショニングです。
ビブラトーム切片の場合、高品質の切片を得るために、速度、振幅、および厚さのパラメータを最適化し、慎重に調整する必要があります。ビブラトーム切片作成と組織クリアリング技術は、植物と微生物の相互作用中の生理学的応答と複雑な細胞解剖学的構造を伴う二次成長を示す組織の顕微鏡分析を強化するための道を開いた。
概要
Plasmodiophora brassicaeによって引き起こされるガルの組織学的イメージングの改良された方法をこのプロトコルで概説します。下胚軸のバイブラトーム切片と蛍光イメージングを活用し、疾病進行中の転写因子と植物ホルモンの役割を研究します。
主要な研究構成要素
研究領域
- 植物-病原体相互作用
- クラブルート病の動態
- 組織学的イメージング技術
背景
- Plasmodiophora brassicaeは、ブラシカ属植物に影響を与える必須の生物栄養病原体です。
- 病原体は宿主植物にガルと複雑な生理学的再プログラミングを引き起こします。
- 感染中の内部変化を理解することは、疾病メカニズムを理解する上で重要です。
使用した方法
- 改良された顕微鏡分析のためのバイブラトーム切片と組織クリアリング
- 遺伝子発現の視覚化のためのレポーター構成子を発現するアラブイデプシス植物
- 生理学的反応と遺伝子発現の変化をモニターするための蛍光イメージング技術
主要な結果
- ガル発育中の遺伝子発現と植物ホルモンバランスの強化された視覚化。
- 感染した植物と感染していない植物の間のサイトカイニン反応の違いの観察。
- 病原体感染に対する応答の構造的変化の特定。
結論
- この研究は組織学的技術を通じた植物-微生物相互作用の分析のための実行可能なプロトコルを提示します。
- 結果は、クラブルート病のメカニズムと植物病理学の研究の潜在的な道筋のより深い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of gene expression and physiological responses in plant-pathogen interactions is critical for de-risking early discovery in crop protection and trait engineering. This protocol enables robust, quantitative imaging of internal tissue changes during Plasmodiophora brassicae infection, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The approach enhances portfolio decision-making by providing reproducible, scalable data on disease progression and host response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene expression changes in response to pathogen challenge.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing host-pathogen interaction at cellular resolution.
- Facilitates functional validation of candidate genes and pathways involved in disease susceptibility or resistance.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant tissue sections for downstream fluorescence-based assays.
- Standardizes imaging workflows for reproducibility and cross-study comparability.
- Delivers quantitative outputs on anatomical and physiological changes for screening platforms.
- Enables reliable evaluation of genetic or chemical interventions in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant imaging endpoints with translational biomarker strategies in plant pathology.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of crop protection traits.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes or treatments based on in situ evidence.
- Provides mechanistic insights to inform translational research in related plant-microbe systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant trait validation and disease mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of gene expression and physiological changes during infection.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible tissue sections for quantitative fluorescence imaging.
- Analytics: Generates robust measurements of gene activity, hormone responses, and anatomical changes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects cellular imaging outputs to disease-relevant phenotypes and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for diverse plant-pathogen and developmental studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in plant-pathogen studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging protocols for high-throughput and longitudinal studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes, traits, or interventions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to vibratome sectioning equipment and advanced fluorescence imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of fixation, clearing, and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to various plant species and pathogen-induced structures with protocol optimization.
- Sectioning and imaging parameters must be tailored to tissue size and complexity for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:36
Tissue Preparation and Fixation
2:13
Tissue Embedding and Sectioning
3:03
Vibratome Sectioning and Specimen Clearing
4:03
Staining Procedure and Microscopy
4:49
Results: Microscopic Analysis of the Biotrophic Interaction and Gene Expression Regulations Between Plasmodiophora brassicae and Arabidopsis Plants
6:06
Conclusion
