Name: ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶ、ショウジョウバエの腸内微生物叢を96ウェルプレートで高速にCFU計測する手法。自動画像解析ソフトウェアを用いて従来法より100倍速くコロニー形成単位を定量化できます。

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Kerwyn Casey Huang博士、Andrés Aranda-Díaz博士、Ted Cooper、およびLudington Labのメンバーは、このプロトコルの開発に関する貴重な意見を提供しました。資金は、NSF IOS助成金2032985、NIH助成金DP5OD017851、カナダカーネギー研究所助成金、およびカーネギー科学研究所の基金によって提供されました。

1.ハエの植民地化
注:この方法は、CFUの成長プレーティングによる培養可能な腸内細菌叢を持つハエの定量分析に適しています。グノトバイオティックハエを飼育するための詳細なプロトコルは、以前に公開されています12。
<ol><li>共生細菌種による安定したコロニー形成を確立する。<ol><li>新鮮な細菌培養物を準備し、室温で3分間400 x gで遠心分離してペレット化し、細胞ペレットをPBSに再懸濁してOD600を1.0にします。このプロトコルのために、Lactiplantibacillus plantarum(以前はLactobacillus plantarumとして知られていた)を一晩でOD600の2.0に増殖させた。</li>
		<li>フライバイアル内の食品に100 μLをピペットで送ります( 材料の表を参照)。均等に広げ、液体を15〜30分間吸収させます。</li>
		<li>20匹の無菌ハエを、標準バイアルからバイアルへの反転技術34を用いてこのバイアルに移す。各ハエはほぼ同量の細菌量35を食べるでしょう。あるいは、無菌卵を加えることができます。</li>
		<li>ハエを新鮮な滅菌食品に3日間毎日移します。これらすべてをバイオセーフティキャビネットで行い、滅菌技術を使用します(図1A-1)。</li>
	</ol></li>
	<li>CFU負荷を測定する前に、ハエを滅菌寒天水を含むバイアルに4時間移して、腸から一過性の細菌を取り除きます。寒天水バイアルは、ハエに水分源を提供しますが、ハエや表面のバクテリアには栄養を与えません。それらは標準的な食品と同じ滅菌フライバイアルで調製されますが、脱イオン水と1.5%寒天のみが含まれています。</li>
</ol>2. 96ウェルPCRプレートで個別にホモジナイジングフライ
<ol><li>ビードビータープレートを事前に準備してください。<ol><li>0.5 μmのガラスビーズ( 材料の表を参照)をビーズ測定トレイに注ぎます( 補足コーディングファイル1 S1-bead-measurer.stlを使用して3Dプリント)。すべてのウェルがいっぱいで水平になるようにトレイにビーズを広げてから、余分なビーズを円錐形のチューブに払い落として回収します。</li>
		<li>セミスカートPCRプレート( 材料表を参照)を測定トレイに逆さまに置き、測定トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。次に、すばやく裏返してビーズを移します。</li>
		<li>PCRプレート表面から余分なビーズを取り除き、ホイルで覆います。PCRプレートを検査して、すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認します。必要に応じて計量スクープを使用して、単一のウェルにビーズを追加します。静電気が原因でビーズがプレート表面に付着している場合は、測定トレイとPCRプレートの背面を70%エタノールで拭くかスプレーします。</li>
		<li>アルミホイルで覆います。多くのプレートはこの方法で調製し、オートクレーブ滅菌して後で使用するために保管することができます。使用の準備ができたら、96チャンネルピペッターを使用して各ウェルに100 μLのPBSを追加します(材料の表を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>均質化する前に、微生物コロニー化したハエを70%エタノールで表面滅菌します(ステップ1を参照)。<ol><li>ハエを100%CO2で5秒間麻酔します。小さな漏斗を使用して、麻酔をかけたハエをバイアルから1.5 mLの微量遠心チューブに移します(図1A-2)。この研究では、通常、チューブごとに25匹のハエが追加されました。</li>
		<li>直ちに~1 mLの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて10秒間反転混合します。次に、ハエを吸引しないように注意しながら、P1000ピペットでエタノールを吸引します。エタノールでもう一度繰り返し、次に滅菌PBSで2回繰り返します(図1A-3)。</li>
	</ol></li>
	<li>最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にして、ハエがキャップに入るようにベンチで数回強くたたきます。</li>
	<li>チューブを開き、鉗子を使用してハエをウェルに分注します(図1A-4)。各ウェルに1匹のフライを置きます(図1A-5)。ハエに麻酔をかけ続けるために、ロード中はプレートを氷の上に保ちます。</li>
	<li>サーマルボンドヒートシールフォイルを使用してプレートをシールします(材料の表を参照)。<ol><li>まず、ウェルの近くにある浮遊ビーズは、ホイルシールの漏れを引き起こす可能性があるため、取り除きます。ホイルの鈍い側がプレート上で下向きで、光沢のある側がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラー(材料の表を参照)を5秒間しっかりと押し下げます(図1A-6)。ハンドアプリケーター(材料の表を参照)で磨き、ホイルを固定します。 注意: シーリング不良はサンプル損失の原因です。</li>
	</ol></li>
	<li>プレートをプレートシェーカーに固定します。5分間ホモジナイズします(図1A-7)。ビードプレートをミニプレートスピナー(材料の表を参照)で350 x gで30秒間スピンダウンして、シーリングフォイルから液体を取り除きます。</li>
	<li>プレートを保持しながらホイルを取り除き、ウェルからフライホモジネートの液滴をはねかけないようにします。</li>
</ol>3.フライホモジネートの段階希釈とCFUプレートへのスポッティング
<ol><li>4つの長方形のMRS寒天成長プレート( 材料の表を参照)をバイオセーフティキャビネットに入れ、蓋を取り外します。このプロトコルでは、MRS寒天が L.プランタルムの成長に使用されました。これらのプレートを少なくとも10分間乾燥させます(注ぎたてまたは保管から冷やした場合は20分)。 注:プレートが濡れている場合、96ウェルプレートからの液滴が一緒に流れ、カウントが台無しになります。</li>
	<li>96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのPBSを添加して、3つの希釈プレートを調製します。P20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。</li>
	<li>セクション2で調製したサンプルプレートから11.1 μLのホモジネートを吸引することにより、1:10希釈を行います(図1A-8)。フライホモジネートとガラスビーズがピペットを詰まらせるため、ウェルの底ではなくウェルの中央から必ず引き出してください。ビーズが沈み、ハエの粒子が浮き、中間層がほとんど透明になります。</li>
	<li>11.1 μLを、ウェルあたり100 μLの滅菌PBSがすでに含まれている最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600rpmで10秒間保持します。5サイクル上下にピペッティングして再度混合します。11.1 μLを第1希釈プレートから第2希釈プレートに移し、次の2つの希釈プレートに対して混合ステップを繰り返します。</li>
	<li>下記のように希釈系列めっきを行う。<ol><li>バイオセーフティキャビネットから成長プレートを取り出します。</li>
		<li>最も希薄なプレートから始めて、96ウェルピペッターを使用して、各ウェルから寒天プレートに2 μLスポットします(図1A-9)。<ol><li>寒天に刺さらないように注意しながら、ピペッターヘッドをゆっくりとプレートの上に下げます。プレートを注意深く調べ、すべてのスポットが分配されていることを確認します。そうでない場合は、適切な位置に手動で2 μLを追加します。液体スポットが寒天にすばやく浸り、一緒に流れないことを確認してください。</li>
			<li>スポットが一緒に走る場合は、新しい寒天プレートのセットを長期間乾燥させ、スポッティングをやり直します。複数のプレートタイプがある場合(例:異なる培地または抗生物質を使用)、それらも見つけてください。残りの溶液を希釈プレートに分注し、次に高い濃度に進みます。 注意: 希釈液を見つけるときは、次の希釈液を5回混合して、ピペットチップの内容物から前の希釈液が確実に除去されるようにします。希釈プレートは、コロニー数35に影響を与えることなく、4°Cで>8時間保存できます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>残りの希釈プレートについてステップ3.5で説明したようにメッキプロセスを繰り返し、元のホモジネートを含むプレートまで、最も希薄なものから最も濃縮されたものへと進行します。</li>
	<li>すべての液体が寒天に吸収されたら、プレートを反転させてインキュベーターに入れます(図1A-10)。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスおよびアセトバクターの場合、MRS培地の最適温度は30°Cです。コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします:コロニーはそれらをはっきりと見るのに十分な大きさですが、それらが融合したり互いの成長を妨げたりするほど大きくはありません(最適なサイズの定量化については、代表的な結果を参照してください)。 注:最適な成長条件は菌株に依存し、経験的に決定する必要があります。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスの場合、最適なインキュベーション時間はMRS寒天培地で26時間から30時間です。ショウジョウバエ由来のアセトバクターの場合、最適なインキュベーション時間は、菌株に応じてMRSで30時間から48時間です。</li>
	<li>インキュベーション後、必要に応じてプレートを4°Cでカウントする準備ができるまで保管します。</li>
</ol>4. CFUの定量化
<ol><li>プレートを撮影し、以下に詳述するように、自動化されたソフトウェアを使用してコロニーをカウントすることにより、CFUを定量化します。プレートを4°Cで保管する場合は、まず室温に到達させて、プレートに結露があってグレアが発生しないようにします。</li>
	<li>プレートを論理的な順序で整理し、撮影中にその順序で保持すると、ファイルに名前を付けやすくなります。A1がすべてのプレートの左上隅になるように、すべてのプレートの向きを設定します。写真が混同されないように、A1コーナーに一意のIDのラベルを付けることをお勧めします。各希釈系列を順番に積み重ねます。</li>
	<li>プレートの蓋を外し、A1を正しい隅に向けてプレートをステージに置きます。プレートフォトボックス(補足ファイル1、補足ファイル2)のデザインは、これらのトレイプレートの撮影に最適化されており、蛍光コロニーを画像化するための照明とフィルターのオプションが含まれています。</li>
	<li>プレートをイメージします。カメラ( 材料表を参照)を手動設定で使用して、プレート間で一貫した露出レベルを実現します。遠近法の歪みを最小限に抑えるために、焦点距離を長く設定することをお勧めします。手ぶれによるぼやけを最小限に抑えるために、リモートシャッターを使用して写真をキャプチャします。</li>
	<li>画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、希釈係数、その他の関連する詳細など、名前を変更します。一部のオペレーティングシステム( 材料表を参照)には、Finderで選択したファイルを右クリックして便利なバッチ名前変更機能があります。</li>
</ol>5. Count-On-Itスイートを使用した自動コロニーカウント(補足ファイル3)
<ol><li>ImageJ用に提供されているCroptacularプラグイン(補足コーディングファイル2)を使用して画像をトリミングします。このプラグインは、画像を整然としたサブ領域の配列に分割するのに役立ちます(たとえば、96ウェルプレートの場合は8 x 12)。サブリージョンは個別にカウントされます。 注:サーカスと呼ばれる円形プレートをカウントするための別のプラグインは、 補足コーディングファイル3 Circus_.ijmに記載されています。<ol><li>定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名を選択します。これらのファイル名は、カウントのセットごとに列タイトルになります。このフォルダ内で、「トリミング済み」および「レシート」という名前のサブフォルダを作成します。</li>
		<li>クロプタキュラーを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。 メモ:デフォルト設定が表示され、通常は十分です。画像の解像度、照明、スポットサイズなどに応じて、基本パラメータを調整すると便利な場合があります。</li>
		<li>画像がすでにまっすぐになっている場合は、 スペースキーを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて画像をまっすぐにします。それでも画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を再描画します。</li>
		<li>次に、カウントを行う領域の境界ボックスを描画します。すべてのスポットがセル内に入るまで、サイズと比率を調整します。カーソルを境界ボックスの外側にドラッグして、グリッドを更新します。グリッドに問題がなければ、 Space キーを押します。</li>
		<li>次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認します。プラグインは、すべての写真が同じ位置に配置されていることを前提としています。これが正確な場合は、 スペース キーを押して続行します。それ以外の場合は、前と同じように画像を傾き補正します。グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。必要に応じて調整し、 Space キーを押します。</li>
	</ol></li>
	<li>提供されている Count-On-It: Gridiron プラグイン for ImageJ (補足コーディングファイル 4) を使用して、プレート上のコロニーを列挙します。プラグインのインストールと使用の詳細な手順は、 補足ファイル3に含まれています。<ol><li>グリッドアイアン>カウントオンイットを起動します。 クロプタキュラーと同じグリッド設定を使用します。ユーザーは、フォルダー全体をバッチ処理したり、1 つの画像を分析したり、現在の画像から開始したりできます。</li>
		<li>ピクセル強度の上限と下限に基づいてしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。理想的には、選択したコロニーの間にいくらかのスペースがありますが、ソフトウェアはブロブをある程度セグメント化することができます。しきい値が満足のいく場合は、[アクションが必要]ダイアログボックスで [OK ]をクリックします。</li>
		<li>結果を調べるには、拡大してコロニー数をより詳しく調べます。[キャンセル] をクリックすると、プラグインが中止されます。[ OK] をクリックして続行します。</li>
		<li>最初の画像で、続行するか、セットアップメニューに戻るオプション(たとえば、最小コロニーサイズを変更する)が指定されていることを確認します。バッチ処理を続行するには、[ OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。「領収書」フォルダを使用するか、新しいフォルダを作成します。</li>
		<li>最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。[ OK ] をクリックしてこれらの設定を使用するか、設定を調整します。写真に一貫性があり、設定が正確な場合は、[アクションが必要]ダイアログボックスで [OK ]をクリックします。 注:バッチ内のすべての画像が完了すると、結果テーブルは領収書と同じフォルダに自動的に保存されます。</li>
		<li>ソフトウェアによって生成されたカウントレシートを確認し、カウントエラーを手動で修正します。ImageJ プラグインは統計的に正確ですが、エラーが発生します。領収書を証明して外れ値を調べ、ミスカウントを特定します。ソフトウェアは、CFUデータをレシートと同じフォルダに.csvファイルとして保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>ユーザーが好むソフトウェアを使用してデータを分析します。</li>
</ol>

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著者は開示するものは何もありません。

ここで紹介する詳細な手法により、CFUカウント実験で評価できるサンプル数を>100倍に増やすことができます。この技術は、ショウジョウバエ12,35,36におけるマイクロバイオーム実験の既存の方法を、96ウェルプレートフォーマットを使用して個々のハエをアッセイすることにより進歩させます。さらに、より効率的なスポットプレーティング法19、31および写真およびコロニー計数プラットフォームを備えた自動化されたワークフローを適用する。ショウジョウバエにとってのこの方法の意義は、実験を96ウェルプレートフォーマットに標準化し、CFUのハイスループット定量化を自動化して多数の生物学的複製を同時に処理できるようにすることです。
96ウェルプラットフォームは、移動頻度の増加と一過性細菌の「除去」が、平均存在量とサンプル間の変動の両方を大幅に減少させることを示しており(図1B、C)、この改善されたプロトコルの厳密さを示しています。コハウジングハエの1つの制限は、ハエ間の細菌の水平移動です。提案された解決策は、ハエを96ウェルプレートフォーマット(Whole Animal Feeding Flat38など)に個別に保管することです。
ハエをエタノールで洗浄した場合、細菌量の有意な減少は観察されなかったが、これらのハエは外部細菌の存在下で3日間しか飼育されていなかった。長期間収容すると、より大きな細菌負荷が蓄積する可能性があります39。したがって、エタノールでの洗浄が依然として推奨されます。
ハエを96ウェルプレートに移すことは、ワークフローを設定するための重要な最初のステップです(図1A)。ハエが洗浄されると、それらは一度に1つずつウェルに分配されます。プレートチャートは、この段階で、各ウェルにどの条件が存在するかを記録し、「ハエが失われた」などのメモを追加するのに役立ちます。均質化は、いくつかの重要な注意点があるもう一つの重要なステップです。バクテリアはハエの存在下で均質化プロセスを生き延び(図1D、E)、おそらくこの原理はバクテリアがハエの腸内にいる場合にも当てはまります。しかし、細菌はビーズビータープレートのみで均質化されると死滅し、均質化が特定の状況で細菌細胞を殺すことができることを実証しており、例えば解剖された腸を均質化する場合に重要であり得る制限。特に、均質化時のCFUの損失はサンプル中のCFUの数に依存し、ウェルあたり~105 CFUを使用した場合の損失は最小限に抑えられます。CFUのさらなる保存は、均質化を途中で停止し、氷上でプレートを冷却することによって達成することができる。
このプロトコルでは、既知の数のCFUを無菌ハエと混合した対照実験に基づいて均質化を5分間実行し、これはハエ菌に対して経験的に機能しました。叩解が少ないとフライパーツが大きくなり、ピペッティングが妨げられますが、均質化時間が~10分と大幅に長くなると、CFUカウントの変動が大きくなります。円錐プレートウェルの体積と角度の付いた形状が小さいと、円筒形の2 mLチューブと比較してビーズの叩解効率が低下することが観察されました。この一般的なアプローチには、どの細菌株、どのビーズビート容器、どのビーズ、どのハエ遺伝子型が使用されるかなど、多くのバリエーションが可能です。個々のユーザー ケースでは、ポジティブ コントロールを使用してアプローチを確立する必要があります。
スポットプレーティング法は、PBS中の L. plantarum WFの1:2希釈をMRSプレートにスポットし、30°Cで2日間インキュベートするという特定の方法で採用されました(より小さなコロニーサイズを生成するために、より短いインキュベーション時間を実施できます)。この方法では、主にビーズビーターと96チャンネルピペッター(図2A)などの装置への先行投資が必要であり、希釈シリーズとスポットメッキの両方が必要です。ただし、スロット付きピンを備えた96ウェルプレートリプリケーターなど、より安価なオプションが利用可能です。希釈シリーズは、CFU計数結果の精度に影響を与える重要なステップです。故障モードに関しては、フライ部品やガラスビーズでピペットチップを詰まらせたり、ピペットチップがピペッターに適切にシールされなかったり、その他の理由で故障したりする可能性があります。これらすべての問題は、影響を受ける井戸の過小評価をもたらすため、監視する必要があります。希釈シリーズの各ステップでの適切な混合も重要です。各希釈液は、プレートをプレートシェーカーに置くか、チップをすすぐのにも役立つ15〜20回上下にピペッティングすることによって完全に混合する必要があります。最も希薄なプレートから最も希薄でないプレートまでスポッティングすることで、チップを希釈シリーズ全体に再利用できます。1:2希釈では、2〜25コロニーの範囲でカウントが正確であり、桁違いにまたがります(図2C)。したがって、1:10希釈は時間と材料を節約できます。利用できる別の変数はインキュベーション時間であり、これはより小さなコロニーを生成するように調整することができ、したがって、隣接するコロニーの合流を防ぐことによってカウント可能なスポットの範囲を広げることができる。
プレートの高品質な写真は、CFUが分析され、無期限にアーカイブできる生のソースデータになるため、不可欠です。FluoroBoxは、寒天表面のまぶしさを最小限に抑える均一な光強度でプレートの写真を生成するように設計されています。さらに、この設計は、単色LEDライトとカラーフォトフィルターを使用して蛍光コロニーを選択的に撮影することができます(図3A)。照明とカメラの設定を制御したFluoroBoxのようなセットアップを構築することで、自動分析に重要なCFU画像の再現性を大幅に向上させることができます。コロニーの形態、蛍光強度、コロニーの成長に対する時間または密度の影響は、写真を使用して分析できる特性のほんの一部です。フォトボックスは、蛍光細菌を使用しない場合、カラーフィルターと単色ライトなしで構築できるため、コストと複雑さが軽減されます。ラボで異なる蛍光色素を使用する場合は、ここで推奨されているものの代わりに異なる励起光と発光フィルターを使用できます。アプリを使用してWiFi経由でタブレットに接続されているカメラは、揺れを防ぐための自動シャッター機能とデータ転送の容易さの両方に役立ちます。画像はタブレットに転送してから、ワイヤレスファイル転送ソフトウェアを使用してラップトップに転送できます。これらの機能を備えた推奨カメラは、 材料の表に示されています。
カウントオンイットは、ImageJで書かれたプラグインです。自動CFU計数ソフトウェアは、プレート画像を均一な96ウェルグリッドに分割し、各グリッドセルのコロニーをカウントし、結果を単純なスプレッドシートにバッチ処理します。プレート上と写真内のスポットグリッドの位置は常に変動するため、ユーザーはCroptacularプラグインを使用してグリッドを写真に手動で適合させる必要があります。これは、グレアのあるプレートエッジ近くの領域を除外するのにも役立ちます。しきい値の設定は、画像から最も正確なCFUカウントを取得するための鍵です。しきい値の設定が高すぎると、コロニーがマージされます。しきい値の設定が低すぎると、コロニーは除外されます。閾値が設定されると、マクロはガウスぼかしを適用してエッジを柔らかくし、エイリアシングを減らし、流域フィルターは重なり合うコロニーを分割し、ブロブはパーティクルの分析を使用してカウントされます。 
時々、コロニーの密度が特定の場所で高すぎる。Count-On-Itは、これに対処する方法を提供します。部分的に結合したコロニーを有するグリッドセル内のコロニー数を推定するために、最初にプレート全体からの円形ブロブの平均面積をCavgとする。次に、ブロブA1の面積を円形ブロブAの平均面積1 / C平均で割る。 この数値は最も近い整数に丸められ、BLOB 内のコロニー数の推定値になります。この関数は、しきい値がカウント結果に影響を与える可能性がある理由の 1 つです: 相対的な平均コロニー面積とマージされたブロブ面積は、しきい値がマージされたブロブにどのように影響したかによって異なります。
提示されたメソッドにはいくつかの制限があります。これには、96ウェルプレートから液体媒体を正確に分注するための機器の必要性が含まれます。この装置は、96チャンネルのピペッターまたはスロット付きレプリケーターピンツールのいずれかで、入手に数千ドルかかる可能性があります。より安価な代替手段は存在しますが、精度は低くなります。カウントオンイット による 自動カウントには、いくつかの制限もあります。たとえば、混合母集団の 2 つのコロニー タイプがサイズのみに基づいて区切られている場合、BLOB カウントではコロニーを正しいタイプに割り当てることができません。この場合、ブロブのあるスポットはカウントから削除する必要があります。形態学に基づくコロニーのさらなる分化は、現在実施されていない方法の貴重な拡張となるであろう。菌株特異的栄養素や抗生物質などの選択培地を使用することで、複雑な画像解析の必要性が簡素化されます。
ショウジョウバエ実験を96ウェルプレートで維持すると、1回の実験でテストできるサンプル数と条件が増え、 ショウジョウバエと細菌の関連表現型のハイスループットスクリーニングが容易になります。この方法は、選択培地を使用して複雑な混合物中の多くの細菌株を区別することにより拡張できると考えています。この方法は、ハエの微生物叢の研究に限定されない。CFUの定量化は、飲料水中の大腸菌群数から病原体の特定まで、微生物学の多くのアプリケーションで一般的です。ここで紹介するCFUメッキシステムは、ハイスループットスクリーンだけでなく、結果の取得、処理、保存、および配信を自動化します。

腸内細菌叢とその動物宿主との関係は、微生物叢の菌株組成が宿主生理学にとって重要であることを示す生物学的研究1の最前線にますます進んでいます2,3,4。発見のペースは、高い自然の個体間変動やコロニー形成細菌の多様性の高さなどの交絡因子によって制限されてきました5,6,7。ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターは、その自然に多様性の低い微生物叢、取り扱いの容易さ、および堅牢な宿主遺伝学のために有望なモデルとして浮上しています8,9,10,11。ハエは無菌にすることができ、定義された微生物叢12と再関連させることができ、フローラがハエの生理学的形質に影響を与えることが示されています13,14。先天的な細菌叢は、すべて培養可能な限られた細菌のセットで構成されており、これらの近親者も、乳酸菌、プロテオバクテリア、腸球菌などの哺乳類の腸に内因性です15。
宿主形質に対するマイクロバイオームの影響を研究するには、存在する種とその絶対存在量の両方の観点からマイクロバイオームを定量化する必要があります16。ハエマイクロバイオームを分析する主な方法は、コロニー形成単位(CFU)カウント17、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング9、および16S rRNA遺伝子のqPCR18です。CFUカウントは、高価な試薬なしで得ることができ、それらは細菌細胞の生存率を確認する19。qPCRを含む16S技術には、微生物の成長要件やコロニーの形態に関係なく、微生物の分類学的同一性を確認できるという利点があります20。
実験で既知の細菌の定義された微生物叢を持つハエを使用する場合(グノトバイオティックハエ)、CFUカウントはシーケンシング21よりも特に有利です。シーケンシングは高価であり、相対的な存在量を得るためには、DNA抽出、PCRベースのライブラリ調製、およびハイスループットシーケンシングが必要です22。コストが高いため、ハイスループットシーケンシング法は、通常、サンプルあたりの価格を下げるために一括で実行する必要があります23。絶対存在量を得るためには、qPCRなどのさらなる方法が必要です16。対照的に、CFUカウントは迅速かつ安価であり、生細胞の絶対数を示します。ショウジョウバエ8と、ワームを含む他の小さな微生物叢モデル24、Caenorhabditis elegans25,26、および幼虫のゼブラフィッシュ、ダニオレリオは、グノトビオティックに成長しました27、既知の成長特性28を持つ細菌の範囲が限られています。これらの場合、特にグノトバイオティック動物では、CFUカウントは、多種の腸内コミュニティ内のすべての種の細菌を区別することができます21、27、29。ハイスループットCFU計数法は、マイクロバイオームの組成を測定する費用対効果と速度をさらに向上させ、他の多くの微生物学実験に適用できます。
寒天ベースの増殖培地上の細菌懸濁液の段階希釈プレーティングによるCFUの計数は、微生物学の分野全体の標準的な方法です。プレート上で成長するコロニーは、手動でカウントされます。希釈により、研究者はカウント可能なコロニーの密度(例えば、プレートあたり~100CFU)を選択できるため、コロニーは互いに成長せず、妥当な時間でカウントできます。ほとんどの微生物学者は、140年前にRobert Kochの研究室で開発されたのと本質的に同じCFU計数法を使用しており、多くのアプリケーションでは、この方法は依然として適切です。しかしながら、多数のサンプルを定量しようとすると問題が生じる。単一のサンプルでは、カウント可能なCFUを得るためにサンプルの1〜10段階希釈をメッキする必要がある場合があるため、数十を超えるサンプルを含む実験には負担がかかります。CFU列挙の効率を高めるために、さまざまな方法が開発されています。自動スパイラルメッキにより、連続希釈30が不要になり、CFUカウントに必要なプレートは1つだけになりますが、サンプルをプレート化する時間が長くなります。シングルプレートシリアル希釈スポッティング(SP-SDS)は、サンプル31あたりのより少ないプレートからのCFU推定を可能にします。これらの方法は、従来のスプレッドプレーティング法を改良したものですが、細菌サンプルの取り扱いとメッキを単独で行う必要があるため、ハイスループットには理想的ではありません。96ウェルプレートでサンプルを処理し、それらの96サンプルを長方形の寒天プレートにスポットプレーティングすることで、サンプル19のスループットが大幅に向上します。
マイクロバイオームは通常、複数の株と種で構成されています。種はしばしばコロニー形態または成長培地によって区別することができるが、蛍光は、異なるタイプの細菌およびそれらの成長形質をさらに区別するために使用することができる32。例えば、同じ種の異なる遺伝子型は、異なる遺伝的にコードされた蛍光タンパク質で標識することができる。蛍光を組み込んだプレートイメージング法により、研究者はCFUベースのアッセイ32においてこれらの遺伝的手法を利用することができる。蛍光をハイスループットCFU計数法に組み込むことで、その有用性がさらに高まります。
サンプル数が多い場合、CFUを手動でカウントするのは面倒になります。CFUの自動計数は、プレートを撮影し、専用ソフトウェア33を用いて画像を処理することによって行うことができる。Sieuwertsらは、スポットプレーティングの改善されたメッキ効率と、従来のデジタル写真とImageJソフトウェアを使用した自動コロニーカウントを組み合わせました19。
特定の微生物の表現型と宿主の関連をスクリーニングするハイスループット法は、微生物叢のコミュニティアセンブリと宿主の健康とフィットネスへの影響の研究に役立ちます。 ショウジョウバエ の微生物叢の研究には、ハイスループット微生物学プラットフォームには、96ウェルプレートフォーマットでのフライサンプルの取り扱い、細菌溶解なしのフライ溶解、スポットプレーティングの効率、蛍光を使用して複数の蛍光色素を区別する機能、CFUプレートの再現性のあるイメージングのための制御された光環境、および信頼性の高い自動コロニーカウントソフトウェアが組み込まれます。この記事では、グノトバイオティックハエのCFUアッセイに最適化された、シンプル、高速、自動化された方法について説明します。このプロトコルは、以前に発表された最良の方法を組み合わせて、 ショウジョウバエの腸内細菌叢を探索するために最適化された新しいワークフローの概要を示しています。

<table><tbody><tr><td>Bead Bead Beating</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>オートクレーブ可能な</td></tr><tr><td>フライバイアルストッパー</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td>オートクレーブ可能な</td></tr><tr><td>ハンドアプリケーター</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシーラー</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater ガラスミルビーズ、0.5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 ミニPCRプレート スピナー</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>レイニン ベンチスマート 96 半自動ピペッター</td><td>メトラー・トレド</td><td>30296705</td><td>VPのスロット付き96ウェルピンツールを含む安価なオプションが利用可能</td></tr> Scientific <tr><td>TempPlateセミスカート96ウェルPCRプレート、ストレートスカート、ナチュラル</td><td>USA scientific</td><td>1402-9220</td><td>ヒートシーラー用ポリプロピレンでなければなりません</td></tr><tr><td>サーマルボンドヒートシールホイル</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td>無<td>菌トレイ</td></tr><tr><td>プレート、128 x 85 mm、ポリスチレン、滅菌</td><td>SPLライフサイエンス</td><td>31001</td>長方形の<td>寒天プレートを作るため</td></tr><tr><td>フォトボックス構造</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14;"-20 X &frac12;&rdquo;ボルト(X2)</td><td>Amazon</td><td>のASIN:B07BP1WR3H</td><td>カメラブラケットを取り付けるため。ブランドは重要ではありません。任意の1/4 "-20 1/2"ボルトが機能します。</td></tr><tr><td>&frac14;"-20 x &frac12;&rdquo;コネクタナット&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC:</td><td>799862376780 別名キャップナットまたはコネクタボルト。プレートホルダーに輪ゴムを取り付けるためのものです。ブランドは重要ではありません。</td></tr><tr><td>&frac14;"-20 x &frac34;&rdquo;ボルト(X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN:B003QZSZY4</td><td>プレートホルダー用。ブランドは重要ではありません。</td></tr><tr><td>1/8インチ x &frac12;&rdquo;ワッシャー</td><td>Amazon</td><td>UPC:</td><td>ボックスの外側にあるキャップナット用の611982484599ワッシャー。ブランドは重要ではありません。アクリルと馴染ませるために貼り付ける前に黒をスプレーペイントします。</td></tr><tr><td>18 ゲージ ワイヤ - 2 導体電源ワイヤ - 18 AWG Power Wire &ndash; 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG 赤色ワイヤナット - WN-R2210 &ndash; 数量 4Superbrightleds.com</td><td></td> <td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in メス プッシュオンコネクタ - 22-18 AWG &ndash; Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4インチ無はんだクランプオンジャンパーコネクタ - 8mm単色LEDストリップライト - 数量3</strong</td><td>>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4"無はんだクランプオンピグテールアダプター - 8mm単色LEDストリップライト &ndash; Quantity 3</strong</td><td>>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6インチの引き出しハンドル</td><td></td><td>AmazonASIN:B07Z331P99</td><td>どの引き出しハンドルでも機能するはずです。</td></tr><tr><td>6インチ引き出しスライド</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>引き出しスライダーのソフトクローズラバーストッパーをトリミングします。</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12;&rdquo;キャップナット(x4)</td><td></td><td>AmazonASIN:B00HYLZB98</td><td>ボックスの外側に引き出しスライドボルトを取り付けます。ブランドは重要ではありません。ナイロンはアクリルを傷つけません。アクリルと馴染ませるために貼り付ける前に黒をスプレーペイントします。</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12;&rdquo;ナイロンボルト(x4)</td><td></td><td>AmazonASIN:B07KX9T7NF</td><td>引き出しスライドを取り付けるため。ブランドは重要ではありません。仕様を満たすボルトまたは小ネジは機能します。ナイロンはアクリルを傷つけず、ボルトをナットと同じ高さにカットできます。アクリルと馴染ませるために貼り付ける前に黒をスプレーペイントします。</td></tr><tr><td>アクリル接着剤</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean:7844908489337</td><td>SCIGRIP溶接オン#4接着剤、パイント、溶接アプリケーターボトル、ニードル</td></tr><tr><td>ブラックケーブルタイ付き-10パック-長さ4インチ&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>カメラ L ブラケット</td><td>WLPREOE、Vikerer、無印</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>カメラが L の「外側」に来るように、ブラケットを意図した構成から「反転」させる必要があります。ブラケットには、2つの部分に分かれていて、この代替構成を可能にするものもあれば、そうでないものもあり、反転できるものが必要になります。また、取り付け用の1/4インチの穴が必要です。WLPREOE、Vikerer、ノーブランド。例として提供されるAmazonシリアル識別番号。</td></tr><tr>テザリングオプションまたは<td>キヤノン、パナソニック、ソニー、ニコンなど</td><td>のためのキヤノンTシリーズカメラ</td><td>1894C002</td><td>Canon Tiシリーズカメラは、コンピューターにテザリングできる優れたオプションです。18-55mm標準キットレンズと併用してください。キヤノンT5からT7(現行モデル)までの使用が推奨されています。</td></tr><tr><td>カスタム長さ単色LEDストリップライト - エコシリーズテープライト - 24V - IP20 - 250 lm / ft - 青 - 2メートル</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>カスタム長単色LEDストリップライト - エコシリーズテープライト - 24V - IP20 - 250 lm / ft - 緑 &ndash; 2メートル</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>カスタム長さ単色LEDストリップライト-エコシリーズテープライト-24V-IP20-250lm / ft-ナチュラルホワイト4000K&ndash;2メートル&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>ドリル&frac14;"、1/8"ドリルビット</td><td>ブラック &デッカー</td><td>&lrm;BDCDD12PK</td><td>ブランドは重要ではありません。&nbsp;</td></tr><tr><td>フラットブラックスプレーペイント、&nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>すべてのインテリアをフラットブラックにペイントします。ブランドは重要ではありません。</td></tr><tr><td>レーザーカットアクリル壁</td><td>ビッグブルーソー</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>添付のPDFを使用して、カメラ用の目的の穴を除くトップピースのすべての切り欠きを削除します&nbsp;</td></tr><tr><td>Mean Well LEDスイッチング電源 - LPVシリーズ 20-100W 単一出力LED電源 - DC 24V - 20ワット&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>パナソニック ZS100 電話、タブレット、またはコンピューターへの Wi-Fi 接続用</td><td>キヤノン、パナソニック、ソニー、ニコンなど。</td><td>DMC-ZS100K</td><td>パナソニックのカメラは、データ転送やリモートシャッターオプションのためにコンピューターにワイヤレスで接続できます。使用済みのオプションは良いです。</td></tr><tr><td>クイックリリースプレート</td><td>Neewerアルミニウム50mmクイックリリースプレートQRクランプ3/8インチ、1/4インチASIN付き</td><td>:B07417F21D</td><td>これをブラケットに追加して、カメラを簡単に取り外してカラーフィルターを変更できるようにします。例として提供されるAmazonシリアル識別番号。</td></tr><tr><td>輪ゴム、各種サイズ</td><td>BAZIC製品</td><td>アライアンスラバー26649</td><td>輪ゴムはプレートホルダーに取り付けられます。ブランドは重要ではありません。</td></tr><tr><td>ネジ/接着ケーブルタイ取り付けベース - 3/4インチベース &ndash; 数量 4</strong</td><td>>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST 丸型ロッカースイッチ - LED なし &ndash; Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 フィルター (赤) 72 mm&nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 58 フィルター (緑) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>フリー.ちょうど引用:Schindelin、J.、Arganda-Carreras、I.、Frise、E.、Kaynig、V.、Longair、M.、Pietzsch、T.、&hellip;カルドナ、A.(2012)。フィジー:生物学的画像分析のためのオープンソースプラットフォーム。ネイチャーメソッド、9(7)、676&ndash;682。doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Finderには、写真のグループの名前を変更してCount-on-itでの整理と分析を容易にする便利なバッチ名前変更機能があります。</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64ビット</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>64ビット</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

動物の腸は共生微生物によってコロニー形成され、宿主の発達、健康、行動に影響を与えます。コロニー形成の正確な定量は、微生物組成を検証し、その影響を研究するために、宿主と微生物の間の複雑な相互作用を研究するために不可欠です。 ショウジョウバエメラノガスターは、天然微生物の多様性が低く、定義された微生物組成で飼育するのに経済的であり、腸内細菌叢を研究するためのモデル生物として浮上しています。個々の生物の微生物叢を分析するには、どの微生物種が存在するかを特定し、それらの絶対的な存在量を定量化する必要があります。この記事では、多数の個々のハエの微生物叢を分析する方法を紹介します。ハエは96ウェルプレートで調製され、一度に多数のサンプルを処理することができます。微生物の存在量は、1つの寒天プレート上に最大96個の全フライホモジネートを一連のスポットでメッキし、各スポットで成長するコロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって定量化されます。このメッキシステムは、プレートの写真撮影、蛍光コロニーの分化、ImageJプラグインを使用したコロニーの自動カウントを組み込んだ自動CFU定量プラットフォームとペアになっています。利点は、(i)この方法は処理間の違いを検出するのに十分な感度であり、(ii)スポットめっき法は従来のめっき方法と同じくらい正確であり、(iii)自動計数プロセスは手動計数よりも正確で高速です。ここで紹介するワークフローは、多数の反復におけるCFUのハイスループット定量を可能にし、 in vitro やその他の小動物モデルを含む他の微生物学研究システムに適用できます。

この方法は、96ウェルプレートフォーマットを使用してコロニー形成単位(CFU)をプレート化し、ハエホモジネートサンプル全体の ショウジョウバエ 微生物叢に適用します。CFUは、ここで提供される自動画像解析ソフトウェアでカウントされます。

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

コロニー形成単位(CFU)のカウントは微生物学の標準的な手法ですが、時間がかかり、多くの寒天プレートが必要です。当社の技術は、両方の時間寒天プレートにおいて、従来のCFU計数法に比べて100倍の利点があります。この方法論を適用して、小動物モデル、特にショウジョウバエの腸内細菌叢を測定しました。このプロトコルは、グノトビオティックスハエのCFUを定量化するためのシンプルで高速かつ自動化された方法です。このプロトコルは、CFUを撮影するためのDIY製の機器と、それらをカウントを自動化するためのカスタムソフトウェアを使用したワークフローを提供します。このプロトコルは、より効率的なめっき法とCFU計数法が役立つ微生物学実験に使用できます。ハエを効率的に扱い、プレートを見つけるには手先の器用さが必要なので、これを実践する必要があります。自動計数ソフトウェアを使用するには、しきい値を判断する必要があるため、領収書を手動計数と比較して、実験に最適なパラメーターを特定する必要があります。 手順をデモンストレーションするのは、技術を開発した私の研究室の研究者であるRen Dodgeです。まず、0.5ミクロンのガラスビーズをビーズ測定トレイに注ぎます。すべてのウェルがいっぱいになって水平になるようにトレイにビーズを広げます。次に、余分なビーズを円錐形のチューブにブラシで取り除きます。次に、セミスカートのPCRプレートを逆さまに測定トレイに置き、測定トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。次に、すばやく裏返してビーズを移します。PCRプレート表面から余分なビーズを取り除きます。すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認してください。必要に応じて、計量スクープを使用して単一のウェルにビーズを追加します。次に、プレートをアルミホイルとオートクレーブで覆います。プレートを使用する前に、96チャンネルピペッターを使用してハエを追加する直前に、各ウェルに100マイクロリットルのPBSを追加します。麻酔をかけたハエを表面滅菌するために、小さな漏斗を使用してバイアルから1.5ミリリットルの微量遠心チューブにハエを移します。直ちに1ミリリットルの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて、10秒間反転混合します。次に、ハエを吸引しないようにしながら、P-1000ピペットでエタノールを吸引します。最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にしてベンチで数回強く叩いて、ハエがキャップに入るようにします。チューブを開いた後、鉗子を使用してハエをウェルに分配し、各ウェルに1匹のハエを入れます。ロード中にプレートを氷の上に置いて、ハエに麻酔をかけたままにします。ウェルの近くにある浮遊ビーズは、ホイルシールを破り、漏れを引き起こす可能性があるため、除去してください。シーリングフォイルの鈍い側がプレート上で下を向き、光沢のある側がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラーを5秒間しっかりと押し、ハンドアプリケーターで磨いてホイルを固定します。ハエを5分間均質化します。ハエが完全に均質化され、溶液が着色されていることを確認してください。シーリングホイルから液体を除去するには、30 Gのミニプレートスピナーでビーズプレートを350秒間回転させ、フライホモジネートの液滴が飛散しないように、プレートを保持しながらホイルを取り外します。蓋を開けた長方形のMRS寒天成長プレート3枚をバイオセーフティキャビネットに入れ、少なくとも10分間乾燥させます。96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを添加して、2つの希釈プレートを準備します。P-20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。サンプルプレートから11.1マイクロリットルのホモジネートを吸引して1:10に希釈します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの滅菌PBSを含む最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600 RPMで10秒間保持します。少なくとも10回上下にピペッティングして再度混合します。11.1マイクロリットルを最初の希釈プレートから2番目の希釈プレートに移し、さらに希釈するために混合ステップを繰り返します。プレートをスポッティングするには、各ウェルから2マイクロリットルを96チャンネルピペッターに入れます。寒天に刺さらないように、ピペッターヘッドをゆっくりとプレート上に下げ、すべてのスポットが分注されていることを確認します。次に、液体スポットが寒天にすばやく浸り、一緒に流れないことを確認します。原稿に記載されているように、残りの希釈プレートに対してメッキプロセスを繰り返します。液体が寒天に完全に吸収されたら、プレートを反転させ、コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします。プレートを論理的に整理し、撮影中は特定の順序で保管します。A1がすべてのプレートの左上隅になるように向きを変えます。プレートの蓋を外した後、A1を正しい隅に向けてプレートをステージに置きます。プレートをイメージします。画像をコンピューターに転送し、実験名、メディアタイプ、希釈係数、その他の関連する詳細を含む名前を変更します。定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名は、出力スプレッドシートの各カウント セットの列タイトルになります。フォルダー内に [トリミング済み] と [領収書] という名前のサブフォルダーを作成します。これらのフォルダーは、出力ファイルを受け取ります。次に、ImageJからクロプタキュラープラグインを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。ソースフォルダを選択するためのダイアログボックスがポップアップ表示されます。OK をクリックします。ソースフォルダを選択し、[開く]をクリックします。次に、ダイアログボックスで[OK]をクリックして、宛先ディレクトリを選択します。保存先フォルダを選択し、[開く]を押します。画像がすでにまっすぐになっている場合は、スペースキーを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて画像をまっすぐにします。画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を再描画します。次に、カウント領域の境界ボックスを描画し、すべてのスポットがセル内に入るまでそのサイズと比率を調整します。カーソルを境界ボックスの外側にドラッグして、グリッドを更新します。グリッドに問題がなければ、Space キーを押します。プラグインはすべての写真が同じように整列していることを前提としているため、次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認してください。これが正確な場合は、スペースキーを押して続行します。それ以外の場合は、前と同じように画像を傾き補正します。グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。必要に応じて調整し、スペースを押します。カウントオンイットを起動し、グリッドアイアンを選択します。上限と下限のピクセル強度値に基づいてコロニー強度のしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。しきい値が十分になったら、[アクションが必要] ダイアログ ボックスで [OK] をクリックし、[OK] をクリックして続行します。最初の画像では、続行するか、セットアップメニューに戻るかのオプションが与えられています。バッチ処理を続行するには、[OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。前に作成した [領収書] フォルダーを使用します。最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。[OK] をクリックしてこれらの設定を使用するか、設定を調整します。ソフトウェアによって生成されたカウントレシートを確認し、カウントエラーを手動で修正します。ImageJプラグインは統計的に正確ですが、エラーが発生します。領収書を証明して外れ値を調べ、ミスカウントを特定します。ソフトウェアは、CFUデータを領収書と同じフォルダにCSVファイルとして保存します。Lactobacillus plantarumにコロニーを形成したハエでは、接種後に無菌食品に移されなかったハエと比較して、毎日無菌食品に移され、毎日移送され、分析の4時間前に無菌食品に保持され、分析の4時間前に滅菌寒天に保持されたハエの細菌が有意に減少した。アセトバクター・インドネシアセンシスを投与したハエでも同様の結果が観察され、移植、移植後、および除去されたハエはCFUの有意な減少を示しましたが、洗浄は測定可能な効果をもたらさず、CFUの減少はキューティクルではなく腸からの細菌の除去によるものであることが示唆されました。スポットあたり2〜25コロニーのスポットでのCFUカウントは、従来の方法と比較して差を示さなかった。平均35コロニーのスポットは、対照スプレッドプレートよりも低いCFUを示した。この減少は、密集したスポットでコロニーが重なっていることが原因である可能性があります。プレート写真では、コロニー強度は背景より300%高かった。ラクトバチルスプランタルムmCherry陽性コロニーは、mCherry陰性コロニーよりも1, 000%高い赤色強度を示しました。アセトバクター・インドネシアエンシスGFP陽性コロニーは、GFP陰性コロニーよりも200%高い緑色強度を示した。ImageJ用のカウントオンイットプラグインは、プレート写真からのCFUカウントを自動化します。コロニーは正確に検出され、手動カウントに匹敵するカウントがあります。カウントレシートは、誤カウントを識別するために使用できます。サイズ閾値と蛍光波長を変更することで、異なるコロニー形態を個別にカウントすることができます。ビーズビーズをする前に、プレートがしっかりと密封されていることを確認することが不可欠です。また、測定値を校正するためのポジティブコントロールを設計することも重要です。また、この手法を使用して、96ウェルプレート内の細菌のin vitro集団を研究し、細菌の混合群集を研究することができます。この技術により、腸のコロニー形成およびコロニー形成の生物学的変異を測定するためのハイスループットスクリーニングアプローチが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

免疫応答と行動の間のリンクを理解するために、我々は中に運動行動を測定する方法を説明します...

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

&gt;ショウジョウバエの微生物叢は、動物の発育、免疫、生理機能に影響を与えます。このビデオでは、全身の準備からコロニー形成単位を決定することにより、ハエから細菌を定量する方法について説明しています。注目のプロトコールは、4つの細菌種を使用してgnotobiotic条件下で飼育されたハエを用いた技術を示しています。...

コロニー形成単位(CFU)の計数:ハエの体からの細菌の定量(英語)

出典:Dodge、R.、et al.ショウジョウバエマイクロバイオームに適用した96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニット計数J. Vis. 経験。(2023年)このビデオは、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエにおける腸内関連細菌のコロニー形成単位の定量化

大腸菌感染後のショウジョウバエ・メラノガスターにおける大腸菌の細菌負荷の測定

Drosophila melanogasterは、自然免疫系と感染や病気の生理学的影響を研究するための優れたモデル生物です。このプロトコルでは、堅牢で定量的に再現性のある細菌感染をD.

全身細菌感染や免疫防御表現型<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

無菌およびノトバイオート条件の下でショウジョウバエを飼育するための方法が提示されています。フライ胚は、次亜塩素酸ナトリウムでdechorionated無菌の食事に無菌的に移し、密閉容器で飼育されています。細菌にダイエットや胚を接種すると、ノトバイオート団体を招き、細菌の存在が全身ショウジョウバエホモジネートをめっきすることによって確認されました。...

フルーツフライを飼育<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;無菌およびノトバイオート条件の下で

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。...

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

マイクロプレートフィーダーアッセイは、 ショウジョウバエの液体食品消費を定量化するための経済的で高いスループットの方法を提供します。3Dプリントされたデバイスは、ハエが1536ウェルマイクロプレートに収容される96ウェルマイクロプレートを接続し、そこからハエがトレーサー染料で給餌溶液を消費します。溶液体積の減少は分光光度測定で測定される。...

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫...

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌...

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

細胞株は、宿主細胞の外部で培養できない細胞内生物の研究に有用です。 ボルバキアに感染した系統は多くの発見を可能にしてきましたが、これらの系統内の不均一性は、実験結果にばらつきをもたらす可能性があります。...

ボルバキア感染ショウジョウバエmelanogasterJW18細胞株からのモノクローナル培養物の生成

学ぶ、ショウジョウバエの腸内微生物叢を96ウェルプレートで高速にCFU計測する手法。自動画像解析ソフトウェアを用いて従来法より100倍速くコロニー形成単位を定量化できます。

ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

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