インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価
2022年9月28日
ここでは、インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製および評価のための詳細な方法を提示する。
新規ナノエマルジョンワクチンは、疾患戦術療法において大きな利点を有する。これらのセット効果は、独特の腫瘍チョピズム、特定の戦術の特定、および低い全身毒性などの特性によって最小限に抑えられます。このプロトコルは、新しいT細胞異型ペプチド粘膜ワクチンの将来の開発のための技術的および理論的な手がかりを提供すると期待しています。
1ミリグラムのモノホスホロールリピッドAを100マイクロリットルのDMSOと混合することから始めます。5分間ボルテックスし、室温で4時間溶解させます。TWEEN 80とI-OVAを定量的に添加します。
成分を混合し、スクアレンを加える。次に、調製した混合物に100マイクロリットルのMPLA溶液を加える。ナノエマルジョンワクチンを調製するには、混合溶液を全体積の約70%の水滴に加え、穏やかに攪拌して、透明で流動性のある混合物を得る。
インビトロアッセイでは、BEAS2B上皮細胞の復活から始めます。ウォーターバスをオンにして、温度を摂氏37度に調整します。凍結した細胞バイアルを水浴中で素早く解凍し、摂氏37度で焼き戻した。
解凍後、細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに素早くピペットで入れ、2ミリリットルの完全増殖培地を加えます。チューブを129 Gで5分間遠心分離します。スピネタントを除去し、細胞を2ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁する。
細胞をもう一度遠心分離した後、スピネタントを除去し、6ミリリットルの完全増殖培地を加えて細胞を再懸濁します。次に、細胞をT25培養フラスコに移し、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートします。細胞密度が80%から90%に達したら培養液を廃棄し、2ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。
1ミリリットルの0.25%トリプシンを加えて、細胞を1〜2分間消化します。細胞の丸みが観察されたら、直ちにトリプシンを中和するために4ミリリットルの完全増殖培地を加える。15ミリリットルの滅菌遠心チューブでサンプルを混合し、吸引します。
サンプルを129 Gで5分間遠心分離します。スピナタントを除去し、細胞を1ミリリットルのRPMI 1640完全培地に再懸濁します。細胞計数に20マイクロリットルの細胞懸濁液を使用し、細胞を1ミリリットルあたり10〜5分の1細胞に希釈します。
次いで、BEAS2B細胞を100マイクロリットルのRPMI 1640完全培地中の96ウェルプレート中の96ウェルプレート中のウェル当たり10倍10の密度でプレートし、プレートを24時間プレインキュベートする。インキュベーションの最後に、スピネタントを廃棄し、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのRPMI 1640を加える。対照としてBNEを用いて様々な最終濃度で完全な増殖培地で予め希釈したI-OVAナノエマルジョン、BNEと混合したI-OVAおよびI-OVAをそれぞれ100マイクロリットル加え、摂氏37度で24時間インキュベートする。
インキュベーションが完了したら、培地を取り除き、プレートを暗い場所に移します。90マイクロリットルの完全増殖培地と10マイクロリットルのCCK8溶液をプレートの各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で2時間インキュベートします。
酵素標識プレートリーダーを用いて450ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、I-OVA、I-OVA plus BNE、およびI-OVA NEでマウスの鼻免疫を3日間行います。実験対照としてBNEおよびPBAを使用する。
その後、鼻組織のサンプルをハサミで約3ミリメートルの厚さに切り取り、4%パラホルムアルデヒドに入れます。肺組織を取り除き、鼻と肺組織全体を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。TEMおよびAFMは、表面ゼータ電位およびナノワクチンの粒子サイズの基本特性の評価に使用される。
ムシン安定性分析におけるI-OVA NEの粒子径、多分散指数、ゼータ電位、および電気泳動移動度を示します。BEAS2B細胞の相対生存率は、異なるペプチド濃度のI-OVA、BNE+I-OVA、およびI-OVA NEに24時間曝露した培養物で80%以上です。I-OVA EN群には、明らかな粘膜毒性、組織損傷、出血、または炎症性細胞浸潤は見られませんでした。
上皮BEAS2B細胞は、その水溶液よりも多くのFITC標識I-OVA NEを捕捉した。I-OVA NEのインビトロでの徐放効果をIV-ISシステムを用いて解析した。I-OVA NEワクチンは、I-OVAの水溶液と比較して徐放効果を示した。
I-OVA NE群では、他の群に比べて生存率が高く、腫瘍体積が有意に小さかったことから、他の群よりも予防防御効果が高いことが示唆された。治療モデルでは、生存期間の中央値は異なる群間で有意に異なっていた。I-OVA NE群の腫瘍体積はI-OVA群よりも有意に小さかった。
この手順では、混合物を均一に攪拌することが重要です。そうしないと、ナノワクチンの効率が低下します。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本論文では、鼻腔投与用自己組織化ナノエマルション腫瘍ワクチンの調製およびin vitroとin vivoにおける評価の詳細な手法について提示します。この新規ワクチンは、疾患に対する治療戦略において大きな利点を示します。
研究の主要構成要素
科学分野
- ワクチン開発
- ナノエマルジョン技術
- 免疫療法
背景
- ナノエマルションワクチンは、独自の腫瘍向性を示します。
- これらは特定の治療戦略を明確にします。
- これらのワクチンは全身毒性が低いのが特徴です。
- 本プロトコルは、T細胞ペプチド粘膜ワクチンの開発を支援することを目的としています。
研究目的
- ワクチン調製に関する詳細なプロトコルを提供すること。
- ナノエマルションワクチンの有効性を評価すること。
- 疾患治療における潜在的な応用可能性を検討すること。
使用方法
- モノホスホリルリピドAをDMSOと混合する。
- 混合物を5分間ボルテックスする。
- 室温で4時間静置し、溶液を溶解させる。
- TWEEN 80およびI-OVAを定量的に添加する。
主な結果
- ナノエマルションワクチンは、有望な治療効果を示している。
- その独自の特性により、副作用が最小限に抑えられている。
- 粘膜ワクチンの今後の開発への可能性。
- 研究者向けに技術的および理論的な知見が提供されている。
結論
- 本研究では、ワクチン調製の実行可能な手法を提示します。
- ナノエマルション技術の利点を強調しています。
- 今後の研究において、これらの知見を治療法の改善に活用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
鼻腔投与用自己組織化ナノエマルション腫瘍ワクチンの開発は、がん治療パイプラインにおけるペプチドベースの免疫療法の課題である、低い免疫原性とデリバリー効率の改善を目的としています。標的とした粘膜投与と抗原の徐放を可能にすることで、このアプローチは、初期段階のワクチン候補選択における予測精度の向上と、トランスレーショナル研究におけるリスクの低減を支援します。本プロトコルは、物理化学的特性、毒性、および有効性の評価に焦点を当てており、T細胞エピトープワクチンの開発に再利用可能なプラットフォームとして活用できます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 腫瘍免疫療法に向けたT細胞エピトープペプチドの機能的バリデーションをサポートします。
- 適切な上皮モデルにおける抗原取り込みおよび免疫活性化を評価することで、メカニズム的なリスク低減を可能にします。
- 定量的な毒性と有効性のベンチマークを提供することにより、ポートフォリオの優先順位付けを促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- TEM、AFM、およびDLSを用いた、ナノエマルションの調製および特性評価のための標準化されたプロトコルを確立します。
- 候補物質の選定に必要となる、再現性のある細胞生存率および粘膜毒性データを提供します。
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けた、抗原の取り込みおよび放出プロファイルの定量的な評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- in vitroおよびin vivoの有効性データを疾患関連の腫瘍モデルと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 前臨床試験における生存率および腫瘍体積の結果に基づいた、リスク調整後の進展基準を提供します。
- バイオマーカーに基づく粘膜免疫応答の評価をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、初期の探索から前臨床検証までを統合したものであり、腫瘍学適応におけるペプチドワクチン候補の反復的な最適化を可能にします。
- 創薬生物学： 定量的な毒性および取り込みアッセイにより、生物学的メカニズムを解明し、候補物質選択のリスクを低減します。
- スクリーニング： 標準化されたナノエマルションの調製および特性評価により、アッセイの再現性とスケーラビリティを確保します。
- 分析学： 粒子径、ゼータ電位、および放出キネティクスの強固な測定を提供し、製剤間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見を、腫瘍担持モデルにおけるin vivoでの有効性と結びつけ、前臨床段階での意思決定に活用します。
- 企業での再利用： 本プロトコルは、他のペプチド抗原や粘膜ワクチンプラットフォームに適応させることが可能です。
運用および組織への影響
- 科学的価値： 粘膜ワクチンの有効性と安全性における予測信頼性を向上させます。
- 運用上の価値： ナノエマルションワクチンの開発に向けた、標準化され拡張可能なワークフローを可能にします。
- 戦略的価値： 免疫療法パイプラインにおけるgo/no-go決定を改善し、後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： 橋渡し研究に向けたワクチン候補の、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- ナノエマルションの製剤化および高度な顕微鏡技術に関する専門知識が必要です。
- TEM、AFM、DLS、およびin vivoイメージングのための分析インフラへのアクセスが必要です。
- 再現性のある毒性および有効性試験を行うため、チーム間での標準化が求められます。
- 異なるペプチド抗原や腫瘍モデルに適応させる場合、プロトコルの最適化が必要になることがあります。
- 実用上の制限として、ナノエマルションの効率と再現性を確保するために慎重な混合を行う必要があります。
