Name: 接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ CRISPR-EZ法によるマウス接合子の電気穿孔を用いた効率的なゲノム編集技術。ほぼ100%の効率で遺伝子改変マウスを作製し、発生初期の遺伝子制御研究や疾患モデル構築に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A.J.M.は、CRISPR-EZの開発につながる独自のコンセプトを作成し、フィギュアを作成しました。C.K.D.は、この現在の原稿のために内部および公開されたプロトコルを編集および適応させました。A.J.M. は NIH (R00HD096108) によってサポートされています。

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).</li>
<li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li>
<li>Tröder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
<li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069(2020).</li>
<li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+%28still+not%29+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811(2019).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
<li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GONAD%3A+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system%3A+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406(2015).</li>
<li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081(2017).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87(2015).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47(2009).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

著者による関連する財務申告はありません。

ここでは、簡単で高効率なマウスゲノム編集技術を紹介します。エレクトロポレーションは、1〜2週間で改変胚を生成するために使用でき(図1)、6週間以内に編集されたマウスを作製することができる9。RNP 7、10、11、12、13、14、15、17、32を送達する同時期に開発されたエレクトロポレーションベースのプロトコルと比較して、ここで説明する方法は概念的に類似しており、試薬の開発とパラメータにわずかな...

生きたマウスでのゲノム編集は、CRISPR編集の出現以来、かなり簡素化され、アクセスしやすく、より手頃な価格になりました1,2,3。最初の動物編集の試みでは、マイクロインジェクションを使用してCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAを核期胚に送達しました4,5,6。マイクロインジェクションは非常に効果的ですが、それを完全に習得するために必要な練習の量は、研修生や学生には適切ではない可能性があり、適度な資金のあるラボでは購入できない高価な機器も必要です。マイクロインジェクションは通常、トランスジェニック施設の専門技術者によって行われ、多くの研究者にとってレート制限のあるスケジュールとサービス価格があります。よりアクセスしやすいアプローチはエレクトロポレーションのアプローチであり、これはCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAの前核段階の胚への送達に非常に効果的であることが実証されています7。CRISPRゲノム編集および送達戦略のさらなる改善は、すでにsgRNAと結合している事前に組み立てられたRNPがモザイク現象を低減する効果的な手段である可能性があることを示唆しました8。
このプロトコルの開発と使用の背後にある理論的根拠は、マイクロインジェクションに関連する制限と障害の多くを回避することでした。名前が示すように、マイクロインジェクション実験中にテストされていないsgRNAデザインを使用する価値があるかどうかを迅速に判断できる、簡単で社内の費用対効果の高い方法は、非常に便利なファーストパス品質管理ステップです(図1)。この方法は、組換えベースの結果のために長いドナーDNA配列を導入するなど、より複雑な戦略ではマイクロインジェクションに取って代わることはできませんが、小さな欠失や挿入、遺伝子のタグ付けなどのそれほど複雑でない戦略には理想的です。この方法は、基本的な胚操作スキルを持つ研究者で、単純な編集ニーズを持っている、着床前の開発の時間枠内で仮説をテストしたい、またはマイクロインジェクションの専門家との予約をスケジュールする前に胚でsgRNAをテストしたい研究者に適しています。ここでは、編集試薬は、エレクトロポレーション(一連の電気パルス )を介して Cas9 / sgRNPとして核段階の胚に一過性に送達され、モザイク現象を減らしながら効率を最大化します8。胚ジェノタイピング法を使用すると、編集結果は約1週間9で利用可能になるため、大幅に削減されたコストでさまざまなマイクロインジェクションアプリケーションの必要性が減少します。
この方法の有効性は、胚がまだ母方と父方の前核を融合していない、またはS期に入っていない前核胚段階でピークに達します(図2)。過排卵は接合子の数を最大化するために使用されますが、前核接合子と未受精卵の両方を生成します。健康な接合子は、エレクトロポレーションの前に事前に選択して、全体的な効率を高めることもできます。他のエレクトロポレーションプロトコルは、同様のステップ7、10、11、12、13、14、15を含む必要なしに接合子を効率的に編集しているので、このプロトコルのオプションのステップは、透明帯(ZP)のわずかな侵食である。ZPは、精子の結合、先体反応、および前核段階の胚を取り巻く受精を助ける糖タンパク質層です。私たちの経験では、ZPの穏やかな酸ベースの侵食は、生存率にわずかな影響しか及ぼさずに、信頼性の高いCas9 RNPエレクトロポレーション送達を提供することがわかりました。
C57BL/6JやC57BL/6N 9,16などの研究で一般的に使用されているマウス系統において、エレクトロポレーションによる最大100%の効率のRNP送達率が観察されています。独立したグループはまた、マイクロインジェクション11、12、13、14、15、17よりも高い、またはそれと一致する効率のエレクトロポレーションベースの手順を開発し、エレクトロポレーションプロトコルはラット18、19、ブタ20、21、22、およびウシ23で良好に機能しています。したがって、読者はプロトコルを比較して、実験および機器のニーズに最適な条件を見つけることをお勧めします。ここで説明するシステムは、一般的な材料と機器を使用しており、基本的な胚操作スキルのみを必要とします。この手法は、さまざまな編集戦略に効果的であり、研究コミュニティがこの方法を広く利用できるようにします。
理想的な低分子ガイドRNA(sgRNA)を設計することは、効率的な編集に不可欠です。特にマウス系統の作製が必要な場合は、マウス胚の標的部位ごとに2〜3個のsgRNA戦略を直接スクリーニングすることをお勧めします。設計後は、高品質のsgRNAを作製するためのin vitro転写(IVT)などのクローニングフリーの方法が推奨されます3。RNPおよびsgRNAは、30〜50個の処理された前核期胚と混合され、一連の電気パルスにさらされて最初にZPおよび細胞膜を一時的に透過し、その後のパルスで孔を開いたままにし、接合子24を通してRNPを電気泳動します。最適化の結果、バルク胚(~50)に対して30 Vで6つの3 msパルスが編集効果と生存率に最適であり、非常に効率的なCas9/sgRNA RNP送達を提供することがわかりました9,16,25。個々のマウス桑実胚における編集イベントは、制限断片長多型(RFLP)、T7エンドヌクレアーゼ消化、および関心領域のサンガーシーケンシングなど、CRISPR編集に一般的なさまざまな検証戦略を使用して確認できます26。
現在の方法は、挿入/欠失(インデル)、500〜2000 bp程度のエクソンサイズの欠失、およびC末端またはN末端タグ(FLAG、HA、V5など)などの点突然変異や小さな挿入の送達などの単純な編集スキーム(図3)に最も適しています9,16,27。蛍光タグや条件付き対立遺伝子の大規模な挿入のような複雑なゲノム編集の可能性は依然として不確実であり、今後の改善の現在の焦点です。
この方法は容易に習得でき、培養マウス胚のsgRNAを1週間で迅速に試験するために使用できます9(図1)。この研究で提示されているのは、1)sgRNAデザインを含む6段階のプロトコルです。2)sgRNA合成;3)過剰排卵および交尾;4)胚の培養、収集、および処理。5)RNPアセンブリとエレクトロポレーション。6)胚培養とジェノタイピング。使用されているすべての材料に関する情報が提供されています(材料表)。陽性対照として、チロシナーゼ(Tyr)遺伝子座9,16を編集する試薬が付表1に含まれている。

<table><tbody><tr><td>0.1cmギャップエレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td>カタログ番号 1652089</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>26-G, 1/2インチ ニードル</td><td>BD</td><td>カタログ番号 305111</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>3&ndash;生後8ヶ月齢の雄マウスと生後3〜5週齢の雌マウス</td><td>JAX</td><td>カタログ番号</td><td>000664 超排卵</td></tr><tr><td>35mm 組織培養皿</td><td>Greiner Bio-One、</td><td>カタログ番号 627-160</td><td>胚培養</td></tr><tr><td>60mm 組織培養皿</td><td>Greiner Bio-One、</td><td>カタログ番号 628-160</td><td>胚処理</td></tr><tr><td>6x ローディング色素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カタログ番号 R0611</td><td>sgRNA合成とジェノタイピング</td></tr><tr><td>酸性チロード(AT)溶液、胚培養グレード</td><td>Sigma-Aldrich、</td><td>カタログ番号 T1788</td><td>胚処理</td></tr><tr><td>BSA、胚培養グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 A3311</td><td>胚処理および培養</td></tr><tr><td>Cas9 タンパク質</td><td>Alt-R S.p. Cas9 ヌクレアーゼ 3NLS</td><td>カタログ番号 1074181</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>DNase I、RNase-free</td><td>New England BioLabs、</td><td>カタログ番号 M0303</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>DPBS(カルシウムおよびマグネシウムフリー)</td><td>Gibco</td><td>カタログ番号 14190-144</td><td>胚処理</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>カタログ番号 R3101S</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>EDTA、無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号EDS-100G</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>カタログ番号 V1016</td><td>sgRNA 合成</td></tr><tr><td>ゼラチン(粉末)B型、ラボグレード</td><td>Fisher、</td><td>カタログ番号 G7-500</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>グリセロール、&nbsp;分子生物学グレード</td><td>フィッシャー</td><td>カタログ番号BP229</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Promega</td><td>カタログ番号 M712</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>HEPES, cell culture grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 H4034</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>HinfI (10,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>カタログ番号 R0155S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs,</td><td>カタログ番号 E2040</td><td>sgRNA 合成</td></tr><tr><td>ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、凍結乾燥&nbsp;(hCGの)</td><td>ミリポア</td><td>カタログ番号 230734</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ/M2</td><td>ミリポア</td><td>カタログ番号MR-051-F</td><td>胚処理</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve 培地 (カリウム添加シンプレックス最適化培地とアミノ酸)</td><td>ゼニスバイオテック</td><td>カタログ番号ZEKS-050</td><td>胚培養</td></tr><tr><td>LEアガロース、分析グレード</td><td>BioExpress</td><td>カタログ番号 E-3120-500</td><td>sgRNA 合成およびジェノタイピング</td></tr><tr><td>M2 培地</td><td>Zenith Biotech</td><td>カタログ番号ZFM2-050</td><td>胚処理</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、無水 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 M8266</td><td>RNP and Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Millipore</td><td>カタログ番号ES-005C</td><td>胚培養</td></tr><tr><td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 74385</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td><td>Ambion</td><td>カタログ番号AM9937</td><td>sgRNA 合成およびジェノタイピング</td></tr><tr><td>sgRNA 合成用オリゴ、ジェノタイピング用ドナーオリゴおよび PCR プライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタムオーダー</td><td>sgRNA デザイン</td></tr><tr><td>還元血清培地</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>カタログ番号 31985062</td><td>胚培養</td></tr><tr><td>ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ</td><td>New England BioLabs,</td><td>カタログ番号 M0530</td><td>sgRNA 合成</td></tr><tr><td>塩化カリウム分子生物学グレード (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 P9333</td><td>RNP and Lysis Buffer</td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬血清 ゴナドトロピン凍結乾燥 ((PMSG)</td><td>ProspecBio</td><td>カタログ番号HOR-272</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK、分子生物学グレード</td><td>フィッシャー</td><td>カタログ番号BP1700-100</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>cat. no. 20170-333</td><td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td></tr><tr><td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td><td>VWR</td><td>cat. no. 82006-606</td><td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td></tr><tr><td>磁気精製ビーズ</td><td>GE Healthcare</td><td>cat. no. 65152105050250</td><td>sgRNA Synthesis</td></tr><tr><td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine塩酸塩 (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 C4706</td><td>RNP バッファー</td></tr><tr><td>Tris-HCl 溶液、pH 8.5 分子生物学グレード</td><td>テクノバ</td><td>カタログ番号 T1085</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>Tween 20 分子生物学グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ番号 P7949-500</td><td>溶解バッファー</td></tr></tbody></table>

接合子のcrisprエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

卓越した効率、精度、および容易さを備えたCRISPR/Cas9システムは、細胞培養および実験動物実験におけるゲノム編集を大幅に改善しました。動物モデルを生成する場合、接合子のエレクトロポレーションは、マイクロインジェクションのゴールドスタンダード法の代替として、より高い効率、シンプルさ、コスト、およびスループットを提供します。エレクトロポレーションはまた、より穏やかで生存率が高く、Cas9 /シングルガイドRNA(sgRNA)リボ核タンパク質(RNP)を一般的な実験用マウス系統(C57BL / 6JおよびC57BL / 6Nなど)の接合子に確実に送達し、100%の送達効率に近づきます。この手法により、挿入/欠失(インデル)変異、点突然変異、遺伝子またはエクソン全体の欠失、およびLoxPまたはFLAG、HA、V5などの短いタグを挿入するための100〜200 bpの範囲の小さな挿入が可能になります。ここでは、絶えず改善されていますが、in vitro 転写、胚処理、RNPアセンブリ、エレクトロポレーション、着床前胚のジェノタイピングによるsgRNA産生を含むプロトコルでCRISPR-EZの現状を示します。胚の操作経験が最小限の大学院レベルの研究者は、このプロトコルを使用して1週間未満で遺伝子編集された胚を取得できます。ここでは、マウス胚に使用できる、簡単で低コスト、効率的、大容量の方法を提供します。

この方法では、効率的なCas9/sgRNPアセンブリのために、100 μgを超えるsgRNA(&gt;6,000 ng/L濃度で20 μL)が生成されます。ここで説明するルーチンの過剰排卵法は、通常、プラグされた女性あたり10〜20個の生存可能な胚を生成します。胚操作に関連する取り扱いエラーと典型的な損失により、予想される胚の80%は受精し、生存可能で、エレクトロポレーション後に優れた状態にあります。研究者が実験を成功させるのを支援するために、オリゴデザイン(図6A、補足表1)やNHEJイベントとHDRイベントの両方のジェノタイピング戦略(図6B)(ステップ6.2)を含む、マウスTyr遺伝子座をポジティブコントロールとして標的とする戦略の例を提供しました(図6)。実験の成功と結果の詳細な例が利用可能です9,16<sup class="xre...

ここでは、CRISPR RNP接合子のエレクトロポレーション(CRISPR-EZ)と呼ばれる遺伝子改変マウスの効率的な生成を目的とした簡単な手法について説明します。この方法は、編集試薬をエレクトロポレーションにより胚に100%に近い効率で送達する。このプロトコルは、哺乳類胚における点突然変異、小さなゲノム挿入、および欠失に効果的です。

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

この方法は、胚のガイドRNAをチェックしたり、初期の発生の質問をテストしたり、編集されたマウスを作成したりすることができます。CRISPR Cas9の進歩は、この方法で使用できます。この方法の主な利点は、習得が容易であり、マウスにアクセスできるラボで利用可能な試薬を使用することです。将来的には、この技術は、コンパニオンアニマルまたは農業上重要な動物の子孫の病気または突然変異を修正するのに役立つでしょう。この方法は、マウス モデルの生成に最適です。私たちの研究室では、この方法のバリエーションを使用して、受精と着床前早期発生を取り巻くイベント、特に胚の効力における遺伝子制御を調査しています。最も困難な部分は、ガラス針を使用して胚をプレートからプレートに移動することです。この手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストであるシャンタル・ディアロです。胚の収集と処理を開始するには、安楽死させた雌マウスを背中に置き、腹部に70%エタノールをスプレーして外科的に開きます。腹腔を開いて卵管を除去するには、外科用ハサミで皮膚層を切断し、卵巣を見つけます。次に、卵巣の近位に位置する両方の卵管を外科的に除去し、それらをM2とBSA培地の個々の50マイクロリットルの液滴に入れます。実体顕微鏡下で、解剖鉗子を使用して卵管の膨大部に傷を付け、卵母細胞を含む積雲-卵母細胞複合体(COC)を放出し、破片のキャリーオーバーを避けるために、各卵母細胞を移し、20〜30マイクロリットルに設定されたハンドルピペットでM2とBSAの単一の50マイクロリットルの液滴に混ぜ合わせます。次に、接合子から卵雲細胞を除去するには、少量の余分な培地を含むCOCを100マイクロリットルのM2とヒアルロニダーゼの液滴に移し、胚がはるかに小さな卵雲細胞から目に見えて分離されるまでピペッティングで穏やかに混合します。ヒアルロニダーゼを希釈し、緩んだ積雲細胞を取り除くには、口内ピペットを使用して接合子を新しい50マイクロリットルのM2プラスBSA液滴に移動します。次に、胚の透明帯を侵食し、試薬送達のための追加の物理的障害を減らすために、胚を60ミリメートルプレート上の酸チロードまたはAT溶液の予熱した100マイクロリットルの液滴に移します。透明帯の30%が侵食されるまで実体顕微鏡下で接合子を連続的に観察し、次にATを希釈するために、M2とBSAの4つの50マイクロリットルの液滴に胚を通過させます。次に、実体顕微鏡でカウントすることにより、処理された胚の適切な数を決定します。胚を50マイクロリットルの還元血清培地の2滴に通すことによってBSAを希釈する。次に、マウスピペット25〜30個の胚を10マイクロリットルの還元血清培地の液滴に入れ、次にハンドヘルドピペットを使用して10マイクロリットルのリボ核タンパク質または

efficient-genome-editing-of-mice-by-crispr-electroporation-of-zygotes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。...

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

ノックアウト動物を用いた遺伝子の機能喪失従来は、高価で時間のかかる多くの場合されています。CRISPR 媒介体細胞突然変異誘発のエレクトロポレーション ベースは遺伝子の生体内の機能を理解するための強力なツールです。小脳の細胞増殖にノックアウトの表現型を解析する手法を報告する.

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

ここでは、1細胞胚の凍結保存のための改変方法と、遺伝子組換えマウスの効率的な生成のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせたプロトコルを提示する。...

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

本プロトコルは、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを効率的に作製するためのCRISPR-Cas9およびドナーDNAの接合子マイクロインジェクションを記載する。...

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

ここでは、胚性幹細胞を用いた遺伝子改変マウスモデル、特に大型DNAノックイン(KI)の開発のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して調整されているため、従来の相同組換えを介した直鎖状DNAターゲティング法と比較して、KI効率が大幅に向上します。...

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

このプロトコルでは、マウス卵管における局所的に制限されたCRISPRを介したゲノム編集のためのマイクロインジェクションと in vivo...

in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。...

アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集

卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) 法の効率は、ドナーの女性から接合子を採取し、偽妊娠中の女性に移植する必要がある従来のマイクロインジェクションに匹敵します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9 誘発変異を染色体 6 上の ROSA26...

ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

RNAとしてゲノム編集者を送達することは、一次哺乳類の細胞や細胞株のゲノム改変において特に強力な手段です。このプロトコルの目的は、ゲノム編集者をmRNAとして一次哺乳類の細胞および細胞株に届け、その後、Illuminaの標的シーケンスと解析を行って編集結果を定量化することです。...

一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

学ぶ CRISPR-EZ法によるマウス接合子の電気穿孔を用いた効率的なゲノム編集技術。ほぼ100%の効率で遺伝子改変マウスを作製し、発生初期の遺伝子制御研究や疾患モデル構築に応用可能です。

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

さらに動画を探す