Name: マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶマウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術。超音波ガイド下で針を正確に配置し、加齢や免疫不全マウスの萎縮した胸腺への注射が可能です。手術によるストレスを最小限に抑え、大規模実験を実現します。

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レイモンドH.ソーントンがこのテクニックに関する洞察に満ちた包括的な初期の研究をしてくれたことに感謝します。この研究は、国立がん研究所(NCI 1R37CA250661-01A1)、小児白血病研究協会、ハッケンサックメリディアン医学部、およびHUMC財団/タックルキッズがんからの助成金によって資金提供されました。

すべての手順は、発見とイノベーションセンターの動物飼育ガイドライン(IACUCプロトコル290)に従って実行されました。本研究では、C57BL/6マウス(雌、4-6週齢)、C57BL/6マウス(雌、6ヶ月齢)、J:NU雌マウス、NODシドガンマ(NSG)雌マウス、およびB6;CAG-luc、-GFPマウスを、それぞれ若齢マウスモデル、高齢マウスモデル、胸腺ヌードモデル、免疫不全モデル、および生物発光細胞源として用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。この手順では、通常、2人が必要です(1人は注射中に無菌状態を維持し、もう1人はマウスを取り扱うため)。
1.動物の準備
<ol><li>3%〜4%のイソフルランガスを使用してマウスに麻酔を誘発し、ノーズコーンと精密に校正された気化器を介して投与された1%〜3%のイソフルランガスを使用して麻酔を維持します(材料の表を参照)。</li>
	<li>後足のつまみに対する無反応により、適切な麻酔深度/無意識を確認します。</li>
	<li>脱毛クリームの薄層を1分未満塗布することにより、マウスの前胸部から毛皮を取り除きます。濡れたペーパータオルを使用して、ゆるい毛皮と一緒にクリームを完全に取り除きます。 注意: クリームを塗りすぎると、胸部の皮膚が炎症を起こします。</li>
	<li>ノーズコーンを所定の位置に置いた状態で、小動物超音波画像ステーション( 材料の表を参照)の加熱されたプラットフォームに一度に1匹ずつマウスを仰臥位で置きます(図1)。</li>
	<li>マウスを後肢と前肢の医療用粘着テープでステージに固定します(図1)。</li>
	<li>眼科用軟膏を両目に塗り、角膜の乾燥を防ぎます。</li>
	<li>クロルヘキシジングルコン酸アプリケーターを使用して、毛皮のない胸部上部皮膚を消毒します( 材料の表を参照)。</li>
</ol>2.超音波装置と無菌フィールドの準備
<ol><li>利用可能な最高周波数リニアプローブ、通常は画像化される動物のサイズに対して最高の空間分解能を持つプローブをアクティブにします。起動画面の後に対応するボタンをタップして、プローブをアクティブにします。 注:マウスを使用したこのアプリケーションでは、使用されるプローブはマウスおよび小型ラットで使用するために特別に設計されています(材料の表を参照)。</li>
	<li>以下の手順に従って、イメージングと注射の超音波設定を最適化します。<ol><li>画面右側の垂直方向のスライダーを調整し、視野の深さを対象動物に適したサイズに調整します(図2)。最大深度設定は、通常、若いマウスの場合、約6〜8 mmになります。</li>
		<li>画面下部の水平バーに沿ってボタンをスライドさせて、グレースケールゲインを調整します(図2)。目標は、通常の「灰色」の外観よりもわずかに暗い画像から始めることです。</li>
		<li>焦点ゾーン(画面の右側の青い矢印、 図2)を胸腺の予想されるレベルに調整します。若いマウスの場合、これは約4 mmの深さになります。</li>
		<li>イメージ キャプチャが必要な場合は、[ イメージの保存 ] ボタンと [ クリップの保存 ] ボタンの機能をテストして、手順全体でイメージを適切に保存できることを確認します。画面の右下にある [クリップの保存 ]ボタンをタップするか、[ フリーズ ]ボタンをタップしてから[ 画像を保存 ]をタップして、これを実行します(図2)。</li>
	</ol></li>
	<li>少量(~1 mL)の超音波ゲルをトランスデューサーの表面( 材料の表を参照)に、超音波装置ホルダーまたは助手の手に置いた状態で直立させて塗布します。</li>
	<li>加熱されたプラットフォームの隣に小さな滅菌フィールドを準備します。これに最適な位置決めは、通常、プラットフォームと超音波装置の間です。<ol><li>これらのアイテムを滅菌フィールドに空にします:滅菌プローブカバー、輪ゴム、滅菌手袋、および滅菌超音波ゲル( 材料の表を参照)。</li>
		<li>滅菌フィールドをセットアップし、アイテムを配置したら、滅菌手袋を着用します。</li>
		<li>滅菌プローブカバーを超音波トランスデューサーの上(および最初にプローブに配置したゲルの上)に慎重に配置します。無菌性を維持し、滅菌カバーにのみ触れてください。滅菌輪ゴムを滅菌プローブカバーの上にスライドさせて、所定の位置に保ちます。 注意: 空気の焦点は、サイズに関係なく、超音波イメージングを妨げる可能性があります。したがって、超音波プローブと動物の間に空気のないインターフェースを確保するために、トランスデューサーと滅菌プローブカバーの間、およびプローブカバーの上に超音波ゲルを適用することが不可欠です。</li>
		<li>適量(2〜3 mL)の滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに置きます。 注意: これで、麻酔をかけたマウスを画像化する準備が整いました。</li>
	</ol></li>
</ol>3.胸腺のイメージングと位置特定
<ol><li>無菌性を維持しながら、初期イメージングのために、超音波ゲルトッププローブをマウスの前胸壁の消毒部分に垂直に置きます。<ol><li>超音波画像を見て、さらに最適化してください。手順 2.2 に戻り、 図 3 のような外観になるように調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>横面でマウスの前胸部をスキャンします。これを実行するには、トランスデューサーを垂直に持ち、絵筆のような、または「スイープ」の動きで首から腹部まで上下に動かします。 注:心臓は、その急速な動きと「チャンバー化された」外観により、胸部で最も有名な構造になります。心臓が局在化されると、これを胸腺の画像を取得するための基準点として使用できます。</li>
	<li>心臓を視野の中央に向け、トランスデューサーを首に向かって少しスイープします。心臓よりもちょうど上に、胸腺は通常遭遇します。</li>
	<li>胸腺を、正中線の中央、大動脈の前方、胸骨の後方にある二葉、ピラミッド型、低エコー(画面に表示される「暗い」または「黒」)の構造として視覚化します(図3A)。</li>
	<li>胸の上部の両側にある2つの丸いペアの黒い(つまり、「低エコー」)構造に注意してください。 注:これらは両側大静脈です。大動脈は、2つの大静脈の間の正中線における同様の曲線低エコー構造である。これらは、脈動の動きによって簡単に認識できます。</li>
</ol>4.胸腺の注射
<ol><li>必要に応じて、さらに(2〜3 mL)滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに塗布します。 注:トランスデューサー上の比較的大量の滅菌ゲル(マウスの胸部のサイズと比較して)は、マウスの胸壁の周りの「ゲルパッド」として機能します。これにより、視野内の空気によって行われる超音波アーチファクトの数が減少します。</li>
	<li>超音波プローブを使用して、通常は注射の理想的な標的部位である胸腺の最も広い部分を見つけます。選択した場所で水平方向の針の軌道を予測します。<ol><li>主要な血管(SVCと大動脈)がこの部位のどこにあるかに注意してください。注射中はこれらを避けてください。</li>
		<li>血管は、ステップ3.7で説明されているように、低エコーの拍動構造になります。不明な場合は、カラードップラーモードを使用して容器内の流れを確認します(図4A)。画面上の カラー ボタンをタップして、カラードップラーモードをアクティブにします。</li>
		<li>主要な血管の1つ(または心臓)が予想される針の軌道に沿っていると予想される場合は、新しいターゲット領域を選択するか、別のアプローチ/軌道を見つけます。</li>
	</ol></li>
	<li>片手にトランスデューサーを持ち、もう片方の手に30 Gのインスリン針( 材料の表を参照)を持ち、もう片方の手に10 μLの注射液を入れます。 注:注入液は実験デザインによって異なります。本研究では、リン酸緩衝生理食塩水、トリパンブルー、またはD-ルシフェリン(0.1μg/10μL)を使用しました。</li>
	<li>注入プロセスを開始するには、胸腺が超音波視野の中心から外れるようにトランスデューサーを横方向に動かします。視野の反対側が主に超音波ゲルで構成され、他には何も含まれていないことを確認してください。</li>
	<li>針の先端をトランスデューサーの下のゲルに入れ、皮膚表面に隣接して視覚化されるまで針をゆっくりと動かします(図4B)。</li>
	<li>超音波下で針を連続的にイメージングしながら、血管から離れた経皮軌道で胸腺に針を挿入します。<ol><li>「クロス胸腺」水平軌道を使用して、針先を入口部位の反対側の胸腺葉に配置します。これは、針管に沿った潜在的な漏れを説明しています(図5A)。</li>
	</ol></li>
	<li>針先が胸腺の目的の部分に入ったら、超音波視覚化を使用しながら、30 Gシリンジから内容物(10 μLのトリパンブルーまたはD-ルシフェリン、0.1 μg / 10 μLなど)をすばやく注入します。<ol><li>針の挿入および注入中にシリンジを安定させるには、シリンジを親指と人差し指の間に保持し、人差し指でシリンジプランジャーを制御します。</li>
	</ol></li>
	<li>すべての内容物が堆積した後、針を取り外します。</li>
</ol>5.動物の注射後のモニタリング
<ol><li>動物を空のケージに移し、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで観察します。 注:麻酔からの完全な回復は2分以内に起こると予想されます。</li>
	<li>動物をさらに10分間監視して、苦痛、呼吸困難、または出血の兆候がないか確認します。 注:注射後の痛みは予想されず、通常、注射後の痛みは必要ありません。</li>
	<li>完全に回復し、注射後の観察期間が平穏になったら、注射した動物を他の動物の会社に戻します。</li>
</ol>

<ol><li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li>
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<li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109(2017).</li>
<li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Surgeon%22%5BJournal%5D)">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li>
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<li>Küker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191(2018).</li>
<li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4%3ACD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li>
</ol>

著者は、開示する利益相反はありません。

超音波ガイドフリーハンド注射は、効率的かつ無菌的な方法で胸腺に研究材料を送達するための非常に正確な技術です。注射部位での皮膚の最初の滅菌に続いて、滅菌手袋、滅菌超音波プローブカバー、および滅菌超音波ゲルの使用により、処置中に無菌性が維持されます。マウスの胸腺内注射に一般的に使用される方法である胸腺18,19の直接視覚化のための外科的切開に頼る盲検経皮的アプローチ10,17とは対照的に、フリーハンド超音波ガイダンスを利用することは、高度な安全性と迅速性を驚異的な精度と組み合わせています手順の。レールプラットフォーム14を使用して超音波ガイド下注射を実施することは、同様のレベルの安全性および精度を提供するが、この厄介なアプローチは、専門家がマウス当たり約20〜30秒で注射を完了することを可能にするフリーハンド技術と比較して、マウスが麻酔され、画像プラットフォーム...

胸腺は、T細胞の発生と免疫に不可欠な役割を果たしています。胸腺退縮、遺伝性疾患、感染症、癌治療などの要因によって引き起こされる可能性のあるT細胞欠乏症は、高い死亡率と罹患率につながります1,2。マウスモデルは、基礎免疫学研究とトランスレーショナル免疫学研究の両方に不可欠であり、胸腺生物学とT細胞発生の研究、ならびに胸腺機能障害とT細胞欠乏症に苦しむ人々の治療法の開発に何十年にもわたって使用されてきました3,4,5。
胸腺研究の中心的な部分は、マウスモデル6、7、8、9、10、11、12における細胞、遺伝子、またはタンパク質などの生物学的物質の胸腺内注射でした。従来の胸腺内注射法は、開胸術とそれに続く直接可視化下での胸腺内注射、または縦隔への「盲検」経皮注射を使用する。外科的アプローチは、とりわけ気胸のリスクを大幅に増加させます。さらに、この手術中のストレスの上昇は免疫抑制をもたらし、したがって免疫学的データを損なう可能性があります13。経験豊富な研究者は、ある程度の練習の後、ブラインド注射技術を実行できますが、このアプローチは精度が低いため、実験対象を胸腺の大きな若いマウスに限定します。
超音波ガイダンスの利用は、従来の胸腺内注射アプローチに代わる正確で低侵襲の代替手段として導入されています14。ただし、この手順は、フリーハンド技術の代わりに統合レールシステムを使用する場合に非常に時間がかかります。インジェクションマウントを使用して注入を行うには、トランスデューサのスタンドとマウント、X、Y、Zポジショニングシステムなどのさまざまなアタッチメントを使用したトランスデューサの慎重なイメージングの最適化と位置決め、およびマイクロマニピュレーションコントロールとレールシステムエクステンションの熟練した操作が必要です。簡単な代替技術である超音波ガイド下胸腺注射が、上記の方法に対する迅速かつ正確な低侵襲代替手段であるフリーハンドアプローチ15を使用して放射線科医によって実行されることをここに提示する。重要なことに、現在のアプローチは、注入マウントと統合されたレールシステムを必要とせずに、高解像度の超音波イメージングシステムで実行できます。これは、多数のマウス11の注射を必要とする研究、両方の胸腺葉の注射を含む実験、または老化、照射、または免疫不全マウス12における小さな胸腺の正確な注射に特に有用である。

<table><tbody><tr><td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td><td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td><td>01-01</td><td>滅菌超音波透過ゲル</td></tr><tr><td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>025854</td><td>生物発光細胞源</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringes with needle</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>328431</td><td>超細針 - 12.7 mm, 30 G</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス - 老化</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>000664</td><td>生後6ヶ月; 老化モデル</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス - 若い</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>生</td><td>後4-6週000664;ヤングモデル</td></tr><tr><td>クロラプレップ ワンステップ 0.67 mL</td><td>CareFusion (米国テキサス州エルパソ)</td><td>260449</td><td>グルコン酸クロルヘキシジンアプリケーター</td></tr><tr><td>Curity Cotton Tippped Applicator</td><td>Cardinal Health (米国オハイオ州ダブリン)</td><td>A5000-2</td><td>滅菌済み、6インチ</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>ゴールドバイオテクノロジー (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5</td><td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td><td>該当なし</td><td>In vivo 生物発光イメージングシステム</td></tr><tr><td>J:NU mouse</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>007850</td><td>Athymic nude model</td></tr><tr><td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td><td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td><td>1914C</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech外科用ニトリル手袋</td><td>Kimberly-Clark Professional (米国テキサス州アーヴィング)</td><td>56892</td><td>滅菌手袋</td></tr><tr><td>Nair Hair Remover Lotion</td><td>Church and Dwight (米国ニュージャージー州トレントン)</td><td>該当しない</td>脱<td>毛剤</td></tr><tr><td>NOD scid γ (NSG) マウス</td><td>ジャクソン研究所 (米国メイン州バーハーバー)</td><td>005557</td><td>免疫不全モデル</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1x</td><td>Corning (米国ニューヨーク州コーニング)</td><td>21-040-</td><td></td>CV</tr><tr><td>Puralube Vet 軟膏</td><td>Med Vet International</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td>眼軟膏</td></tr><tr><td>シース</td><td>シース シース テクノロジーズ (米国カリフォルニア州モーガンヒル)</td><td>10040</td><td>滅菌超音波プローブ カバー</td></tr><tr><td>Sure-Seal 誘導チャンバー</td><td>Braintree Scientific (米国マサチューセッツ州ブレインツリー)</td><td>EZ-17 85</td><td>麻酔誘導チャンバー</td></tr><tr><td>トランスデューサー MX550D</td><td>FUJIFILM VisualSonics (カナダ、オンタリオ州トロント)</td><td>該当なし</td><td>Vevo 3100 イメージングプローブ (25-55 MHz、センター送信: 40 MHz)</td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4% 溶液 PBS</td><td>MP Biomedicals (米国オハイオ州ソロン)</td><td>91691049</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 3100 イメージングシステム</td><td>FUJIFILM VisualSonics (カナダ、オンタリオ州トロント)</td>該当<td>なし</td><td>超音波イメージングシステム</td></tr><tr><td>Vevo 3100 ラボソフトウェア</td><td>FUJIFILM VisualSonics (カナダ、オンタリオ州トロント)</td><td>該当なし</td><td>画像診断・分析用バージョン3.2.7</td></tr><tr><td>Vevoコンパクトデュアル麻酔システム</td><td>FUJIFILM VisualSonics(カナダ、オンタリオ州トロント)</td><td>n/a</td><td>卓上型イソフルランベースの麻酔ユニット</td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station</td><td>FUJIFILM VisualSonics(カナダ、オンタリオ州トロント)</td><td>n/a</td><td>手続き型プラットフォーム</td></tr></tbody></table>

マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

マウスモデルにおける胸腺内注射は、遺伝的および後天性T細胞障害を含む胸腺および免疫機能を研究するための重要な技術です。これには、試薬および/または細胞を生きているマウスの胸腺に直接沈着させる方法が必要です。胸腺内注射の伝統的な方法には、胸部手術または低侵襲経皮的盲検注射が含まれますが、どちらも重大な制限があります。超高周波超音波イメージング装置により、マウスへの画像誘導経皮注射が可能になり、経皮的注射アプローチの注入精度が大幅に向上し、より小さなターゲットの注入が可能になりました。ただし、画像誘導注入は統合されたレールシステムの利用に依存しているため、これは厳格で時間のかかる手順になります。ここでは、マウスの経皮的胸腺内注射のためのユニークで安全かつ効率的な方法を紹介し、注射のためのレールシステムへの依存を排除します。この技術は、高解像度のマイクロ超音波ユニットを使用してマウス胸腺を非侵襲的に画像化することに依存しています。フリーハンド技術を使用して、放射線科医は超音波検査ガイダンスの下で針先をマウス胸腺に直接配置することができます。マウスは、イメージングの前に洗浄および麻酔される。超音波ガイド下手順に長けた経験豊富な放射線科医にとって、述べられた技術の学習期間は非常に短く、通常は1セッション以内です。この方法は、マウスの罹患率および死亡率が低く、経皮的注射のための現在の機械的支援技術よりもはるかに高速である。これにより、研究者は、動物へのストレスを最小限に抑えながら、あらゆるサイズの胸腺(高齢マウスや免疫不全マウスの胸腺などの非常に小さな臓器を含む)の正確で信頼性の高い経皮注射を効率的に行うことができます。この方法は、必要に応じて個々のローブの注入を可能にし、手順の時間を節約する性質のために大規模な実験を容易にします。

この手法の実装を成功させるには、従うべきいくつかの重要な手順が必要です。第一に、胸腺自体の確実な識別が保証されなければならない。若いマウスでは、腺のサイズが大きいため、これは簡単です(図3A)。年配のマウスまたは免疫不全マウスでは、それはより困難な場合があります。しかし、それはまだ現代の超音波装置で非常に実行可能です(図3B、C)。第二に、針先が胸壁層を通って胸腺に前進している間、針の軌道が継続的に視覚化されるように針の軌跡を設定することが非常に重要です。注射が成功すると、針が進行している間に針が完全に視覚化されます。これにより、針が心臓、大動脈、下大静脈などの重要な構造を通過していないことをオペレーターに保証します(図4)。これは注射自体にも当てはまります。胸腺内沈着が確認されるように、注射中は常に針先をターゲット位置で視覚化する必要があります(図5)。
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本プロトコルは、開腹手術のリスクを回避し、盲検経皮的注射の精度を向上させるためにマウスの胸腺内注射のために確立されたインターベンショナルラジオロジー手順について説明しています。

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

このプロトコルは、従来の外科的および盲検注射方法に代わる、正確で安全かつ効率的な非外科的代替手段を提供します。また、高齢または免疫不全マウスの萎縮胸腺に対する最も正確な注射技術でもあります。主な利点は、非常に安全で正確でありながら迅速で、ストレスの少ない注射手順であるため、外科的ストレス関連の免疫抑制によるデータを損なうことなく大規模な実験を可能にすることです。針とトランスデューサーの位置合わせを維持しながら胸壁を通して進めるには、ある程度の練習が必要です。したがって、経験豊富なインターベンショナル放射線科医と協力して注射を行ったり、トレーニングを提供したりすることをお勧めします。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の技術者であるシャイナ・アヌンシオです。まず、脱毛クリームの薄層をマウスの前胸部に1分未満塗布して毛皮を取り除きます。濡れたペーパータオルを使用して、クリームとゆるい毛皮を取り除きます。後足のつまみに対する無反応により、適切な麻酔薬の深さを確認します。眼科用軟膏を両目に塗り、角膜の乾燥を防ぎます。ノーズコーンを所定の位置に置いた状態で、小動物超音波イメージングステーションの加熱されたプラットフォームの仰臥位に一度に1匹のマウスを置きます。後肢と前肢に医療用粘着テープでマウスをステージに固定します。グルコン酸クロルヘキシジンアプリケーターを使用して、毛皮のない胸部の上部皮膚を消毒します。利用可能な最高周波数リニアプローブをアクティブにします。典型的には、画像化される動物のサイズに対して最も高い空間分解能を有するプローブ。起動画面の後に対応するボタンをタップして、プローブをアクティブにします。イメージングと注射の超音波設定を最適化するには、画面の右側にある垂直方向のスライダーを調整して、視野の深さを対象動物に適したサイズに調整します。画面下部の水平バーに沿ってボタンをスライドさせて、グレースケールゲインを調整します。次に、焦点ゾーンを胸腺の予想されるレベルに調整します。トランスデューサーの表面を直立させた状態で、超音波装置ホルダーまたはアシスタントの手に約1ミリリットルの超音波ゲルを塗布します。加熱されたプラットフォームの隣に小さな滅菌フィールドを準備するには、滅菌プローブカバー、輪ゴム、滅菌手袋、および滅菌超音波ゲルを滅菌フィールドに空にします。次に、滅菌手袋を着用します。滅菌プローブカバーを超音波トランスデューサーとゲルの上に慎重に置きます。無菌性を維持するために、滅菌カバーにのみ触れてください。滅菌輪ゴムをプローブカバーの上にスライドさせて、所定の位置に保ちます。2〜3ミリリットルの滅菌超音波ゲルをトランスデューサーに置きます。超音波ゲルトッププローブをマウスの前胸壁の消毒部分に垂直に配置し、無菌性を維持しながら初期イメージングを行います。前に示したように、超音波画像を表示して最適化します。マウスの前胸部を横方向の平面でスキャンするには、トランスデューサーを垂直に持ち、絵筆のような、または掃引する動きで首から腹部まで上下に動かします。心臓を視野の中央に向け、トランスデューサーを首に向かって少しスイープします。胸の上部の両側にある2つの丸いペアの黒い構造に注意してください。超音波プローブを使用して、通常は注射の理想的な標的部位である胸腺の最も広い部分を見つけます。選択した場所で水平針の軌道を予測し、この部位の主要な血管がどこにあるかをメモします。これらの血管は注射中は避けるべきです。血管は低エコー性拍動構造になります。よくわからない場合は、画面上のカラーボタンをタップして血管内の流れを確認し、カラードップラーモードをアクティブにします。片手にトランスデューサーを持ち、もう片方の手に10マイクロリットルの注射液を入れた30ゲージのインスリン針を持ちます。注入プロセスを開始するには、胸腺が超音波視野の中心から外れるようにトランスデューサーを横方向に動かします。視野の反対側が主に超音波ゲルで構成され、他には何も含まれていないことを確認してください。針の先端をトランスデューサーの下のゲルに入れ、皮膚表面に隣接して視覚化されるまで針をゆっくりと動かします。超音波下で針を連続的にイメージングしながら、血管から離れて経皮軌道で胸腺に針を挿入します。交差胸腺水平軌道を使用して、針先を入口部位の反対側の胸腺葉に配置します。針先が胸腺の目的の部分に入ったら、超音波検査の視覚化を使用しながら、30ゲージの注射器から内容物をすばやく注入します。針の挿入および注入中にシリンジを安定させるには、シリンジを親指と人差し指の間に保持し、人差し指でシリンジプランジャーを制御します。すべての内容物が堆積した後、針を取り外します。若いマウスでは、胸腺のサイズが大きいため、胸腺の特定は簡単でした。それは、高齢または免疫不全マウスではより困難でした。しかし、それはまだ現代の超音波装置で非常に実行可能でした。注射の成功は、針が心臓、大動脈、または下大静脈の1つなどの重要な構造を横断しなかった場合に認められました。注射中に針先を標的位置に視覚化し、胸腺内沈着を確認しました。注射の胸腺内位置は、ルシフェラーゼトランスジェニックマウスへの注射物としてルシフェリンを用いて確認された。これらは生物発光イメージングで即座に評価され、動物を犠牲にすることなく注射の正しい位置を確認しました。あるいは、トリパンブルーを、剖検を伴うex vivoを用いて注射部位および注射精度の視覚マーカーとして注射した。私たちのグループでは、遺伝子改変前駆細胞の注入に基づく癌免疫療法研究を含むいくつかの大規模な研究にこの技術を使用し、免疫不全マウスの胸腺機能を改善しています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶマウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術。超音波ガイド下で針を正確に配置し、加齢や免疫不全マウスの萎縮した胸腺への注射が可能です。手術によるストレスを最小限に抑え、大規模実験を実現します。

マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術

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