Name: ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶ チラミドシグナル増強法によるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのリン酸化検出法。ZBP1発現HT-29細胞を用いた免疫蛍光染色でネクロプトーシス機構を可視化し、ウイルス感染研究に貢献します。

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VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。J.N.は、フランダース研究財団(FWO)の博士号フェローシップによってサポートされています。JMグループの研究は、オデュッセウスII助成金(G0H8618N)、EOS INLADIS(40007512)、フランダース研究財団(FWO)からのジュニア研究助成金(G031022N)、CRIG若手研究者の概念実証助成金、およびゲント大学の支援を受けました。P.V.グループの研究は、EOS MODEL-IDI(30826052)、EOS INFLADIS (40007512)、FWOシニア研究助成金(G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N)、メトサレム(BOF16/MET_V/007)、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、Foundation Against Cancer(F/2016/865、F/2020/1505)、CRIGおよびGIGGコンソーシアム、およびVIBの支援を受けました。

1.ビオチン化チラミドの調製
<ol><li>ビオチン-チラミドから始まるビオチン化チラミドを調製します。10 mMのストック溶液を作るには、3.6 mgのビオチン-チラミドを1 mLのDMSOに溶解します。溶解した製品を-20°Cでアリコートで保存し、品質を維持します。</li>
</ol>2. HT-29細胞の培養液の維持
注:ZBP1発現HT-29は、ヒトZBP1をコードするレンチベクター27 による形質導入によって生成された。
<ol><li>ZBP1発現HT-29細胞を、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および10%ウシ胎児血清(以下、フル培地と呼びます)を添加したマッコイの5A培地に保存し、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーター内で維持します。理想的には、通過数が少ない(10未満)セルを使用します。実験開始前の解凍サイクル後少なくとも5日間細胞を回復させてください。</li>
	<li>培養フラスコから細胞を剥離するには、培地を取り出し、5 mLのPBS(37°Cに予熱)で細胞を洗浄します。次に、適量のトリプシン/EDTA(それぞれ0.05%トリプシンと0.032%EDTA、37°Cに予熱)を細胞に加えます(T75フラスコの場合は2 mL、T175フラスコの場合は3 mL)。</li>
	<li>細胞をトリプシン/EDTAとともに、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーター内で最大10分間インキュベートします。その後、フラスコをタップし、4倍〜20倍の対物倍率の顕微鏡を使用して、細胞がフラスコから剥離したかどうかを視覚的に確認します。</li>
	<li>細胞が完全に剥離していない場合は、37°Cでさらに5分間インキュベートします。 細胞が剥離したら、フラスコに6 mLのフル培地を加えて酵素反応を停止します。</li>
	<li>細胞懸濁液を15 mLチューブに集めます。トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントし、生存率を評価します。1:5希釈をお勧めします。細胞の生存率が90%を超える場合にのみ実験を進めてください。</li>
</ol>3.細胞の実験、播種、刺激の開始
<ol><li>90,000個のZBP1発現HT-29細胞を、ハイエンドの顕微鏡観察を可能にする1cm²の表面積ウェルプレートにフル培地で播種します。ウェルあたり200 μLのエンドボリュームを使用してください。</li>
	<li>細胞を5%二酸化炭素で37°Cで一晩インキュベートします。染色コントロールのためにいくつかの追加のウェルを播種する必要があることを考慮してください(これはステップ5.6で詳しく説明します)。</li>
	<li>細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、ネクロプトーシスを誘発する刺激を細胞に追加します。ここでは、細胞をHSV-1 ICP6mutRHIM (感染多重度[MOI]5、プラーク形成単位(pfu)を細胞数で割った値として定義;pfuをVero細胞のプラークアッセイを用いて6時間、8時間、または10時間定量した。</li>
	<li>ネクロトーシス誘導のポジティブコントロールとして、30 ng/mL TNF、20 μMの汎カスパーゼ阻害剤zVAD-fmk、および5 μMのSMAC模倣体BV6を含むネクロプトーシス誘発カクテルで細胞を4時間刺激します。</li>
	<li>p-RIPK3(S227)染色の陰性対照として、RIPK3キナーゼ活性を阻害し、S227の自己リン酸化を防止するGSK'840(1μM)が挙げられる。理想的には、未処理の状態で、そしてネクロトーシス刺激の後に阻害剤を添加する。阻害剤はウイルス感染と同時に添加することができる。</li>
	<li>37°Cに予熱したフルメディウムで刺激を準備します。 すべての刺激にウェルあたり200 μLのエンドボリュームを使用してください。</li>
</ol>4.セルの固定
<ol><li>培地を除去し、200 μLの1x PBSで細胞を洗浄します。次に、150 μLの4%PFA(室温で平衡化済み)を細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。 注:簡単に剥離できるセルを使用している場合は、次のようにセルの固定を最適化できます。ウェルから100 μLの培地を取り出すと、プレート上に100 μLの容量が残ります。100 μLの4%PFAを細胞に加えます。細胞を室温で5分間インキュベートします。その後、ウェルから培地/固定液を取り出し、150 μLの4%PFAと交換します。細胞を完全に固定するために、室温でさらに20分間細胞をインキュベートします。</li>
	<li>固定後、4%PFAを除去し、200 μLの1x PBSで細胞を3倍洗浄します。サンプルは、さらなる処理が行われるまで、4°Cで一晩、1x PBSの過剰(>200 μL)で保存できます。</li>
</ol>5.透過処理と一次染色
<ol><li>PBSを除去し、100 μLの透過処理バッファー(PBS中の0.5%Triton X-100)を加えます。室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>透過処理バッファーを除去し、続いて100 μLの洗浄バッファー(PBS中の0.1%Triton X-100)でウェルを洗浄します。イメージングチャンバーを洗浄バッファーとともに、傾斜した実験室のシェーカーで室温で5分間インキュベートします(毎分20〜30回の揺動運動)。</li>
	<li>一次抗体の非特異的結合を防ぐために、100 μLのブロッキング培地を添加し、室温で2時間インキュベートします。あるいは、このブロッキングステップは、室温で1時間、PBS中の3%BSA、0.1%Triton-X-100でブロッキングすることによって置き換えてもよい。</li>
	<li>ウェルを100 μLの洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファーを除去した後、一次抗体をイメージングチャンバーに加え、4°Cで一晩インキュベートします。 ウェルを覆うために100 μLのエンドボリュームを使用します。4°Cで一晩インキュベーション中は、イメージングチャンバーを傾斜した実験用シェーカーに置かないでください。 注:抗p-MLKL(S358;希釈:1:200)および抗p-RIPK3(S227;希釈:1:200)はウサギを宿主種として共有するため、1つのウェルに組み合わせないでください。ウイルス感染を監視するには、選択したウイルスタンパク質に対する一次抗体をp-MLKL(S358)またはp-RIPK3(S227)と組み合わせます。ここでは、細胞をHSV-1感染感染に感染させた後、ICP0染色を行った(希釈:1:50、宿主種:マウス)。</li>
	<li>この時点で必要な染色コントロールを考慮してください。TSA増幅ステップの潜在的なバックグラウンドを視覚化するために、常に一次抗体なし条件を含めてマスキング閾値を設定します(ステップ9を参照)。 注:共染色プロトコル(例:p-MLKL [S358]またはp-RIPK3 [S227]をウイルスタンパク質に対する抗体と組み合わせる)の場合は、単一の染色も使用します。単一の染色の使用は、他のイメージングチャネルの潜在的なブリードスルー信号を補正するために重要です。</li>
</ol>6. チラミドシグナル増幅(TSA)
<ol><li>一次抗体ミックスを除去し、100 μLの洗浄バッファー(PBS溶液0.1% Triton X-100)でウェルを3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファーを除去し、増幅が必要な一次抗体の種を認識するHRP標識二次抗体を100 μL加えます。p-RIPK3(S227)またはp-MLKL(S358)シグナルを増幅するには、抗ウサギHRPを100 μL添加し、傾斜ラボ用シェーカーで室温で30分間インキュベートします。 注:p-MLKL(S358)またはp-RIPK3(S227)のみが増幅されます。ウイルスタンパク質の染色は、標準的な間接染色法を使用して視覚化されます。</li>
	<li>その後、ウェルを100 μLの洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>次のステップでは、ビオチン化チラミドを顕微鏡プレートに追加します。二次抗体に結合したHRP基を用いて、酵素反応は一次標的に近接したチラミドラジカルの形成を引き起こす(ここでは、p-MLKL [S358]またはp-RIPK3 [S227])。</li>
	<li>HRPの酵素活性を活性化するには、ビオチン化チラミドと一緒に酸化基質を追加します。これを達成するには、TSAバッファー(0.1 Mホウ酸[pH 8.5])に0.03 M H 2 O2を補給します。具体的には、5 mLのTSAバッファーを取り、5 μLの30%H2O2を加えます。</li>
	<li>次に、ビオチン-チラミドをH2O2添加TSAバッファーで1:1,000から1:20,000の範囲で希釈します。 注:ビオチン-チラミドの希釈係数は、バッチごとに最適化する必要があります。</li>
	<li>ウェルから洗浄バッファーを取り出し、希釈したビオチン-チラミドをウェルに添加して終末容量を100 μLにします。 傾斜した実験用シェーカーで室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>次に、ウェルを100 μLの洗浄バッファー(PBS中の0.1%Triton X-100)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。</li>
</ol>7. 蛍光色素
注:一次抗体のシグナルはビオチン基に変換されるため、p-MLKL(S358)およびp-RIPK3(S227)は、蛍光色素に結合したストレプトアビジンを使用して視覚化されます(フルオロフォア568、希釈:1:500)。さらに、核をDAPI(5 μg/mL)で染色します。ウイルスタンパク質が染色プロトコルに含まれている場合は、一次抗体の宿主種に対する適切な蛍光標識二次抗体を含めます。代表的な結果では、マウス抗ICP0を使用した。二次抗体として、フルオロフォア633に結合したヤギ抗マウス(希釈:1:1,000)が含まれていた。
<ol><li>上記の抗体と染色剤を含む洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で染色ミックスを作ります。洗浄バッファーを除去し、染色ミックス100 μLを加え、傾斜ラボ用シェーカーで室温で1時間インキュベートします。このステップ以降、イメージングチャンバーを光から遮蔽してください。</li>
	<li>次に、ウェルを洗浄バッファー(PBS中の0.1%トリトンX-100)で2回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>最後に、ウェルを1x PBSで2回すすぎます。イメージングするまで、サンプルを1x PBSの過剰(>200 μL)で保存します。あるいは、サンプルを封入剤に浸して染色を保存します。これで、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。</li>
</ol>8. 共焦点顕微鏡によるイメージング
<ol><li>イメージングの少なくとも10分前に共焦点顕微鏡とレーザーの電源を入れます。</li>
	<li>感度のために液浸対物レンズを使用してください。好ましくは、40倍または63倍の対物倍率を使用する。イメージングする前に、適切なコットンボールを使用してレンズクリーナーで液浸対物レンズを清掃します。対物レンズが汚れていると(ほこりなど)、画像の品質が低下する可能性があります。</li>
	<li>イメージングチャンバーの底に過剰量のオイルを入れます。さらに、選択した目的にオイルを一滴加えます。</li>
	<li>イメージングチャンバーを顕微鏡の上に置きます。DAPI染色または明視野イメージングを使用してフォーカスフィールドを見つけます。必要に応じて、イメージングチャンバーの周りを移動して、液浸オイルが適切に広がるようにします。</li>
	<li>顕微鏡に必要なイメージングトラックを設定します。顕微鏡によって、以下の手順は異なる場合があります(表1)。 注意: イメージングトラックを設定するときは、核染色が最後に測定されるようにトラックをプログラムしてください。405 nmレーザーは、光退色に寄与し、したがって、すべてのチャネルで特定の信号が失われる可能性があります。</li>
	<li>p-RIPK3 (S227) または p-MLKL (S358) の存在について完全なセルを分析するには、セルの高さにまたがる Z スタックを測定します。ここでは、zスタックは0.16μmごとに40スライスで構成されており、6.22μmの範囲になりました。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>トラック</td>
			<td>レーザー</td>
			<td>ビームスプリッター</td>
			<td>フィルター</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">ウイルス遺伝子: ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">核: ダピ</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>表1:細胞可視化のためのイメージングトラック。
9.データ分析と定量化
<ol><li>顕微鏡画像をソフトウェアにアップロードします。拡張フォーカスを使用して、Z スタックのすべての情報を 2D 画像で視覚化します。</li>
	<li>次に、以下の情報を抽出するために解析プロトコルをプログラムする:画像当たりの細胞数、p-RIPK3(S227)+またはp-MLKL(S358)+染色を示すボクセルの合計。ボクセルは、ピクセルに相当する 3 次元ボリュームを表します。</li>
	<li>画像あたりの細胞数を定量化するには、核をセグメント化します。セグメンテーション結果のノイズを低減するには、セグメンテーションにサイズ制限(>100 μm³)を追加します。セグメント化された核の数は、画像内の細胞の数を表します。</li>
	<li>p-RIPK3 (S227)+ または p-MLKL (S358)+ ボクセルの量を定量化するには、しきい値ベースのセグメンテーションをプログラムします。一次抗体なし(NP)画像でシグナルがピックアップされないように閾値を設定します。</li>
	<li>未処理のモック条件の画像を使用して、しきい値をさらに調整します。ネクロトーシス刺激による信号増加を高感度に検出するには、より高いしきい値を設定して、模擬条件でp-RIPK3(S227)+またはp-MLKL(S358)+ボクセルのピックアップを制限します。プログラムされた分析プロトコルを、模擬状態とネクロプトーシス誘発ウイルス感染からのいくつかの画像で常に確認してください。</li>
	<li>すべての画像セットに対して分析を実行します。ボクセル定量化と核セグメンテーションを.txtファイルにエクスポートして、スプレッドシートソフトウェアでさらに処理します。</li>
	<li>画像名、核の定量化、検出されたボクセルの合計を示すデータのピボットテーブルを作成します。</li>
	<li>次に、正のボクセルの合計を画像内のセル数で割ります。これにより、セルあたりの正のボクセルの相対値が得られます。フォールドの増加を視覚化するには、セルあたりの p-RIPK3 (S227)+ または p-MLKL (S358)+ ボクセルの相対値を未処理条件の中央値 (mock) で割ります。</li>
</ol>

<ol><li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

この免疫蛍光染色プロトコルでは、RIPK3およびMLKL26のリン酸化など、検出が困難なヒトネクロトーシスシグナル伝達経路のシグナル伝達イベントの感度を高めるためのチラミドシグナル増幅(TSA)の使用について説明しています。TSAステップを含めることで、p-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の検出閾値が大幅に向上し、p-MLKL(S358)ひずみの感度が向上します。TSAは、模擬処理されたサンプルにすでに存在するp-RIPK3(S227)シグナルを明らかにしました。ヒト細胞では、S227でのRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの安定した相互作用を可能にすることによるネクロトーシス活性化の前提条件です。このプロセスはすでに基礎レベルで発生しており、ネクロトーシス誘導の前に安定した不活性なp-RIPK3(S227)/MLKL二量体の形成をもたらします2,5,31。同様に、本研究で用いた抗p...

受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロトーシス細胞死の中心的な調節因子です1,2。ネクロトーシスは、抗ウイルス免疫と自己炎症に関与する調節された細胞死の溶解性および炎症性形態です。ウイルス感染細胞のネクロトーシスは、ウイルス複製を直ちにシャットダウンします。ネクロトーシス誘導後の細胞溶解は、抗ウイルス免疫を刺激する損傷関連の分子パターンも放出します3,4。ネクロトーシスは、RIPホモタイプ相互作用モチーフ(RHIM)を介した3つの上流活性化分子のうちの1つとのRIPK3の活性化によって開始されます:RIPK1(TNF受容体1[TNFR1]の関与時)、TIRドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ(TRIF;Toll様受容体3および4の関与時)、または抗ウイルス核酸センサーZ-DNA結合タンパク質1(ZBP1)1,2。.ネクロトーシスシグナル伝達は、RIPK3の自己リン酸化から始まる一連のリン酸化イベントを通じて進行します。キナーゼドメイン内のセリン(S)227でのヒトRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの相互作用を可能にすることによるネクロトーシスの前提条件であり、ヒトRIPK3活性化およびネクロトーシス細胞死の生化学的マーカーとして一般的に使用されています1,5。活性化されると、RIPK3はスレオニン(T)357およびS3581でMLKLの活性化ループをリン酸化します。これにより、MLKL立体構造が変化し、N末端4ヘリックスバンドルドメインが露出します。その後、MLKLはオリゴマー化して細胞膜に輸送し、脂質二重層に露出した4つのらせん束を挿入することで細孔を形成し、最終的に細胞死につながります2,6。
ZBP1は、Z立体構造中の二本鎖RNA(Z-RNA)を含む左巻きのZ型核酸を認識する抗ウイルス核酸センサーです。Z-RNA結合は、ZBP1のN末端に位置する2つのZαドメインを介して起こる。RNAおよびDNAウイルス感染中に蓄積するZ-RNAは、ZBP1 7,8に直接関与すると考えられている。活性化されたZBP1は、その中央RHIMを介してRIPK3をリクルートし、ネクロトーシスを含む調節された細胞死を誘導します9,10。ウイルスは、ZBP1誘導宿主細胞ネクロトーシスに対抗するために、数多くのエスケープメカニズムを採用しています11。例えば、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット1は、ICP6として知られ、UL39によってコードされ、そのN末端にRIMを有し、ヒト細胞におけるZBP1媒介RIPK3活性化を妨害する12,13,14,15。ZBP1はウイルス複製を制限するだけでなく、マウス研究はZBP1活性化が炎症性疾患を引き起こし、癌免疫を刺激することを示しています16、17、18、19、20、21。したがって、ヒト細胞におけるZBP1誘発ネクロトーシス中に発生するシグナル伝達イベントを検出するプロトコルは、これらのプロセスにおけるZBP1の役割を評価するために価値があります。
チラミドシグナル増幅(TSA)は、触媒レポーターデポジション(CARD)とも呼ばれ、抗体ベースのイムノアッセイにおける検出限界とS/N比を改善するために開発されました。TSAの際には、任意の一次抗体を使用して目的の抗原を検出することができます。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、二次抗体と結合し、過酸化水素の存在下でビオチン化チラミドラジカルの局所的な蓄積を触媒します。これらの活性化されたビオチン-チラミドラジカルは、近位チロシン残基と反応して共有結合を形成します。潜在的なチラミド-ビオチン基質には、抗原自体、一次抗体と二次抗体、および隣接タンパク質が含まれます。したがって、TSAはアッセイの感度を有意に向上させるが、その空間分解能の一部は失われる。最終ステップでは、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してビオチン分子を検出します。HRP反応は、目的の抗原上または抗原の近くに多くのチラミド-ビオチン分子を沈着させます。これにより、ストレプトアビジン-蛍光色素結合部位の数が大幅に増加し、アッセイの感度が大幅に増幅されます(図1)。あるいは、チラミドを蛍光色素に直接結合させることができるため、ストレプトアビジン共役蛍光色素が不要になります。タンパク質免疫組織化学とDNA/RNAin situハイブリダイゼーションは、TSAがシグナル強度を改善するために採用された最初の方法の1つでした22,23。最近では、TSAは細胞内フローサイトメトリー24および質量分析25と組み合わされています。
ここでは、免疫蛍光顕微鏡を用いて、HSV-1感染によるZBP1の活性化時にセリン227リン酸化ヒトRIPK3(p-RIPK3[S227])およびリン酸化ヒトMLKL(p-MLKL [S358])を検出するためのプロトコルを提示する。ヒトZBP1を安定発現するように形質導入したネクロプトーシス感受性HT-29ヒト大腸腺癌細胞株を使用します。これらの細胞は、ウイルスRHIM(VQCG)内の4つのコアアミノ酸がアラニン(AAAA)に置換された変異ICP6タンパク質(HSV-1 ICP6mutRHIM)を発現するHSV-1株に感染し、それによってICP6がZBP1を介したネクロトーシスをブロックできないようにしました13,14,15。免疫染色26において、現在市販されているp-RIPK3およびp-MLKLに対する抗体のシグナル対ノイズ比が低いという問題を克服するために、チラミドシグナル増幅(TSA)ステップ(図1)を実行し、その結果、ヒトp-RIPK3の検出がロバストになり(S227)、ヒトp-MLKL(S358)の検出感度が桁違いに向上します。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギHRP</td><td>Agilent Technologies Belgium</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Secundary antibody</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) 抗体</td></tr><tr><td>IAV-PR8 マウス血清</td><td>自社生産</td><td>xx</td><td>マウス抗IAV-PR8ポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>ウサギ抗MLKL-リン酸化 S358 抗体</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>ウサギ抗 RIPK3-リン酸化 S227 抗体</td></tr><tr><td>Fluorophores</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D21490</td><td>細胞の核を可視化する</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>ビオチン分子を可視化する</td></tr><tr><td>Compounds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>HRP活性に必要な酸化基質</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>細胞の固定/架橋</td></tr><tr><td>ビオチニルチラミド</td><td>R&D Systems</td><td>6241</td><td>シグナルを増幅するために、HRP基質</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP阻害剤</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>細胞培養の場合:細胞を切り離す</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>8.0 g/L NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>0.4 g/L EDTAの二ナトリウム塩</td></tr><tr><td>EDTA 0.04%</td><td>自社製剤</td><td></td><td>1.1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>0.2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>0.2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>0.2 g / Lグルコース</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>細胞培養用、細胞培養の維持; ロット番号: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>アオビウス</td><td>AOB0917</td><td>RIPK3 キナーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>細胞培養用、細胞培養の維持</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>アクティブモチーフ</td><td>15252</td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>細胞培養用、細胞培養TNF</td></tr><tr><td>-&alphaの維持;</td><td>社内生産</td><td>-</td><td>シグナル伝達分子、BV6およびzVADと組み合わせて細胞死を誘発することができる</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787-50ML</td><td>細胞を透過化するために</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>メルク</td><td>11732</td><td>細胞カウント用、0.1%で生死マーカーとして使用</td></tr> <tr><td>トリプシン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T4424</td><td>細胞培養用:細胞zVAD</td></tr><tr><td></td><td>を分離するBachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-スライド8ウェル高ガラス底</td><td>iBidi</td><td>80807</td>細胞<td>を培養するには</td></tr><tr><td>綿プレッピングボールサイズ中</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71001-10</td>目的<td>をきれいにするために</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg;C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>高倍率でサンプルを視覚化するには</td></tr><tr><td>レンズクリーナー</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>対物レンズをきれいにするには</td></tr><tr><td>LSM880 Fast Airyscan 共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>サンプルを視覚化するには</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>データを処理するには</td></tr><tr><td>プリズム 9</td><td>グラフパッド</td><td>xx</td><td>データを分析するには - 統計的テストとグラフ生成</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>定量化を実行するには</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>画像を取得して処理するには</td></tr><tr><td>Zen blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>画像を視覚化するには</td></tr><tr><td>Viruses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HSV-1(mutRHIM)F株</td>は、ネクロプトーシスのトリガーとして<td>、家で複製</td>HSV-1の<td>Jiahuai Han</td>博士<td>によって生成されます。UL39/ICP6のRHEMコアドメインは変異(VQCG>AAAA)</td></tr><tr><td>HSV-1(WT)F株</td><td>によって産生され、漢嘉懐博士が</td><td>ネ</td><td>クロプトーシス誘導(ICP6阻害)のネガティブコントロールとしてハウスレプリケーションHSV-1(WT)を産生しましたネ</td></tr><tr><td>クロプトーシスのトリガーとしての</td><td>ハウスストック</td><td>の</td><td>IAV PR8</td></tr></tbody></table>

ヒト細胞におけるhsv-1感染後のripk3およびmlklのzbp1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

キナーゼ受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)およびその基質混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、重要な抗ウイルス機能を備えた炎症性細胞死型であるネクロプトーシスの重要な調節因子です。RIPK3の自己リン酸化は、ネクロトーシスMLKLの細孔形成実行タンパク質のリン酸化および活性化を誘導する。細胞膜でのリン酸化MLKLのトラフィッキングとオリゴマー化は、ネクロトーシス細胞死の特徴である細胞溶解をもたらします。核酸センサーZBP1は、RNAおよびDNAウイルスに感染した後、左巻きZ型二本鎖RNA(Z-RNA)に結合することによって活性化されます。ZBP1活性化は、感染した宿主細胞のネクロプトーシスを含む調節された細胞死を誘導することにより、ウイルス感染を制限します。免疫蛍光顕微鏡法は、ZBP1を介したネクロトーシスの下流にあるさまざまなシグナル伝達ステップを細胞ごとに視覚化することができます。しかしながら、ヒトRIPK3およびMLKLに対する現在市販のホスホ特異的抗体を用いた標準的な蛍光顕微鏡の感度は、これらのマーカーの再現可能なイメージングを妨げる。ここでは、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)に感染したヒトHT-29細胞におけるセリン(S)リン酸化RIPK3(S227)およびMLKL(S358)の最適化された染色手順について説明します。免疫蛍光染色プロトコルにチラミドシグナル増幅(TSA)ステップを含めることで、S227リン酸化RIPK3の特異的検出が可能になります。さらに、TSAはS358リン酸化MLKLの検出感度を大幅に向上させます。一緒に、この方法は、ZBP1誘発ネクロプトーシスの誘導中のこれら2つの重要なシグナル伝達イベントの視覚化を可能にします。

ヒト細胞におけるMLKLリン酸化、特にRIPK3リン酸化の免疫蛍光検出は技術的に困難です26。ここでは、ZBP1の活性化時のヒトp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の染色プロトコルの改善を紹介します。このプロトコルには、蛍光シグナルの検出限界と感度を改善するためのTSAステップが含まれています。この方法を検証するために、TSAを介した免疫蛍光とp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の両方の標準的な間接蛍光染色を並べて比較しました。
ヒトZBP1を発現するHT-29細胞にICP6 RIM変異体HSV-1株(HSV-1 ICP6mutRHIM)を9時間感染させ、ZBP1媒介ネクロトーシスおよびRIPK3リン酸化を誘導した。HSV-1 ICP6mutRHIM株は、ICP6 RIM内でVQCGからAAAAへの変異を持ち、ZBP1の下流のネクロトーシスシグナル伝達を遮断することができません14,15</su...

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

ネクロトーシス誘導中の2つの重要なシグナル伝達イベントであるリン酸化RIPK3とMLKLの堅牢な視覚化は、技術的に困難でした。提示されたチラミド増幅プロトコルは、これら2つの分子の高感度検出を可能にする。シグナル増幅ステップは検出閾値を下げ、リン酸化RIPK3およびMLKLの堅牢で再現性のある検出を可能にします。90, 000個のZBP1発現HT-29細胞を、1センチメートル四方の表面積ウェルプレートに全強度マッコイの5A培地に播種し始め、ハイエンドの顕微鏡観察を可能にします。ウェルあたり200マイクロリットルのエンドボリュームを使用してください。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、単純ヘルペスウイルス1を含む200マイクロリットルの予熱された全強度マッコイの5A培地で細胞に感染し、5の感染の多重度でリム変異体ICP6をコードする。細胞をウイルスと一緒に9時間インキュベートして、ネクロプトーシスを誘発します。ネクロトーシス誘導のポジティブコントロールとして、200マイクロリットルの予熱ネクロプトーシス誘発カクテルで細胞を4時間刺激します。陰性対照として、摂氏37度に予熱した10マイクロモルのGSK22マイクロリットルGSK3を加えて、RIPK3キナーゼ活性を阻害します。セリン227の自己リン酸化を防ぐために、未処理の状態およびネクロトーシス刺激後にこの阻害剤を含める。細胞を固定するには、培地を取り除き、200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。次にPBSを取り出し、室温で平衡化した150マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。細胞を室温で30分間インキュベートします。固定後、4%パラホルムアルデヒドを除去し、200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。サンプルは、さらに処理されるまで、摂氏4度で一晩PBSを超えて保存できます。プレートからPBSを取り出し、細胞を100マイクロリットルの透過バッファーとともに室温で傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、透過処理バッファーを除去し、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を洗浄します。イメージングチャンバーを洗浄バッファーとともに、傾斜ラボシェーカーで室温で5分間インキュベートします。一次抗体の非特異的結合を防ぐために、プレートを100マイクロリットルのブロッキング媒体とともに室温で2時間、傾斜ラボシェーカーでインキュベートします。次に、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜実験室用シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルの一次抗体をイメージングチャンバーに加えます。チラミドシグナル増幅の潜在的なバックグラウンドを視覚化し、マスキング閾値を設定するために、一次抗体なし条件を必ず含めてください。チャンバーを摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体ミックスを除去し、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルのHRP標識二次抗体と共に細胞をインキュベートし、増幅される一次抗体の種を認識し、傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートする。抗体インキュベーション中に、ビオチン化チラミドミックスを調製します。HRPの酵素活性を誘発するには、使用前に新たに酸化基質をTSAバッファーに加えます。次に、最適化された希釈を使用して、調製したTSAバッファーでビオチン化チラミドを希釈します。HRP標識二次抗体でインキュベートした後、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボ用シェーカーで5分間インキュベートします。ウェルから洗浄バッファーを除去した後、希釈したビオチン-チラミドをウェルに添加して、終末容量を100マイクロリットルにします。室温で10分間傾斜した実験用シェーカーで反応をインキュベートし、続いて洗浄バッファー洗浄を3回行います。二次抗体、結合ストレプトアビジン、核染色剤および洗浄バッファーを含む染色ミックスを調製します。洗浄バッファーを除去し、プレートを100マイクロリットルの染色ミックスとともに室温で傾斜ラボシェーカーで1時間インキュベートします。このステップ以降、イメージングチャンバーを光から遮蔽してください。染色後、洗浄バッファーで2回連続して洗浄し、ウェルをPBSで2回すすぐ。PBSを超えるサンプルを摂氏4度で保存し、イメージングまで染色を保持します。これで、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。チラミドシグナル増幅を含めることで、リム変異型ICP6感染細胞をコードする単純ヘルペスウイルス1の細胞質ゾル中のセリン227でリン酸化されたRIPK3の堅牢な検出が可能になりました。高感度検出には2%のレーザー出力で十分でした。標準的な間接免疫蛍光法では、より高いレーザー出力はホスホ-RIPK3の検出には不十分でした。3次元Zスタック画像の定量化において、感染細胞は、模擬処理された細胞よりもリン酸化RIPK3陽性のボクセルの約20倍の増加を示した。模擬処理細胞と比較して野生型単純ヘルペスウイルス1感染細胞のホスホRIPK3染色の増加は、ICP6のリムドメインがセリン227でのRIPK3リン酸化を完全にブロックできないことを示しました。GSK840はRIPK3のキナーゼドメインに結合し、ZBP1活性化時にセリン227でのRIPK3リン酸化を防止し、チラミドシグナル増幅媒介ホスホRIPK3検出法の特異性を確認した。模擬処理した細胞は、セリン358でのMLKLリン酸化のわずかに中断された細胞質染色で低値を示しましたが、感染細胞の細胞質ゾル、核、および原形質膜で強い染色が検出されました。標準的な間接免疫蛍光法では、感染細胞におけるホスホMLKLシグナルを特異的に検出するために40%のレーザー出力が必要でした。対照的に、チラミド信号増幅はホスホMLKLの検出感度を増加させ、それによって必要なレーザー出力を6%3D Zスタック画像定量に低下させ、チラミドシグナル増幅を使用した場合と比較して、ホスホMLKL陽性のボクセル数が約90倍増加し、標準法を使用した場合と比較して、ホスホMLKLの検出閾値と感度が向上したことを示しています。単純ヘルペスウイルス1と同様に、インフルエンザAウイルス感染はZBP1依存性ネクロプトーシスを引き起こしました。チラミドシグナル増幅により、ホスホ-RIPK3およびホスホ-MLKLの堅牢な検出が可能になり、ネクロプトーシスを示しました。共焦点染色を解釈するには、いくつかの染色コントロールを含める必要があります。これには、一次状態なし、単一の汚れ、およびポジティブコントロールが必要です。このプロトコルを適応させることにより、シーケンシャルTSAを使用して複数のターゲットを増幅することができます。これにより、同じ細胞内でリン酸化されたRIPK3とMLKLの検出が可能になります。ネクロトーシスバイオマーカーの高感度検出は、実行されたZBP1依存性細胞死経路がネクロプトーシス、アポトーシス、またはパイロトーシスのいずれかとして確認される必要がある自己炎症またはウイルス感染に関する進行中のZBP1研究にとって洞察に満ちたものです。

tyramide-signal-amplification-for-immunofluorescent-staining-zbp1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

片頭痛と慢性片頭痛への変換が改善された治療の選択肢の必要性の巨大なヘルスケアの負担です。我々は、モデル化、神経免疫シグナル伝達が片頭痛に対する感受性を調節する方法を定義するために模索...

拡散うつ病を使用してエピソードと慢性片頭痛の神経免疫シグナルのモデリングインビトロ</em

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。...

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオは、単純ヘルペスウイルス-1感染における感染細胞タンパク質0、ICP0の輸送を監視する方法を示しています。de...

感染細胞におけるウイルスタンパク質の局在化のための免疫蛍光法

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

皮膚は、ヒト病原体単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）の標的組織の一つです。HSV-1の組織への浸潤経路を探るために、皮膚の最外層を表すマウス表皮シートのex...

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0...

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。...

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

本研究では、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)に感染した単球由来樹状細胞におけるオートファジーフラックスを妨害する阻害剤およびsiRNAベースの戦略を提示する。...

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c...

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

学ぶ チラミドシグナル増強法によるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのリン酸化検出法。ZBP1発現HT-29細胞を用いた免疫蛍光染色でネクロプトーシス機構を可視化し、ウイルス感染研究に貢献します。

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

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