Name: in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶナノバー支持脂質二重層システムを用いた膜曲率感知タンパク質のin vitro解析法。高分解能ナノ加工技術で定義された曲率を持つ合成膜を構築し、細胞活動におけるタンパク質動態を詳細に研究できます。

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ナノ構造製造とSEMイメージングをサポートしてくれた南洋ナノファブリケーションセンター(N2FC)と南洋理工大学(NTU)の破壊的フォトニックテクノロジーセンター(CDPT)、タンパク質精製のための生物科学院NTUのタンパク質生産プラットフォーム(PPP)、共焦点顕微鏡の化学生物医学工学部NTUに感謝します。この研究は、シンガポール教育省(MOE)(W. Zhao、RG112/20、RG95/21、およびMOE-T2EP30220-0009)、デジタル分子分析科学研究所(IDMxS)によって資金提供されており、研究センターオブエクセレンススキーム(W. Zhao)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム財団(W. Zhao、RGY0088/2021)、NTUスタートアップグラント(W. Zhao)、 研究奨学金のための化学および生物医学工学NTUの学校(X.Miao)、および研究奨学金のための中国奨学金評議会(J.Wu)。

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
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著者は、この研究に競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

ここで説明するnanobar-SLBシステムは、いくつかの既存のin vitroアッセイにおける利点のユニークな組み合わせを提供します。リポソーム浮遊または沈降アッセイとして、高度に湾曲した膜へのタンパク質の優先的な結合を効率的に明らかにしますが、必要なサンプルははるかに少なく、個々のナノバーでより正確に定義された曲率を提供します8,29。また、SLiCアッセイと同時に比較するための正確な曲率を幅広く提供し、SLBは可動性であり、すべてのサイズのナノバーを連続的にしっかりとカバーするため、異なる曲率での脂質組成の変化や、光の回折限界を下回るサイズで検出できない形態学的または曲率の変化についての懸念が少ない30.Nanobar-SLBはまた、テザープリングアッセイとして湾曲した膜上のタンパク質の動的挙動を観察することを可能にするが、チューブ生成のスループットおよび光学的トラッピング操作の経験によって制限されない13</su...

膜湾曲は、形態形成、細胞分裂、細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで発生する細胞の重要な物理的パラメータです1。膜の湾曲は細胞イベントの単純な結果を超えていることが現在広く認識されています。代わりに、タンパク質相互作用と細胞内シグナル伝達の効果的な調節因子として浮上しています。例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与するいくつかのタンパク質は、湾曲した膜に優先的に結合し、エンドサイトーシスのホットスポットを形成することが見出された2。膜変形の原因は、細胞骨格力による膜の引っ張り、異なるサイズの頭部基を持つ脂質非対称性の存在、円錐形の膜貫通タンパク質の存在、BARドメインタンパク質(Bin、アンフィフィシン、Rvsタンパク質にちなんで名付けられた)などの膜形成タンパク質の蓄積、および両親媒性ヘリックスドメインの膜への挿入など、さまざまな原因があります1.興味深いことに、これらのタンパク質と脂質は膜を変形させるだけでなく、膜の湾曲を感知し、優先的な蓄積を示すことができます1。したがって、曲率の異なる膜が、それらに付着したタンパク質や脂質の分布や動態、および関連する細胞内プロセスへの潜在的な影響を変化させるかどうか、またどのように変化するかを研究することが重要です。
生細胞系とin vitro系の両方における湾曲膜とタンパク質の相互作用を分析するために、多くの技術が開発されてきました。生細胞システムは、豊富な脂質多様性と動的なタンパク質シグナル伝達調節を備えた実際の細胞環境を提供します2,3,4,5,6,7。しかし、このような洗練されたシステムは、細胞内環境の不確実性と変動のために研究が困難です。したがって、既知の脂質種と精製タンパク質で構成される人工膜を使用したin vitroアッセイは、タンパク質と湾曲した膜との関係を特徴付けるための強力な再構成システムになっています。伝統的に、異なる直径のリポソームは、遠心力を用いた共沈降アッセイまたはタンパク質凝集を回避するための密度勾配を有する共浮遊アッセイのいずれかを介して曲率感受性タンパク質を検出するために押出成形によって生成される8,9。しかしながら、押出リポソームの曲率は、押出機10で使用されるメンブレンフィルターの利用可能な孔径によって制限される。単一リポソーム曲率(SLiC)アッセイは、異なる直径を有するリポソームが蛍光標識され、表面に固定化され、曲率を蛍光強度によってマークすることができるというこの制限を克服することが証明されている11。しかしながら、脂質組成の強い変動は、小さな小胞において観察されており、これは曲率測定の精度に影響を及ぼす12。テザー引っ張り実験は、光ピンセットを使用して巨大な単層小胞(GUV)から引き出された過渡テザーの曲率のより正確な測定を提供し、曲率は生成された膜張力によって十分に制御することができる13,14。この方法は、正または負の曲率感知タンパク質の研究に適していますが、チューブジェネレーション10のスループットによって制約されます。サポートされているメンブレンチューブ(SMrT)アッセイは、マイクロ流体の流れによって同じ脂質リザーバーから押し出される複数のメンブレンチューブの同時生成を可能にします。それにもかかわらず、膜の曲率はナノチューブに沿って本質的に変化し、蛍光強度に基づく曲率測定の精度を損なう15,16。比較すると、小さな単層小胞(SUV、直径<100nm17)を使用して、設計されたトポグラフィーを含む表面に支持された脂質二重層(SLB)を形成し、ナノ加工またはナノ材料によって所定の曲率を有する単一の二層膜を高精度で生成した18、19、20。
ここでは、ナノバーアレイを用いて作製したナノチップ表面上にSLBを形成するためのプロトコルと、それを使用してin vitroでタンパク質の曲率感度を調べる方法を紹介します。 図1に示すように、アッセイには6つの必須コンポーネントがあります:A)マイクロ流体チャンバーによるチップの洗浄と組み立て。B)定義された脂質組成を有するSUVの調製;C)ナノチップ上でのSLBの形成および湾曲感受性タンパク質との結合;D)蛍光顕微鏡下でのSLBおよび曲率感受性タンパク質のイメージングおよび特性評価。E)再利用のためにチップをクリーニングする。F)タンパク質曲率感知能の定量的解析のための画像処理。詳細なプロトコルについては、以下で段階的に説明します。

<table><tbody><tr><td>無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>ダイヤモンド</td><td>RN0879999FU</td><td></td></tr><tr><td>琥珀バイアル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27115-U</td><td></td></tr><tr><td>脳 PS:L-&α;-ホスファチジルセリン(脳、ブタ)(ナトリウム塩)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840032</tr><tr><td>10 mL ビーカー</td><td>ショット・デュラン</td><td>SCOT211060804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ビーカー</td><td>ショット・デュラン</td><td>SCOT211061706</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL</td><td>シーカー ショット・デュラン</td><td>SCOT211065408</td><td>2 番目の容器&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800117</td><td></td></tr><tr><td>Cotton buds</td><td>Watsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18:1 DGS-NTA(Ni):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸)サクシニル](ニッケル塩)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>790404</tr><tr><td>卵PC:L-&α;-ホスファチジルコリン(卵・鶏肉)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840051</tr><tr><td>F-BAR</td><td>タンパク質生産プラットフォーム、南洋理工大学生物科学部、シンガポール</td><td></td><td>タンパク質およびペプチド</td></tr><tr><td>F-BAR+IDR</td><td>タンパク質生産プラットフォーム、南洋理工大学生物科学部、シンガポール</td><td></td><td>タンパク質およびペプチド</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td><td></td><td>Proteins and peptide</td></tr><tr><td>GFP-His</td><td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td><td></td><td>Proteins and peptide</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>V9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide, 30%, (Certified ACS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>IDR ヒトFBP17</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>国立衛生研究所</td><td>1.50d</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM 800とAiryscan</td><td>100x(N.A.1.4)オイル対物レンズ。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>10010240</td><td></td></tr><tr><td>ミニエクスツーダー&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (アバンティ ポーラー リピッズ インク)</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &mu;m</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝剤 生理食塩水 (PBS)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベース</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)架橋剤</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>クォーツナノチップ</td><td>東海県アルファクォーツプロダクツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッド DHPE: テキサスレッド 1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン, トリエチルアンモニウム ソルト</td><td>ライフテクノロジーズ Pte Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T1395MPピンセット</td><td>Gooi</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>超音波クリーナーElma</td><td></td><td>D-78224</td><td></td></tr><tr><td>Voterx</td><td>Scientific</td><td>IndustriesG560E</td><td></td></tr><tr><td>真空乾燥器</td><td>NUCERITE</td><td>5312</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Julabo</td><td>TW8</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

膜湾曲は、細胞移動、細胞分裂、小胞輸送など、細胞のさまざまな重要なプロセスにおいて重要な役割を果たします。それは細胞活動によって受動的に生成されるだけでなく、タンパク質相互作用を積極的に調節し、そして多くの細胞内シグナル伝達に関与している。したがって、タンパク質と脂質の分布とダイナミクスの調節における膜湾曲の役割を調べることは非常に価値があります。最近、 in vitroで湾曲膜とタンパク質との関係を研究するために多くの技術が開発されている。従来の技術と比較して、新しく開発されたナノバー支持脂質二重層(SLB)は、事前に定義された膜曲率と局所的なフラットコントロールを備えたナノバーのパターン化されたアレイ上に連続的な脂質二重層を形成することにより、膜湾曲生成におけるハイスループットとより良い精度の両方を提供します。脂質の流動性と湾曲した膜に対するタンパク質の感受性の両方を、蛍光顕微鏡イメージングを使用して定量的に特徴付けることができます。ここでは、ナノバーアレイを含む作製したガラス表面にSLBを形成する方法と、そのようなSLB上の曲率感受性タンパク質の特性評価に関する詳細な手順を紹介します。さらに、ナノチップの再利用と画像処理のためのプロトコルについても説明します。nanobar-SLB以外にも、このプロトコルは曲率センシング研究用のあらゆるタイプのナノ構造ガラスチップに容易に適用できます。

ナノバー設計は、ナノバー幅によって定義された曲率を持つ両端に半円を含み、中心に局所的に1つのフラット/ゼロ曲率コントロールを含む正の曲率感知タンパク質のプロービングに推奨されます(図2A、B)。ナノバー上でのSLBの形成に成功すると、図2Cに示すように、ナノバー表面全体に脂質マーカーシグナルが均等に分布します。複数のナノバーからの信号は、個々のナノバー画像を平均することによって組み合わせることができるため(図2D)、異なるナノバー間のランダムな変動を最小限に抑えることができます。以前の電子顕微鏡研究は、細胞原形質膜がナノ構造全体の周りにコンフォーマルコーティングを形成していることを示した24。したがって、合成脂質二重層は、同様にナノ構造表面にも強固に付着すると考えられ、図4Eで観察される...

ここでは、ナノバー支持脂質二重層システムが開発され、 in vitroで曲率感知能力を有するタンパク質の特性評価を可能にする、定義された曲率を有する合成膜を提供する。

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

このナノバー支持脂質二重層システムは、細胞活動中のタンパク質と脂質のダイナミクスと分布の調節における膜湾曲の役割を研究するために使用できます。この技術は、高分解能ナノファブリケーションによって事前定義された膜湾曲を有する特許ナノバーエラー上に連続脂質二重層を形成することにより、高いサブルートと膜曲率生成の悪いものの両方を提供します。まず、パターン側を上に向けて10ミリリットルのビーカーにナノチップを置きます。ビーカーに98%硫酸1ミリリットルを慎重に加え、酸がチップの表側と裏側を完全に覆っていることを確認します。ビーカーをゆっくりと回転させ、ビーカー全体が熱くなるまで200マイクロリットルの30%過酸化水素を一滴ずつ加えます。硫酸と過酸化水素がよく混合され、ナノチップから有機分子を除去するためのピラニア溶液が形成されていることを確認してください。ビーカーを二次ガラス容器に入れ、ナノチップをピラニア溶液に一晩浸して不純物を完全に洗浄します。ビーカーを取り出し、ピラニア溶液を酸廃棄物容器に慎重にピペットで入れます。5ミリリットルの脱イオン水をビーカーに入れて残留酸を希釈し、酸廃棄物に捨てます。この手順を 5 回繰り返します。ピンセットでチップをつかみ、脱イオン水の連続流で洗浄して、残留酸を完全に取り除きます。チップを99.9%窒素ガスでブロードライし、SLBを形成します。脂質混合物を30分間超音波処理する。脂質混合物を液体窒素中で20秒間凍結し、次いで水浴中で摂氏42度で2分間解凍する。凍結/解凍サイクルを30回繰り返します。その後、脂質混合物は透明な液体のように見えます。脂質混合物をミニ押出機に通し、前後に20回押し出します。反対側のシリンジからSUVを収集して、より大きな粒子や異物による汚染を減らし、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。洗浄したナノチップをピンセットで脱イオン水から丁寧に取り出し、99.9%窒素ガスでブロードライします。ナノチップの表面洗浄をエアプラズマ処理で1時間行う。ナノチップをPDMSチャンバーに組み立てます。パターンを上に向けてチップをきれいな表面に置くことから始めます。中央のPDMSをチップでそっと覆い、パターン全体が中央のPDMSの大きな楕円形の開口部の中央領域に露出していることを確認します。上部のPDMSを中央のPDMSで覆い、中央のPDMSの大きな楕円形の穴の領域内に2つの小さな穴を保ちます。次に、PDMSチャンバーが組み立てられます。上部PDMSの2つの小さな穴の1つからSUVをピペットでPDMSチャネルにロードし、室温で15分間インキュベートしてSLBを形成します。小さな穴の片側からPBSバッファーをPDMSチャネルにそっとピペットで入れ、もう一方の穴から綿棒で廃棄物を取り除き、バインドされていないSUVを洗い流します。次に、ナノチップ上に形成されたSLBを取得します。100 x オイル対物レンズを使用してレーザー走査型共焦点顕微鏡をセットアップします。Zenソフトウェアを開いて、脂質とタンパク質の蛍光を励起できる励起レーザーパワーを選択します。[取得モード] を選択します。次に、[スマートセットアップ]、[テキサスレッド]の順にクリックします。フォーカスノブでフォーカスを調整し、ナノバーの端が脂質チャネルの下で鋭くなるまでチップ上のナノバーを見つけます。スキャンパラメータを設定して、タンパク質を添加する前の脂質チャネルのコントロール画像を取得します。ランダムな単一ナノバー領域上で蛍光標識脂質二重層で漂白することにより、FRAPアッセイを実施します。[実験領域] チェック ボックスと [漂白] チェック ボックスをオンにします。中央にナノバー全体を含むことができる直径5マイクロメートルの円形領域を描き、実験領域に追加します。タイムラプスイメージングパラメータを入力します。[時系列] を選択します。次に、[期間]をクリックします。100サイクルと2秒の間隔を選択します。漂白パラメータを入力します。FRAP を実行するレーザー チェック ボックスをオンにし、出力を 100% に変更しますFRAP 実験の [実験の開始] をクリックします。タンパク質溶液をPDMSチャネルにロードし、室温で5分間インキュベートして、SLB上のタンパク質の結合を可能にします。ナノバーに再び焦点を合わせ、スキャンパラメータを設定して、タンパク質曲率検出用の脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方の画像を撮影します。実験領域を選択し、脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方でFRAPアッセイを実施し、タイムラプスイメージングを実行して曲率感知タンパク質の移動度を特徴付けます。どちらも、300ナノメートル幅のSLBコーティングされた個々のナノバーの端に蓄積の増加を示しています。ここで、SLBはタンパク質結合を静電的に増強するために10%PSを含んでいます。両方のタンパク質は、脂質よりも末端対中心比が高く、約1です。IDR FBP17とFバーを比較すると、IDR FBP17の高い端対中心比は、Fバーよりも曲率検出が強いことを示しています。3つのタンパク質はすべて、曲率が直径400ナノメートル未満で減少すると、ナノバー末端の湾曲した膜部位に優先的に蓄積を示しました。これら3つのタンパク質ドメインの中で、IDR FBP17は最高のナノバーと密度を示し、最も強い曲率感知能力を示し、F-Barは最も低い値を示します。タンパク質結合曲線は、IDR FBP17が強い協同曲率感知能力を有することを示すタンパク質濃度を徐々に増加させることによってプロットすることができる。ナノバーでの脂質シグナルの高速回復と比較して、F-Barは2分以内に回復することができず、湾曲した膜部位での膜移動度と会合ダイナミクスが大幅に低下していることが示唆されています。驚くべきことに、F-Barの挙動とは異なり、IDR FBP17信号は同じ時間枠内で明らかな回復を示し、湾曲した膜に蓄積されたIDR FBP17の動的な性質を示しています。しかし、溶液中の未結合のIDR FBP17を洗い流した後、IDR FBP17チャネルにおける以前の同様の回収率は観察できなかった。SLBの品質は、湾曲した膜とタンパク質の相互作用を研究する際に非常に重要です。したがって、膜の移動度を検証するために、実験ではFRAPテストが必要です。このシステムは、曲率感知ドメインや脂質組成など、湾曲膜とのタンパク質相互作用に影響を与えるさまざまなパラメータの研究や、顔面分離挙動などの湾曲膜の動的研究に役立ちます。

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Research

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Biochemistry

生物化学

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in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

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