in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

このナノバー支持脂質二重層システムは、細胞活動中のタンパク質と脂質のダイナミクスと分布の調節における膜湾曲の役割を研究するために使用できます。この技術は、高分解能ナノファブリケーションによって事前定義された膜湾曲を有する特許ナノバーエラー上に連続脂質二重層を形成することにより、高いサブルートと膜曲率生成の悪いものの両方を提供します。まず、パターン側を上に向けて10ミリリットルのビーカーにナノチップを置きます。

ビーカーに98%硫酸1ミリリットルを慎重に加え、酸がチップの表側と裏側を完全に覆っていることを確認します。ビーカーをゆっくりと回転させ、ビーカー全体が熱くなるまで200マイクロリットルの30%過酸化水素を一滴ずつ加えます。硫酸と過酸化水素がよく混合され、ナノチップから有機分子を除去するためのピラニア溶液が形成されていることを確認してください。

ビーカーを二次ガラス容器に入れ、ナノチップをピラニア溶液に一晩浸して不純物を完全に洗浄します。ビーカーを取り出し、ピラニア溶液を酸廃棄物容器に慎重にピペットで入れます。5ミリリットルの脱イオン水をビーカーに入れて残留酸を希釈し、酸廃棄物に捨てます。

この手順を 5 回繰り返します。ピンセットでチップをつかみ、脱イオン水の連続流で洗浄して、残留酸を完全に取り除きます。チップを99.9%窒素ガスでブロードライし、SLBを形成します。

脂質混合物を30分間超音波処理する。脂質混合物を液体窒素中で20秒間凍結し、次いで水浴中で摂氏42度で2分間解凍する。凍結/解凍サイクルを30回繰り返します。

その後、脂質混合物は透明な液体のように見えます。脂質混合物をミニ押出機に通し、前後に20回押し出します。反対側のシリンジからSUVを収集して、より大きな粒子や異物による汚染を減らし、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。

洗浄したナノチップをピンセットで脱イオン水から丁寧に取り出し、99.9%窒素ガスでブロードライします。ナノチップの表面洗浄をエアプラズマ処理で1時間行う。ナノチップをPDMSチャンバーに組み立てます。

パターンを上に向けてチップをきれいな表面に置くことから始めます。中央のPDMSをチップでそっと覆い、パターン全体が中央のPDMSの大きな楕円形の開口部の中央領域に露出していることを確認します。上部のPDMSを中央のPDMSで覆い、中央のPDMSの大きな楕円形の穴の領域内に2つの小さな穴を保ちます。

次に、PDMSチャンバーが組み立てられます。上部PDMSの2つの小さな穴の1つからSUVをピペットでPDMSチャネルにロードし、室温で15分間インキュベートしてSLBを形成します。小さな穴の片側からPBSバッファーをPDMSチャネルにそっとピペットで入れ、もう一方の穴から綿棒で廃棄物を取り除き、バインドされていないSUVを洗い流します。

次に、ナノチップ上に形成されたSLBを取得します。100 x オイル対物レンズを使用してレーザー走査型共焦点顕微鏡をセットアップします。Zenソフトウェアを開いて、脂質とタンパク質の蛍光を励起できる励起レーザーパワーを選択します。

[取得モード] を選択します。次に、[スマートセットアップ]、[テキサスレッド]の順にクリックします。フォーカスノブでフォーカスを調整し、ナノバーの端が脂質チャネルの下で鋭くなるまでチップ上のナノバーを見つけます。

スキャンパラメータを設定して、タンパク質を添加する前の脂質チャネルのコントロール画像を取得します。ランダムな単一ナノバー領域上で蛍光標識脂質二重層で漂白することにより、FRAPアッセイを実施します。[実験領域] チェック ボックスと [漂白] チェック ボックスをオンにします。

中央にナノバー全体を含むことができる直径5マイクロメートルの円形領域を描き、実験領域に追加します。タイムラプスイメージングパラメータを入力します。[時系列] を選択します。

次に、[期間]をクリックします。100サイクルと2秒の間隔を選択します。漂白パラメータを入力します。

FRAP を実行するレーザー チェック ボックスをオンにし、出力を 100% に変更しますFRAP 実験の [実験の開始] をクリックします。タンパク質溶液をPDMSチャネルにロードし、室温で5分間インキュベートして、SLB上のタンパク質の結合を可能にします。ナノバーに再び焦点を合わせ、スキャンパラメータを設定して、タンパク質曲率検出用の脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方の画像を撮影します。

実験領域を選択し、脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方でFRAPアッセイを実施し、タイムラプスイメージングを実行して曲率感知タンパク質の移動度を特徴付けます。どちらも、300ナノメートル幅のSLBコーティングされた個々のナノバーの端に蓄積の増加を示しています。ここで、SLBはタンパク質結合を静電的に増強するために10%PSを含んでいます。

両方のタンパク質は、脂質よりも末端対中心比が高く、約1です。IDR FBP17とFバーを比較すると、IDR FBP17の高い端対中心比は、Fバーよりも曲率検出が強いことを示しています。3つのタンパク質はすべて、曲率が直径400ナノメートル未満で減少すると、ナノバー末端の湾曲した膜部位に優先的に蓄積を示しました。

これら3つのタンパク質ドメインの中で、IDR FBP17は最高のナノバーと密度を示し、最も強い曲率感知能力を示し、F-Barは最も低い値を示します。タンパク質結合曲線は、IDR FBP17が強い協同曲率感知能力を有することを示すタンパク質濃度を徐々に増加させることによってプロットすることができる。ナノバーでの脂質シグナルの高速回復と比較して、F-Barは2分以内に回復することができず、湾曲した膜部位での膜移動度と会合ダイナミクスが大幅に低下していることが示唆されています。

驚くべきことに、F-Barの挙動とは異なり、IDR FBP17信号は同じ時間枠内で明らかな回復を示し、湾曲した膜に蓄積されたIDR FBP17の動的な性質を示しています。しかし、溶液中の未結合のIDR FBP17を洗い流した後、IDR FBP17チャネルにおける以前の同様の回収率は観察できなかった。SLBの品質は、湾曲した膜とタンパク質の相互作用を研究する際に非常に重要です。

したがって、膜の移動度を検証するために、実験ではFRAPテストが必要です。このシステムは、曲率感知ドメインや脂質組成など、湾曲膜とのタンパク質相互作用に影響を与えるさまざまなパラメータの研究や、顔面分離挙動などの湾曲膜の動的研究に役立ちます。