フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)
2022年8月17日
ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。
文献は、心筋B細胞の有病率に関する対照的なデータを報告しています。これはおそらく、灌流と消化技術のばらつきに起因しています。当社のプロトコルは、心筋B細胞の再現性のあるフローサイトメトリーベースの分析を可能にします。
この技術は、B細胞の回収率を最大化し、心臓サンプルからのB細胞および他の集団間のフローサイトメトリー数のばらつきを低減します。この最適化された消化および単離方法は、心臓のさまざまな免疫細胞タイプを研究するための拡張抗体パネルを実装するために簡単に変更できます。このプロトコルは、肺や肝臓などの他の臓器にも適用して、それらの臓器に関連するB細胞を研究することができます。
まず、12週齢のオスのマウスの体重を量ります。310 ccインスリン注射器に100マイクロリットルのB220抗体溶液をロードします。希釈したB220抗体を眼窩後注入で注入し、速やかに臓器摘出と灌流に進みます。
安楽死後、上腹部で鉗子でマウスの皮膚を保持します。ハサミを使って皮膚に2ミリメートルの開口部を作り、鉗子を使用して皮膚を剥がし、筋膜層を明らかにします。筋膜と腹膜を通して上腹部を切る。
止血鉗子を使用して剣状突起をクランプします。両側の中央鎖骨線の高さで胸壁を垂直に切り込み、前胸壁を持ち上げて縦隔の内容を明らかにします。鉗子を使用して大動脈を後ろからしっかりと保持します。
注射針を心臓の頂点に導入します。毎分3ミリリットルの速度で3ミリリットルのHBSSを灌流した。大動脈を切って心臓を取り除きます。
HBSSでペトリ皿の心臓を洗います。孤立した心臓の重さを量り、ミリグラム単位で体重を書き留めます。室温で心臓を刃で細かく刻みます。
ハートピースのサイズは約1.5ミリメートルでなければなりません。天びんを使用して心臓組織の質量を測定し、3ミリリットルのHBSSを入れた氷上の15ミリリットルのチューブに消化する60ミリグラムのミンチ心臓を置きます。B220抗体注射を受けなかったマウスに対してこのプロセスを繰り返し、3ミリリットルのHBSS標識参照対照組織を入れたチューブに入れます。
ミンチ組織を含む各チューブに酵素を追加します。DNase Iのミリグラムあたり0.5マイクロリットル、コラゲナーゼIIのミリグラムあたり1つの0.5マイクロリットル、およびヒアルロニダーゼのミリグラムあたり0.2マイクロリットルを追加します。消化反応をシェーカーに毎分300回転で30分間入れます。
チューブは、約25度の傾斜の小さな角度でシェーカーに配置されます。15ミリリットルの反応チューブのそれぞれに7ミリリットルのHBSSを加え、摂氏4度で5分間250Gで遠心分離します。上清をデカントした後、各ペレットを5ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁します。
室温で5分間インキュベートします。各チューブに10ミリリットルのPBSを加えた後、40マイクロメートルのストレーナーで50ミリリットルのチューブに混合してろ過します。シリンジプランジャーでフィルターの破片を粉砕し、すべての材料がフィルターを通過するようにします。
容量が心臓あたり25ミリリットルに達するまでフィルターを通してPBSを追加した後、参照対照組織チューブにさらに25ミリリットルのPBSを追加し、ボリュームを2つの異なるチューブに分割します。チューブの1つに染色されていないラベルを付け、もう1つに生/死んでいるラベルを付けます。摂氏4度で250 Gで5分間遠心分離した後、上清をデカントし、染色されていないチューブを100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、他の各ペレットを100マイクロリットルの生/死染色溶液に再懸濁します。
暗闇の中で30分間氷上でインキュベートします。各サンプルに500マイクロリットルのFACSバッファーを加えた後、40マイクロメートルのフィルターを通してFACSチューブに移します。FACSチューブを摂氏4度で5分間250Gで拒否し、上清を廃棄した後、ペレットを500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。
50マイクロリットルのFCブロッキング溶液を、染色されていないチューブと生きている/死んだチューブを除く各チューブに追加します。混合して5分間インキュベートします。染色されていないチューブと生/死のチューブを除く各チューブに50マイクロリットルの抗体混合溶液を加えた後、暗所で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
生/死んだ汚れと同様に、500マイクロリットルのFACSバッファーで再度洗浄し、300〜500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。計測器制御ソフトウェアを開きます。ウィンドウの上部で、[取得]タブを選択し、[新規]をクリックします。
ライブラリセクションの[フィルタリングするタイプ]フィールドに、PE、PerCP-Cy5.5、ブリリアントバイオレット421、Alexa Fluor 700、ゾンビアクアと入力し、フルオロ4を選択し、それぞれ入力した後に[追加]をクリックします。次に、[次へ] をクリックして [グループ] タブに進みます。次に、チューブ付きのシンボルをクリックして、分析用のハートを追加します。
参照グループをクリックすると、ウィンドウが表示されます。蛍光タグ列で、蛍光タグとしてゾンビアクアを選択し、それぞれの横にあるゴミ箱の赤いアイコンをクリックして他のタグを削除します。次に、[コントロールの種類] アイコンで [セル] を選択します。
次に、[保存] をクリックします。[次へ] をクリックします。次に、[マーカー] タブをクリックします。
テーブルが表示されます。各 fluoro-4 列の最初の行に対応するセルマーカーを入力し、Enter キーを押します。 [次へ] を 2 回クリックして、[取得] タブに移動します。
実験サンプルの記録するイベントに「1,000万」と入力し、参照グループ行の同じフィールドに「200, 000」と入力します。「保存して開く」をクリックします。左下の[計測器制御]をクリックします。
電圧をFSC 50、SSC 175、SSC-B 175に設定します。[取得コントロール]を選択します。流量オプションの場合は、ドロップダウンメニューから[高]を選択します。
染色されていない心臓チューブをボルテックスし、サンプル注入ポートにしっかりと置きます。緑色のインジケータ矢印が正しいサンプルを指していることを確認します。次に、[記録] をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。
生きている/死んだ染色された心臓組織についても同じことを行います。[アンミックス]メニューを選択し、コントロールを設定します。蛍光タグとしての自家蛍光のチェックボックスを選択します。
次に、[次へ]をクリックして、[ポジティブ/ネガティブ母集団の識別]タブに進みます。このタブには、前方散乱領域と側方散乱領域のプロットが表示されます。多角形のポイントをクリックしてドラッグし、前方散乱領域軸で 100 万から 400 万、側面散布領域軸で 0.2 から 300 万の領域を選択します。
右の次のプロットでは、V5-AがX軸に表示されます。ゲートを移動して、右端のピークの半分を正として選択し、プロットの左側の領域を負として選択します。参照グループ - 染色されていないというタイトルのプロットで、同様の範囲の母集団を選択します。
染色されていないものについては、ポジティブ/ネガティブを選択しないでください。「ライブアンミキシング」ボタンをクリックします。次に、実験サンプルを取得し、チューブをボルテックスして、SIPにしっかりと置きます。
緑色のインジケータ矢印が正しいサンプルを指していることを確認します。次に、サイトメーターソフトウェアの画像取り込みコントロールパネルで[記録]をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。デフォルトの混合されていないワークシートタブを選択します。
上部のドットプロットツールを使用して、FCS-A対SSC-Aプロットを作成します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 軸で 40 万を超えるイベント、SSC-A 軸で 80 万を超えるイベントを選択します。選択をダブルクリックして新しいプロットを作成し、この新しいプロットでY軸ラベルを右クリックして、ライブ/デッドステインを選択します。
X軸ラベルを右クリックして、自家蛍光A.ライブ/デッド軸の10未満から5番目のすべてのイベントを選択します。これらは生細胞です。この選択をダブルクリックします。
新しいプロットで、X軸にPerCP-Cy5.5Aを選択し、Y軸にSSC-Aを選択します。PerCP-Cy5.5Aの右側の母集団を選択します。これらは免疫細胞です。
選択をダブルクリックします。新しいプロットで、X軸にFSC-Aを選択し、Y軸に前方散乱高さを選択します。FSC-A値とSSC-A値が同じトレンドに従うイベントを選択します。
これにより、単一セルが選択され、ダブレットが排除されます。この選択をダブルクリックすると、CD45陽性の単一細胞集団の新しいプロットが表示されます。CD45陽性の単一細胞集団プロットから、X軸のブリリアントバイオレット421とY軸のSSC-Aを選択します。
鮮やかな紫色の 421 軸の右側の人口を選択します。これがB細胞集団です。この母集団を2回ダブルクリックすると、B細胞母集団で2つの新しいプロットが作成されます。
X軸にPEAを、Y軸にブリリアントバイオレット421Aを使用して、最初のB細胞プロットを設定します。右側の集団は血管間B細胞に対応し、左側の集団は間質性B細胞を表します。両方を選択します。
Alexa Fluor 700AをX軸に、SSC-AをY軸にして2番目のB細胞プロットを設定します。左側の集団はCD11b陰性細胞に対応し、右側のイベントはCD11b陽性細胞に対応します。各セクションを右クリックし、[ゲートのプロパティ] をクリックします。
[カウント] と [親] をクリックして、イベントの数と親母集団の割合を表示します。さらにデータ分析するために、イベントの数とパーセンテージを記録します。ナイーブな無傷の心臓のダブレットを除去した後、CD45陽性細胞の約20%がCD19陽性B細胞になると予想されています。
これらの細胞のうち、平均して5.5%間質腔に位置しています。94.5%は血管内腔にあります。心臓に見られるB細胞集団全体のうち、表面マーカーCD11bに基づくB1細胞に対応するのは約1.6%のみであり、残りの98.4%はB2細胞に対応します。
フローサイトメトリーで心筋B細胞を分析する場合、プロトコルに従って心臓を適切に灌流およびミンチすることが重要です。消化された心臓の適切なろ過も、免疫細胞の回復を最大化するために不可欠です。
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概要
本記事では、フローサイトメトリーを用いた心筋Bリンパ球の定量および分化に関するプロトコルを紹介します。本手法により、心臓サンプルからのB細胞の回収率が向上し、細胞数のばらつきが最小限に抑えられます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 循環器学
- フローサイトメトリー
背景
- 心筋におけるB細胞の浸潤率に関しては、相反するデータが存在します。
- 灌流および消化手法のばらつきが、この不整合の一因となっています。
- 心臓内の免疫細胞を正確に解析するためには、最適化された手法が必要です。
- 本プロトコルは、他の臓器にも応用可能です。
研究の目的
- 心筋B細胞を解析するための再現性のある手法を提供すること。
- 心臓サンプルからのB細胞の回収率を向上させること。
- フローサイトメトリーによるカウントのばらつきを低減すること。
使用した手法
- B細胞の定量および分化のためのフローサイトメトリー。
- 最適化された消化および単離技術。
- さまざまな免疫細胞種を研究するための拡張抗体パネル。
- 肺や肝臓などの他の臓器へのプロトコルの適用。
主要な結果
- 心筋B細胞の回収率の向上。
- B細胞におけるフローサイトメトリー計数間のばらつきの低減。
- 同様の研究を行う他の臓器へのプロトコルの適用可能性。
- 免疫学研究におけるより幅広い応用への可能性。
結論
- 本プロトコルは、心筋B細胞を研究するための信頼性の高い手法を提供します。
- これにより、B細胞の存在率に関するデータに見られた従来の不一致が解消されます。
- 他の臓器への適応が可能であるため、研究における有用性が拡大します。
よくある質問
産業上の実用性
心筋B細胞の信頼性の高い定量は、初期の免疫学および循環器学の創薬プログラムにおけるリスク低減に不可欠です。このフローサイトメトリーに基づくプロトコルは、細胞回収と分析を標準化することでばらつきを抑え、研究間での比較可能性を可能にします。調和された免疫細胞プロファイリングは、確実なターゲットバリデーションをサポートし、心血管および免疫炎症パイプラインにおけるトランスレーショナルリサーチ戦略に情報を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 仮説検証のための心筋B細胞集団の堅牢な定量化を可能にします。
- 血管内B細胞と間質B細胞を区別することで、機能的ターゲットのバリデーションをサポートします。
- 灌流および消化のばらつきを制御することで、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 再現性のある免疫細胞存在率データを提供することで、ポートフォリオの優先順位付けを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続のフローサイトメトリーアッセイに向けて、検証済みの単一細胞懸濁液を調製する。
- サンプル調製を標準化し、実験間およびチーム間での再現性を確保する。
- 拡張抗体パネルを用いた、定量的かつマルチパラメータな免疫プロファイリングを可能にする。
- 心臓組織における免疫細胞ダイナミクスのスケーラブルなスクリーニングを支援する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 免疫細胞の定量解析を、疾患に関連する心臓モデルに適合させます。
- 免疫標的の探索から前臨床検証までの継続性を確保します。
- 調和された免疫プロファイリングに基づき、リスク調整後の進展判断を可能にします。
- 他の臓器への適応をサポートし、より幅広いトランスレーショナルな応用を実現します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、心臓組織およびその他の組織における免疫細胞の標準化された定量化を可能にすることで、発見から前臨床に至る連続的な研究プロセスに統合されます。
- 探索生物学：B細胞サブセットを定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：組織サンプルにおける免疫細胞の存在比について、再現性のある定量的なデータを提供します。
- アナリティクス：異なる条件下での免疫細胞集団を比較するための統計的出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床心臓モデルにおけるバイオマーカーの整合性と連続性を促進します。
- エンタープライズ再利用：複数の臓器系や研究プログラムにおける免疫プロファイリングに適応可能なプロトコルです。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫細胞定量における予測の信頼性を高め、生物学的変動を低減する。
- 運用上の価値：再現性を確保するため、サンプル調製およびフローサイトメトリーのワークフローを標準化する。
- 戦略的価値：十分な情報に基づいたGo/No-go判断を可能にし、後段階での生物学的リスクを軽減する。
- ポートフォリオへの影響：免疫細胞研究におけるリスク調整後の優先順位付けおよびプログラム間での比較可能性をサポートする。
実施上の検討事項
- フローサイトメトリーおよび免疫細胞のゲーティング戦略に関する専門知識が必要です。
- マルチパラメーターフローサイトメーターおよび検証済みの抗体パネルへのアクセスが必要です。
- 灌流および消化工程について、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 必要に応じてプロトコルを修正することで、異なる臓器系にも適応可能です。
- 細胞回収率とデータ品質を最大化するため、精密なサンプルハンドリングが不可欠です。
