Name: マイクロ透析プロファイラーを用いた酸素-無酸素土壌-水界面での溶存溶質サンプリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学ぶマイクロ透析プロファイラーの構築と操作方法。ナノ膜チューブとPTFEパイプを用いて酸素-無酸素土壌-水界面での溶存溶質サンプリングを実現し、土壌化学動態のリアルタイムモニタリングに貢献します。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(41977320、41571305)とXJTLUのキープログラム特別基金(KSF-A-20)によって資金提供されています。

1.個々のマイクロダイアリシスサンプラーの準備
<ol><li>手付かずのナノメンブレンチューブ(内径×外径×長さ1.0mm×1.7mm)を合計33本の短チューブ(長さ58mm)に正確に切断します。</li>
	<li>セラミックナイフでPTFEパイプを66本のパイプ(長さ180 mm)に正確に切断します。 注意: 汚染を避けるために、金属ベースのナイフは使用しないでください。</li>
	<li>清潔なプラスチックプレートに2液性(AB)エポキシ接着剤を完全に混合し、粘着性になるまで30分間放置します。ABエポキシ接着剤をPTFEパイプの上部の外面に慎重に塗布します。ABエポキシ接着剤がチューブの長さ4mmのみをカバーし、追加の接着剤ブロッキングチューブがないことを確認してください。</li>
	<li>PTFEパイプをナノメンブレンチューブにそっとねじ込んで、ステップ1.2〜1.4で準備した2本のPTFEパイプをステップ1.1で準備した各ナノメンブレンチューブに接続します。 注意: 余分な接着剤がジョイントに蓄積しないようにしてください。接着剤がナノメンブレンチューブを汚染していないことを確認してください。</li>
	<li>手順1.4を繰り返して、33台の手付かずのマイクロダイアリシスサンプラーをすべて完全に組み立てます。</li>
	<li>ステップ1.6で組み立てたサンプラーを一晩放置して、接着剤の完全な硬化と安定化を確実にします。</li>
	<li>親水性を高め、マイクロ透析サンプラーをエタノール(純度99.5%)に1時間浸した後、2%希釈HNO3 と超純水で超音波洗浄(室温)をそれぞれ15分間洗浄します。</li>
	<li>5 mLシリンジを使用して水中でバブリングすることにより、マイクロ透析サンプラーの開存性と気密性を確認します。</li>
</ol>2. マイクロダイアリシスプロファイラーの組み立て
<ol><li>添付のCADファイル(補足ファイル1)を使用して、ナイロン素材を使用して事前に設計されたスケルトンを印刷します(図1C-2)。</li>
	<li>スケルトンサイズに合わせて、2つの平行スロット(5 cm間隔)を備えたPVC容器(酸洗浄)をくり抜きます。スロットには、3Dプリンターの彫刻モジュールを使用します。</li>
	<li>50 mL遠心管のキャップ形状のエポキシ接着剤を安定化させることにより、1対多のコネクタを構築します。硬化前に33個のシリコンキャップ(長さ1cm)をエポキシ接着剤に挿入し、一晩放置します。</li>
	<li>チューブキャップから1対多コネクタを取り出します。</li>
	<li>セラミックナイフを使用して硬化エポキシ接着剤を切断し、シリコンキャップのすべての端が遮られないようにします。</li>
	<li>1対多のコネクタを2%希釈したHNO3 と超純水でそれぞれ15分間完全にすすぎます。周囲条件下で1対多コネクタを乾燥させます。</li>
	<li>三方弁をチューブの底に接続して、緩衝容器として機能します。</li>
	<li>ABエポキシ接着剤を使用して50 mL遠沈管に1対多のコネクタを取り付けて、緩衝容器を組み立てます。</li>
	<li>セクション1で準備した個々のマイクロ透析サンプラーをスケルトンに組み立てます(ステップ2.1)。このステップでは、ホットメルト接着剤を使用して、各サンプラーがスケルトンの上/下端に平行になるように固定します。</li>
	<li>すべての微小透析サンプラー(n = 33)がスケルトンに取り付けられるまで、手順2.9を繰り返します。</li>
	<li>スケルトンの両側にある33個のサンプラーがPVCスロットを通過することを確認します。スケルトンとスロットの接合部の隙間をABエポキシ接着剤でシールします。</li>
	<li>スケルトンの片側にある33個のサンプラーを、50 mLの遠心チューブにあらかじめ取り付けられた1対多の接続バルブ を介して 気密に接続してバッファリングコンテナに接続します(ステップ2.8)</li>
	<li>水(18.3MΩ)をあらかじめ充填した医療用輸液バッグを三方弁を介してバッファーコンテナに接続します。</li>
	<li>シリコンキャップを使用して、サンプリング側の33個のサンプラーを閉じます。三方弁を回して各マイクロ透析サンプラーの開存性と気密性を再確認し、医療用輸液バッグからサンプラーに水が流れるようにします。すべてのチェックが完了したら、バッファリングコンテナのすべてのサンプラーとバルブを閉じてオフにします。</li>
</ol>3.土壌インキュベーション
<ol><li>浸水した土壌をインキュベーションする前に、医療用輸液バッグ内の水を脱気して酸素を除去します。高純度窒素ガスの経路で一晩窒素ガスを医療用輸液バッグに気泡化する(図1-C8)。</li>
	<li>三方弁を使用して、プロファイラーと脱気バッグの間の接続を閉じます。</li>
	<li>ふるいにかけた風乾土壌(粒子サイズ<2 mm)450 gをPVC容器に注意深く加え、5つのマイクロ透析サンプラーを土壌表面の上に残します。</li>
	<li>ティッシュで土の表面を覆い、その上に超純水(18.3MΩ)を流し込んで湛水させます。土壌が土壌表面から5 cm上まで完全に浸水したら、組織を取り除きます。</li>
	<li>土壌孵化が初期化されたらすぐに、プリロードされた溶液でシステムをパージします。嫌気性バッグと透析サンプラーの接続をオンにして、サンプリング・システムをフラッシュします。各サンプラーを水でパージするときは、サンプラーの総容量の10倍を使用してください。</li>
	<li>1つのサンプラーのパージが終了したら、清潔なシリコンキャップを使用してキャップをします。</li>
	<li>すべてのサンプラーがパージされるまで、手順 3.6 を繰り返します。この時点で、1つの浸水土壌インキュベーションおよびサンプリングシステムが確立されます。</li>
	<li>嫌気性バッグを水面の高さに調整します。</li>
	<li>すべてのチューブが水で満たされていることを確認してください。そうでない場合は、キャップを外し、チューブの上部を下げて、嫌気性バッグから水が流出できるようにします。</li>
	<li>すべてのキャップとバルブを閉じます。</li>
	<li>7日間のインキュベーション中に嫌気性バッグと透析サンプラーの間の接続をオフにします。</li>
</ol>4. マイクロダイアリシスプロファイラーサンプリング
<ol><li>サンプリングする前に、土壌容器、サンプリングトップ、嫌気性バッグの水位を同じ高さに調整して、著しく異なる水ポテンシャルを回避します。土壌孵卵期間中は常にこの慣行を維持してください。</li>
	<li>嫌気性バッグとバッファー容器の間の接続をオンにします。</li>
	<li>最初のサンプラーのキャップを上から下に取り外します。</li>
	<li>ピペットを使用して、サンプラーから133 μLを、保存のために133 μLの2%HNO3 がプリロードされたバイアル(0.6 mL)に正確に吸引します。</li>
	<li>サンプリングプロセス中、嫌気性バッグの観察チャンバー(図1A-9)内の微小透析サンプラーに向かう水滴のゆっくりとした均一な流れを観察します。</li>
	<li>シリコンキャップでチューブトップを閉じます。次のサンプリングチューブに移動します。 注:鉄Feなどの酸化還元に敏感な元素の分析には、脱気(10 mM)EDTA溶液などの別の保存方法を使用し、窒素パージ条件下でサンプリングを実行する必要があります。</li>
	<li>33個のサンプルがすべて収集されるまで、手順4.6を繰り返します。嫌気性バッグとバッファー容器の間の接続をオフにします。 注意: サンプリングは通常15分で完了できます。現在の設計では、チューブ間の相互汚染を避けるために、サンプリングは毎日実行されます。チューブに沿った溶質拡散は遅いですが、バッファー容器に拡散し、他のチューブを汚染します。</li>
	<li>6日目のサンプリングの直後に、土壌表面に乱れを引き起こす浸水した水を補充します。</li>
	<li>間隙水サンプルが移送される前後のサンプルバイアルを計量することにより、サンプル体積回収率を計算します。</li>
	<li>誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を使用して、間隙水中の元素の総溶解濃度を測定します。 注:濃度定量には外部標準曲線を使用し、ICP-MSの動作安定性のモニタリングには内部標準Rhを使用しました。</li>
</ol>

<ol><li>Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+oxic-anoxic+interface%3A+Microbial+activities+and+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life at the oxic-anoxic interface: Microbial activities and adaptations.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 691-710 (2000).</li>
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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

以前の実験と実践2に基づいて、いくつかの考慮事項は、マイクロ透析プロファイラーの組み立てと間隙水のサンプリング中に特別な注意を必要とします。まず、ナノメンブレンチューブと接続チューブを慎重に接続して、接続時の詰まりや漏れを防ぐ必要があります。土壌が浸水条件下でインキュベートされると、酸素の導入は急速に酸化し、透析チューブ内の第一鉄を沈殿させます(図4)。このため、微小透析プロファイラーを組み立てる前に、各微小透析チューブの完全性(損傷なし)、接続部の気密性、およびチューブの開通性を確認する必要があります。同様に、インキュベーション容器の側壁への支持フレームの接続は、漏れを避けるために慎重に行われる必要がある。正式な実験の前に、さまざまな接続場所での漏れチェックが常に優先事項です。第二に、嫌気性バッグ内の灌流液は適切に脱酸素化されなければならない。そうしないと、間隙水中の第一鉄が灌流液中の酸素と反応して不溶性の沈殿物を形成します(図4)。これにより、溶質の種分化と濃度、およびナノメンブレンチューブへの拡散プロセスが大幅に変化します。第三に、サンプリング頻度が低い(数日と数週間)と、溶質がバッファー領域に拡散します。これにより、プロファイルサンプル全体が汚染される可能性があります。この問題に対処するために、3つの可能な解決策を検討することができます:(1)1日1回などの高頻度でのサンプリング(ただし、複数のサンプリングを実行すると、透析サンプラーの近くで溶質が枯渇する可能性があります)。(2)必要に応じて射出領域内の接続管の長さを延長するステップと、(3)サンプリングパイプラインを再設計して、単一のパイプラインの単一制御を実現します。これらは、将来のデバイスの改善の方向性でもあります。第四に、サンプリングプロセス中、水圧のバランスをとるために、嫌気性バッグ、浸水土壌、およびサンプリングパイプ内の水面のレベルがほぼ同じ高さにあることを確認する必要があります。そうしないと、メンブレンチューブの内側と外側の水電位差により、溶質拡散が減少または増加します。
制限 第1に、微小透析プロファイラーは市販されていないため、この方法はデバイスの調製の点で時間がかかるままである。1本の透析チューブを準備するのに、サポートスケルトンの印刷、デバイスの組み立て、クリーニングなど、数日かかりました。しかし、その後の再利用可能な機能は、このギャップを完全に埋めます。第二に、浸水していない土壌シナリオにデバイスを適用することには特定の制限があり、のぞき見は18に使用できます。乾燥土壌ではメンブレンチューブの内側と外側の間に大きな水ポテンシャル差があるため、プリロードされた溶液は拡散損失を経験します。実際、予備試験では10%〜36%の範囲のさまざまなサンプリングボリュームの回復が観察され(詳細なデータは示されていません)、結果について不確実性が生じます。
この方法と既存または代替方法の比較 この方法は、既存のパッシブサンプラーが繰り返しサンプリングできないという事実に部分的に対処し、特に無酸素間隙水のサンプリングと保存のためのサンプル調製の作業負荷を最小限に抑えます2。透析された溶質の濃度とスペシエーションの瞬間的な変化は、あらゆる環境障害に対する酸素-無酸素界面の応答を敏感に反映することができます。理論的には、分、数時間、または数日の頻度でサンプリングすることで、インターフェースで急速に変化するプロセスをキャプチャできます。数日間展開する必要があるパッシブサンプラーの場合、いくつかのホットな瞬間とホットスポットを見逃す可能性があります6,19。
環境科学における重要性と潜在的な応用 このアプローチは、例えば、特定のEh-pH条件下での生物地球化学的プロセスのホットモーメントとホットスポットを見つけるために、酸素-無酸素界面での生物地球化学研究を前進させる可能性があります。酸化還元プロセスは生命活動の基本的なプロセスです1.特に微生物は、最適な生活環境条件を必要とし、環境撹乱に非常に敏感です1。これは、不均一な環境における微生物群集と生物地球化学的プロセスの非常にダイナミックな発展をもたらします20。直接サンプリングは、高い不均一性を考慮することなく、様々な環境条件から混合試料を得る傾向がある。これは、測定された化学情報と主要な微生物20との間にミスマッチを引き起こす。典型的な氾濫水田の土壌または堆積物の表層から数センチメートル以内には、急峻な酸化還元勾配、およびさまざまな物理的、化学的21、および生物学的勾配があります1。テクノロジーは、ミリメートルスケールの生物地球化学的シグナルをキャプチャできなければなりません。そうしないと、実際の縮尺と一致しないデータがあいまいな結論につながる可能性があります。マイクロ透析プロファイラーは、土壌と水の界面でのミリメートルスケールの生化学的シグナルを、最小限の妨害で数日または数時間で監視することができます。本研究では、48時間にわたる異なる元素の時空間ダイナミクスが観察され、おそらく水分補給の乱れに関連している。したがって、マイクロダイアリシスプロファイラーのより広範なアプリケーションは、変化する世界の主要な生物地球化学的プロセスに障害がどのように影響するかを理解するのに役立つ可能性があります。

酸素-無酸素界面は、生物地球化学的サイクルに不可欠な生物圏の一般的な特徴の1つです1。この界面は非常に不均一であり、空間範囲は堆積物/土壌-水界面のミリメートル1,2から海洋無酸素帯3,4の数千メートルに及ぶ。このインターフェースは、元素生物地球化学の複雑さを研究するための理想的な生息地です。
土壌-水界面は、センチメートル以内の典型的な酸素-無酸素勾配の特徴を持ち、メソコスム実験で容易に確立されます。地表水からの分子状酸素の消費から始めて、成層化された機能微生物群集は、ミリメートルスケール1でO2、pH、Eh勾配などのさまざまな勾配の発達を促進します。酸素-無酸素界面での生物地球化学的循環は、自然界のさまざまな擾乱に敏感です5,6。土砂や水田の場合、ゴミやわらなどの新鮮な有機物の投入、周期的な洪水や排水、気温の変動や極端な現象、生物乱流は、酸素-無酸素界面での生物地球化学的循環に変化を引き起こし、温室効果ガスの排出、富栄養化、特定の場所での汚染などの永続的な影響をもたらす可能性があります。したがって、土壌-水界面における酸素-無酸素勾配は、地球規模の大規模な生物地球化学的サイクルの研究のための窓を提供します。土壌-水界面に沿った溶存物質の高分解能での時空間サンプリングと分析は常に興味深いものでした。しかし、方法論の進歩は限られています。
破壊的な間隙水抽出の欠点を回避するために、間隙水化学の変化を回避し、サンプル調製の複雑さに対処するために、非破壊パッシブサンプリングがますます使用されています7。in situ透析サンプラー(ピーパーとして知られる)8、薄膜拡散平衡化(DET)9、薄膜拡散勾配(DGT)10など、高精度のin situサンプリング(マイクロメートルからセンチメートルスケール)を実行できるいくつかのデバイスが広く使用されています。溶解した物質は、拡散および吸着プロセスのメカニズムを介して受動的にサンプリングされます。それらは酸素-無酸素化学プロファイルを記述するのに有用であることが証明されていますが、それらはまだ使い捨てであり、それはそれらのより広い用途を制限します。
最近、マイクロダイアリシス技術は、土壌中の可溶性化合物の動態を数分から11、12、13、14日の時間スケールで監視するために使用できる高感度ツールとして登場しました。医学および環境科学における微小透析を使用する典型的なシナリオでは、半透性管状膜からなる小型の同心型プローブ(すなわち、マイクロダイアライザー)を使用して、間質液または土壌溶液をプローブし、代謝プロセスおよび化学的スペシエーションの重大な障害を防止する15,16。マイクロダイアリシスの最大の本質的な利点の1つは、土壌または生物学的組織における時間依存的な濃度変化のin situキャプチャです15,16。
マイクロ透析のコンセプトに基づき、濃度勾配拡散の原理に基づいて間隙溶質の連続平衡透析を行うことができる、より使いやすいマイクロ透析プロファイラー(以前は統合間隙水注入(IPI)プロファイラーと呼ばれていました2)を開発しました。マイクロダイアリシス装置は、灌流液の能動的プリロードと溶解溶質の受動拡散に中空ナノメンブレンチューブを使用し、ピーパー、Rhizonサンプラーなどの圧力フィルター、および蓄積ベースのDGTで使用されるバルク細孔水拡散とは異なります。この装置は、高地土壌と浸水土壌の両方でカチオン性元素と陰イオン性元素の両方の時間的および空間的サンプリングでテストおよび検証されています(図1A-1)13,15,16。シンプルなポンプインおよびアウトマイクロ透析により、サンプル調製のステップ数が最小限に抑えられます2,15。
我々は、1次元支持骨格上にサンプラーを一体化して微小透析プロファイラーを作製し、土壌-水界面および根圏2,15,17で高分解能サンプリングを実現した。本研究では、下流の元素分析のための外乱を最小限に抑えながら、土壌-水界面(垂直深さ60 mm)で33の間隙水サンプルを収集できるように、サンプリング装置とサンプリング方法を大幅に変更しました。サンプリング手順全体にかかる時間は~15分です。マイクロダイアリシスプロファイラーは環境科学のコミュニティにとって新しいものであるため、土壌-水界面での化学シグナルの変化を監視する上でのマイクロダイアリシスの可能性を示すために、デバイスコンポーネントとサンプリング手順の詳細を提示します。
マイクロダイアリシスプロファイラーの説明 マイクロ透析プロファイラー装置を、以前の設計2を適切に変更して、図1に示します。ナノメンブレンの有効孔径(図1C-1)は、大きな分子や微生物細胞の拡散を防ぐために、わずか数ナノメートルと推定されています。以前の試験では、6ヶ月間の浸水インキュベーションでは、管表面の内側または外側のいずれにも鉄の堆積物は生じないことが示唆された15。湾曲した中空のスケルトンを設計し(図1C-2)、安定したナイロン素材を使用して3Dプリントしました。マッチングポリテトラフルオロエチレン(PTFE)パイプ(長さ:18 cm x 直径2 cm図1C-1)で接続された合計33本のナノメンブレンチューブ(ポリエーテルスルホン、表面孔径:0-20 nm、内径x外径x有効サンプリング長:1.0 mm x 1.7 mm x 54 mm、理論容量:42.4 μL)をスケルトンとPVC容器の片側に設置しました(図1B)。このデバイスの場合、サンプリングコンポーネント(図1B-1)はPVCコンテナの側壁から2cm離れています。注入側(図1B-4)では、すべてのチューブを1対多のコネクタに接続し、緩衝容器に気密に固定しました(図1B-7)。医療用輸液バッグ(図1B-11)を使用して、三方弁で緩衝容器と接続しました。システムの気密性は、さらなる実験操作の前に水中で注意深く調べられました。医療用輸液バッグ内のプリロードされた水(18.2 MΩ、500 mL)は常に無酸素です(図1C-8)。詳細な装置設定と間隙水サンプリングは以下の通りである。

<table><tbody><tr><td>3Dプリンター</td><td>Snapmaker、米国</td><td>Snapmaker 2.0</td><td>&nbsp;モデル: A250</td></tr><tr><td>3M DP190 スコッチウェルド グレー</td><td>&nbsp;3M 米国</td><td>489-483</td><td>グレー</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>タイタン、中国</td><td>SWLX-JZ050-ZX</td><td>50 mL、滅菌済み DNASE/RNASE/プロテアーゼ/パイロジェン フリー</td></tr><tr><td>セラミック ナイフ</td><td>R felngli、中国</td><td>NA</td><td>全般</td></tr><tr><td>EDTAフリー酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 60-00-4</td><td>Sigma-Aldrich#EDS-1KG</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Adamas</td><td>CAS 64-17-5</td><td>水 &le; 50 ppm (K.F.による), 99.5%, SafeDry, モレキュラーシーブ付き, Safeseal</td></tr><tr><td>ホットメルト接着剤&nbsp;</td><td>マジックドラゴン、中国</td><td>N.A.</td><td>JTWJRRJB001</td></tr><tr><td>誘導結合プラズマ質量分析&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Inc., Shelton, CT USA</td><td>N.A.</td><td>モデル:NexION 350X</td></tr><tr><td>医療用輸液バッグ&nbsp;</td><td>Hunan Kanglilai Medical Equipment Co., Ltd</td><td>N.A.</td> (湖南康里来医療機器有限公司)<td>250 ml、滅菌済み</td></tr><tr><td>Milli-Q water system</td><td>Mingche, Inc., China</td><td>N.A.</td> (ミリQ水道システム)<td>18.3 M&Omega;、浄水システムモデル:24UV</td></tr><tr><td>ナノメンブレンチューブ(ポリエーテルスルホン)</td><td>Motimo Membrane Technology Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>N.A.</td><td>ポリエーテルスルホン、内径1 mm、細孔サイズ<20 nm、エタノール(99.5%)で前処理</td></tr> <tr><td>窒素ガス</td><td>Suzhou Gas, Chuina</td><td>N.A.</td><td>高純度</td></tr><tr><td>ニトロティック酸(濃縮)</td><td>Adamas</td><td>CAS 7697-37-2</td><td>69%、シングルメタル< 50 ppt、PFAボトル</td></tr><tr><td>ナイロン繊維</td><td>スミエティ</td><td>10052076600273</td><td>3Dプリント</td></tr><tr><td>ピペット用&nbsp;</td><td>ボンド A3 ピペット</td><td>N.A.</td><td>200 &mu;L</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Titan</td><td>T2-H-T0200</td><td>200 &mu;L、300 &mu;L チップボックス 非滅菌|200 &mu;L|Titan</td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene Tube</td><td>ROHS, China</td><td>CJ-TTL</td><td>Out diameter 1 mm</td></tr><tr><td>Sample vial</td><td>Titan, China</td><td>EP0060-B-N</td><td>0.6 mL, Sterilized DNASE/RNASE/Protease/Pyrogen Free</td></tr><tr><td>Silicon cap</td><td>Fuchenxiangsu, China</td><td>N.A.</td><td>内径1mm、長さ1cm</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>エルマ</td><td>N.A.</td><td>モデル:E120H</td></tr><tr><td>スクエアPVCウォーターパイプ</td><td>Taobao.com</td><td>N.A.</td><td>高さx幅、12 cm x 15 cm</td></tr><tr><td>輸液OEM用三方弁</td><td>、中国</td><td>N.A.</td><td>医療レベル;バルブ本体:PC素材;バルブコア:PE素材;スクリューキャップ:ABS素材</td></tr></tbody></table>

マイクロ透析プロファイラーを用いた酸素-無酸素土壌-水界面での溶存溶質サンプリング

Dissolved Solute Sampling Across an Oxic-Anoxic Soil-Water Interface Using Microdialysis Profilers

生物地球化学的プロセスは、擾乱に応答して、酸素-無酸素界面で空間的(ミリメートルスケール)と時間的(時間スケールから日スケール)の両方の次元で急速にシフトします。急速な生物地球化学的変化を解読するには、高い空間的および時間的サンプリング分解能を備えたin situの低侵襲ツールが必要です。ただし、利用可能なパッシブサンプリングデバイスは、使い捨ての性質や、サンプル調製の複雑さと作業負荷の多さのいずれかのために、多くの場合あまり役に立ちません。
この問題に対処するために、33本の個別のポリエーテルスルホンナノメンブレンチューブ(半透性、<20 nmの孔径)を1次元骨格(60 mm)に集積したマイクロ透析プロファイラーを確立し、間隙水中の溶解化合物を土壌-水界面全体で1.8 mm(外径プラス1間隔、つまりプローブ間0.1 mm)の高解像度で繰り返しサンプリングしました。サンプリングメカニズムは、濃度勾配拡散の原理に基づいています。脱気水の自動ローディングにより、酸素-無酸素界面全体の化学種への妨害を最小限に抑えることができます。
この論文では、毎日の土壌-水界面でのデバイスセットアップと連続間隙水サンプリングの手順について説明します。濃度-深度プロファイルは、灌漑によって引き起こされる外乱の前(6日目)と後(7日目)に選択的に測定されました。.結果は、特に酸化還元感受性元素(すなわち、鉄およびヒ素)について、濃度-深さプロファイルが急速に変化していることを示した。これらのプロトコルは、物理的、化学的、生物学的要因によって引き起こされるさまざまな擾乱の下で、土壌と水の界面全体の生物地球化学的応答を調査するのに役立ちます。この論文では、環境科学での使用の可能性に対するこの方法の利点と欠点について徹底的に説明しています。

このプロトコルに従って、 図1に示すように、マイクロ透析プロファイラーシステムが確立されました。土壌インキュベーションは洪水条件下(24°C、光の当たらない状態)で行った。6日目と7日目のサンプルを選択的に測定し、浸水した水を補充する慣行による土壌表面の潜在的な乱れを示しました。
各サンプリングの間、観察チャンバー内の一定数の水滴がマイクロ透析サンプラーに向かって流れるのが観察され、移送された試料溶液が嫌気性バッグ内の溶液によって連続的に補充されたことを示している。 図2に示すように、サンプル量の回収率は平均101.4%±0.9%で、100.2%から103.6%の範囲でした。サンプル量の回収率がわずかに高い場合は、嫌気性バッグとサンプリングチューブの上部の間に水位差があったことを示している可能性があります。
6日目と7日目に採取した土壌-水界面を横断したサンプルを用いて、間隙水中の鉄(Fe)、マンガン(Mn)、ヒ素(As)、カドミウム(Cd)、銅(Cu)、鉛(Pb)、ニッケル(Ni)、亜鉛(Zn)の総溶存濃度を測定しました(図3)。濃度-深さプロファイルは、元素の種類と浸水した水を補充する練習の前後で大きく異なりました。この研究では勾配ベースの実験計画を使用したため、ここでは複製を実行しませんでしたが、以前の研究では、深さに依存する化学信号の変化の良好な複製が示されました18。
6日目の溶存濃度は土壌深とともに増加したが,Cu,Pbの溶存濃度は土壌深の増加とともに減少した。結果は、土壌と水の界面における一般原理と観察と一致しています。具体的には、より深い土壌のより還元された環境は、Mn15、Fe、およびAsの還元的放出を増強し、溶解性の低いミネラルの形成によるカチオン性金属の放出を阻害する。しかし、Cd、Ni、およびZnについては、溶解濃度が約-20 mmの深さからより深い場所へと増加する傾向を示したため、濃度-深さプロファイルは異なるパターンを示しました。
Feの濃度-深さプロファイルと比較して(4.95 mg·L−1)およびAs(3.3μg·L−1)6日目の−12mmの深さでの、Fe(1.46mg・cm)の濃度L−1)およびAs(0.8μg·L−1)は7日目に有意に低かった。しかし、FeおよびAs濃度は、-18 mmから-50 mmの深さで有意に高かった(深さ依存の傾き、 p &lt; 0.001)。Mnを除くほとんどの元素について、好気的水分補給後の表層水および-15 mmの深さの均一な表層土壌の溶存濃度は、程度の差はあるものの有意に低かった。7日目には深さ約-10 mmにPbの濃度ピークがあり、6日目に観察されたものとは対照的なパターンを示していることが注目されました。これらの一貫性のない結果は、水の補給の乱れと、土壌と水の界面を横切る生物地球化学の時間的進化によって引き起こされる可能性があります。いずれの場合も、マイクロ透析プロファイラーは、土壌-水界面全体の化学プロファイルの時間空間変化をモニターする大きな可能性を示しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64358/64358fig01.jpg"> 図1:土壌水深50 mmまでの土壌-水界面での化学動態を監視するためのマイクロ透析プロファイラーのセットアップ。 (A)深さ50 mmで使用されているプロファイラーについては、補足図S1も参照してください。主なコンポーネントには、(B1,C1)3Dプリントされたスケルトンに取り付けられた33個のマイクロ透析サンプラー(B2、C2)が含まれ、さらに(B3)インキュベーション容器(50 mLサンプルチューブ)に設置され、(B4,B7,C4)1対多の緩衝容器、(B9-B12)脱気水の供給元として使用される医療用輸液バッグ、および(C5)オフラインサンプリングピペット。(B5)33個のサンプラーすべてのサンプリング位置は、(B6)プラスチックストリップで同じ高さに位置合わせされています。脱酸素水は、(C8)窒素バブリングを給水とは逆方向にバブリングすることにより調製される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/64358fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64358/64358fig02.jpg"> 図2:灌流液としてH2Oを用いたサンプリング量回収。 エラーバーは、2つの独立したプロファイラサンプリングの標準偏差を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/64358fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64358/64358fig03.jpg"> 図3:濃度-深さプロファイル。 (A)マンガン、(B)鉄、(C)ヒ素、(D)カドミウム、(E)銅、(F)鉛、(G)ニッケル、および(H)亜鉛を6日目と7日目に測定。Y 軸の負の目盛りラベルは、水と土壌の境界より下の深さを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/64358fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64358/64358fig04.jpg"> 図4:サンプラー内部に鉄が析出する漏れの故障事例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/64358fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:事前に設計されたスケルトンを印刷するためのコンピューター支援設計ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/3D%20printing%20file.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 S1: 使用中のプロファイラー。(A)浸水土壌。(B-E)上面図と側面図の写真と接続の詳細は別々に表示されます。(E)三方弁は、緩衝容器と医療用輸液バッグを接続するために使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64358/64358_Supplemental%20Fig%20S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

マイクロ透析プロファイラーは、酸素-無酸素-土壌-水界面全体で溶解した間隙水溶質を その場 で最小限の妨害でサンプリングすることが説明されています。この装置は、土壌-水界面およびそれ以降の擾乱によって引き起こされる濃度-深さプロファイルの急速な変化を捕捉するように設計されています。

Biogeochemical processes shift rapidly in both spatial (millimeter scale) and temporal (hour scale to day scale) dimensions at the oxic-anoxic interface ...

土壌科学者として、私たちは常に分析のために土壌粉末水を取る必要があります。ただし、特に粉末水中の化学物質が酸素に非常に敏感な場合は、それほど簡単ではありません。これは新しい技術です。これを API サンプラーと呼びます。サンプラーを使用することで、土壌への実際の負荷障害で2ミリリットルごとに土壌粉末を採取できます。私の生徒である張沙、玉佳、劉子燕、劉浩は、サンプラーの作り方とそれを使って土壌粉末水を取る方法を実演します。手付かずのナノメンブレンチューブを、長さ58ミリメートルの33本の短いチューブに正確に切断することから始めます。次に、ポリテトラフルオロエチレンまたはPTFEパイプをセラミックナイフで長さ180ミリメートルの66本のパイプに切断します。次に、きれいなプラスチックプレートにABエポキシ接着剤の2つの部分を完全に混合し、粘着性になるまで30分間放置してから、PTFEパイプの上部の外面に塗布します。ABエポキシ接着剤がチューブの4ミリメートルのみをカバーし、チューブをブロックする追加の接着剤がないことを確認してください。PTFEパイプをナノメンブレンチューブにそっとねじ込み、33本の手付かずのマイクロダイアリスサンプラーをすべて完全に組み立てることにより、2本のPTFEパイプを各ナノメンブレンチューブに接続します。組み立てたサンプラーを一晩放置して、接着剤の完全な硬化と安定化を確実にします。親水性を高め、マイクロ透析サンプラーを洗浄するには、エタノールに1時間浸した後、2%希釈硝酸と超純水でそれぞれ15分間超音波洗浄します。5ミリリットルの注射器を使用して水中で泡立てて、マイクロ透析サンプラーの開存性と気密性を確認します。マイクロダイアリシスプロファイラーを組み立てるには、CADファイルを使用して、ナイロン素材を使用して事前に設計されたスケルトンを印刷します。次に、スケルトンサイズに一致するように、5センチメートル間隔の2つの平行スロットを備えた酸洗浄されたPVC容器をくり抜いた。スロットには、3Dプリンターの彫刻モジュールを使用します。50ミリメートルの遠沈管キャップの形状のエポキシ接着剤を安定化させることにより、1対多のコネクタを構築します。次に、硬化する前に、長さ1センチメートルのシリコンキャップ33個をエポキシ接着剤に挿入し、一晩放置します。次に、チューブキャップから1対多コネクタを取り外し、セラミックナイフを使用してキュレートエポキシ接着剤を切断し、すべてのシリコンキャップの端が遮られないようにします。1対多のコネクタを2%希釈硝酸と超純水でそれぞれ15分間完全にすすぎ、周囲条件下で乾燥させます。乾燥したら、三方弁をチューブの底に接続して、緩衝容器として機能します。ABエポキシ接着剤を使用して50ミリリットルのシリンジチューブに1対多のコネクタを取り付けてバッファリングコンテナを組み立てます ホットメルド接着剤を使用して個々のマイクロ透析サンプラーをスケルトンに組み立て、各サンプラーがスケルトンの上端または下端に平行になるようにします。33個のマイクロダイアリシスサンプラーすべてをスケルトンに取り付け、両側の33個のサンプラーがPVCスロットを通過するようにします。スケルトンジョイントとスロットの隙間をABエポキシ接着剤でシールします。次に、50ミリリットルの遠沈管にあらかじめ取り付けられた1対多のコネクタバルブを介して、すべてのサンプラーをスケルトンの片側にあるバッファリングコンテナに接続します。次に、18.3ミリオームの水をあらかじめ充填した医療用輸液バッグを三方弁を介してバッファーコンテナに接続します。シリコンキャップを使用してサンプリング側のすべてのサンプラーを閉じます。三方弁を回して各マイクロ透析サンプラーの開存性と気密性を再確認し、医療用輸液バッグからサンプラーに水が流れるようにします。次に、バッファリングコンテナのすべてのサンプラーとバルブを閉じてオフにします。浸水した土壌をインキュベートする前に、医療用輸液バッグ内の水を脱気して酸素を除去します。医療用輸液バッグへの高純度窒素ガスのラインの経路で窒素ガスを一晩バブリングした。三方弁を使用して、プロファイラーと脱気バッグの間の接続を閉じます。次に、450グラムのふるいにかけた空気乾燥土壌をPVC容器に入れ、5つのマイクロ透析サンプラーが土壌表面の上に残るようにします。土壌をティッシュで覆ってから、超純水で土壌を溢れさせます。土壌が土壌表面から5センチメートル上にあふれたら、組織を取り除きます。土壌インキュベーションが初期化されたら、すぐにプリロードされた溶液でシステムをパージします。次に、嫌気性バッグと透析サンプラー間の接続をオンにして、サンプリングシステムを洗い流します。各サンプラーを水でパージするときは、サンプラーの総容量の10倍を使用してください。1つのサンプラーのパージが完了したら、清潔なシリコンキャップを使用してキャップをしてから、すべてのサンプラーをパージして、1つの浸水土壌インキュベーションおよびサンプリングシステムを確立します。次に、嫌気性バッグを水面の高さに調整し、すべてのチューブが水で満たされていることを確認します。そうでない場合は、キャップを外してチューブトップを下げ、嫌気性バッグから水が流れるようにします。キャップとバルブを閉じ、嫌気性バッグと透析サンプラーの間の接続をオフにして7日間インキュベートします。サンプリングする前に、土壌容器、サンプリングトップ、嫌気性バッグの水位を同じ高さに調整して、著しく異なる水ポテンシャルを回避します。次に、嫌気性バッグとバッファーコンテナ間の接続をオンにします。最初のサンプラーのキャップを上から下に取り外します。ピペットを使用して、133マイクロリットルのサンプルをサンプラーから0.6ミリリットルのバイアルに移し、保存のために133マイクロリットルの2%硝酸をプリロードします。サンプリング中、嫌気性バッグ観察チャンバー内の微小透析サンプラーに向かう水滴のゆっくりとした均一な流れを観察します。次のサンプリングチューブに移動する前に、シリコンキャップでチューブ上部を閉じます。嫌気性バッグとバッファー容器の間の接続をオフにする前に、33サンプルすべてに対してこれを繰り返します。サンプリング後6日目に洪水を補充します。貧弱な水サンプルを移す前後のサンプルバイアルを計量することにより、サンプル体積回収率を計算します。次に、誘導結合プラズマ質量分析またはICPMSを使用して、貧弱な水中の元素の総溶解濃度を測定します。サンプル量の回収率は平均101.4%で、100.2%から103.6%の範囲でしたサンプル量の回収率がわずかに高いほど、嫌気性バッグとサンプリングチューブの上部の水位差が示されました。6日目と7日目に採取した土壌水界面の試料を用いて、貧弱水中の鉄、マンガン、ヒ素、カドミウム、銅、鉛、ニッケル、亜鉛の総溶存濃度を測定した。6日目には,マンガン,鉄,ヒ素の溶存濃度は土壌の深さとともに増加したが,銅と鉛の溶存濃度は土壌の深さの増加とともに減少した。しかし、カドミウム、ニッケル、亜鉛については、溶解濃度がマイナス20ミリメートルからより深い場所に増加するため、濃度深度プロファイルは異なるパターンを示しました。6日目のマイナス12ミリメートルの深さでの鉄とヒ素の濃度深さプロファイルは、7日目のレベルよりも有意に高かった。しかし、鉄とヒ素の濃度は、マイナス18ミリメートルからマイナス50ミリメートルの深さまで有意に高かった。マンガンを除くほとんどの元素について、好気的水分補給後の表層水およびマイナス15ミリメートルの深さの均一な表層土壌の溶存濃度は有意に低かった。7日目の鉛濃度ピークはマイナス10mm程度で、6日目とは対照的なパターンを示した。この技術は、生物地球化学的マイクロインターフェースプロセスを研究した研究者に特に有用です。医学的交絡因子を絞り込むことができます。この手順は平らな土壌に適用されるため、酸素の漏れや侵入により、予期しない化学プロセスが大幅に変化し、すべての接続が気密であり、水の脱気が十分であることを確認してください。この手順に続いて、手根液体クロマトグラフィーおよび質量クロマトグラフィーおよび特殊分解能微生物分析などの他の方法を実行して、化学的および生物学的プロセスを橋渡しすることができる。この手法は、研究者が変化する環境下でウイルスの摂動が編集されたセンサー素子の動作にどのように影響するかについての新しい問題を探求する道を開きました。

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