低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)
January 20th, 2023
このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。
このプロトコルは、フローサイトメトリーのソーティングパラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞に対する迅速かつサイズ固有のソリューションメソッドを提供します。これらの最適化は、前方散乱対サイズ散乱のみを使用して小さな細胞外小胞の代表的な集団を取得できるようにする重要なソート設定のパネルを提供します。フローセルソーターの標準的な起動手順を実行することから始めます。
起動ボタンを押してマシンの電源を入れ、レーザーコントロールパネルのレーザーパワーボタンをクリックします。スマートサンプラーサブメニューのタンク交換ボタンを押して、流路系を加圧します。超音波洗浄された50マイクロメートルのジェットとエアノズルを使用し、ノズルアセンブリに取り付けます。
圧力コンソールで、シース液の場合は80 SI、サンプルフローの場合は80.3 SIに圧力を調整します。シース流開始ボタンを押して、シース流の流れを開始します。スマートサンプラーサブメニューのバブルボタンをクリックすると、自動的に 10 分間デバブルしてからオフにします。
流れを整列させてレーザースポットを決定するには、照明チャンバーライトをオンにして、ピンホール上の流れを表示します。上下、左右、前後のマイクロメータを調整して、ストリームをピンホールの中央に配置し、ストリームに焦点を合わせます。すべてのレーザーシャッターを開き、レーザーとストリームインターセプトタブを選択し、プロンプトに従って緑色の矢印ボタンを押し続けて、レーザーインターセプトとノズルアライメントのキャリブレーションプロセスを完了します。
ファインレーザーアライメントスクリーンにアクセスします。x軸パラメータとして640ナノメートルレーザーと772バール44バンドパスチャネルを選択し、y軸パラメータとして405ナノメートルレーザーと448バー59バンドパスチャンネルを選択します。トリガーパラメータセレクターを押して、488ナノメートルレーザーの前方散乱パラメータを選択します。
次に、1ミリリットルの二重蒸留水に1滴を加えてレインボー蛍光粒子を1ミリリットルあたり10〜6個のビーズの1倍の最終濃度になるように希釈する。サンプルチャンバーのドアを開き、準備されたレインボー蛍光粒子のチューブをロードします。サンプル開始ボタンを押し、マイクロメータを上下に調整して蛍光強度を最適化し、各信号を可能な限り強くします。
タッチスクリーンコントロールパネルの品質管理開始ボタンまたはQCボタンを押して、QCを自動的に実行します。次に、IntelliSort 初期化ボタンを押します。液滴振動の周波数と振幅を自動的に調整し、約25の液滴遅延を実現し、液滴のブレークオフポイントを鮮明に視覚化することができます。
次に、ドロップ遅延ボタンとメンテナンスボタンを押します。ソート出力タイプとしてチューブを選択します。15ミリリットルのチューブホルダーをソートチャンバーに入れます。
プレート電圧をオンにし、プレート電圧を約4, 000ボルトに設定します。次に、ストリーム設定ボタンを選択してテストパターンをオンにします。充電位相スライダーと偏向スライダーを調整して、ストリームの画像が収集チューブと一致していることを確認します。
次に、チェック マーク ボタンを選択します。コンピュータでSummitワークステーションにログインします。ファイルのメインメニューから新しいプロトコルを作成します。
次に、Summit Softwareコントロールパネルのヒストグラムタブを選択してドットプロットを作成します。X 軸パラメータとして前方散布図を選択し、Y 軸パラメータとして側面散布図を選択します。次に、ワークスペースで新しいドットプロットの軸を右クリックし、前方散布図と側方散布図を対数形式で表示します。
[集録]タブを選択し、集録パラメータパネルを見つけます。パラメータを有効にするサブメニューですべての信号を有効にします。トリガー パラメーターとして前方散布を選択し、しきい値を 0.01 に設定します。
前方散乱と側方散乱の電圧とゲインを250と0.6に調整して、前方散布図と側方散布図内のイベントと母集団が分離されるようにします。蛍光ポリスチレンミクロスフェアを1ミリリットルの二重蒸留水に1マイクロリットルのミクロスフェアを加えて、100、200、および300ナノメートルの懸濁液に希釈します。次に、マイクロスフェアサスペンションを連続してロードします。
Summit Software の取得メニューで [開始] を選択して 20 、 000 件のイベントを記録し、イベントの記録後に [停止] をクリックします。前方散布図と側方散布図のドットプロットを右クリックして長方形を作成し、ドラッグしてサイズを変更します。電子ノイズと100ナノメートルの微小球集団の領域を右クリックして、それぞれR7とR4の名前に変更して、領域を再配置します。
手順を繰り返して、200ナノメートルと300ナノメートルのミクロスフェアを長方形で連続してフレーム化し、それぞれR5とR6に変更します。最後に、電子ノイズと200ナノメートルの粒子の位置に基づいて50〜200ナノメートルの選別領域を決定し、R8として定義します。ソートロジックと統計パネルでソート決定を編集するには、左側のストリームまたはL1ストリームの空白フィールドをダブルクリックし、R8という名前のリージョンを選択してソートロジックを作成します。純度の中止モードを選択し、L1ストリームの1滴より上の液滴エンベロープを選択します。
事前に調製した細胞外小胞またはEV混合物の500マイクロリットルのサンプルをロードします。Summit の集録メニューの下にある [スタート] ボタンを押してデータを取得し、[停止] をクリックします。次に、ソートメニューの[開始]を押して、50〜200ナノメートルサイズの小さな細胞外小胞またはsEVを15ミリリットルの遠沈管に収集します。
標準サイズのポリスチレンミクロスフェアのフローサイトメトリー分析により、前方散乱対側散乱プロットで50〜200ナノメートルのサイズ範囲を特定すると、識別可能な粒子信号が明らかになりました。R4、R5、およびR6は、それぞれ100、200、および300ナノメートルの粒子の位置を指します。R7は50ナノメートルの粒子に対する検出限界としての電子雑音であり、R8は50〜200ナノメートルの粒子の位置範囲を表す。
ナノ粒子追跡分析(NTA)による膵臓1細胞由来のEVs混合物の粒度分布は、超遠心後40〜400ナノメートルの広い範囲にあった。フローサイトメトリーソーティングを実施して、R8領域内の50〜200ナノメートルのsEVを単離および精製しました。分離の品質はNTAによって検証され、選別後のsEVの粒径範囲は50〜200ナノメートルであることがわかりました。
さらにTEMによりsEVの存在を観察し、単離したsEVにはウェスタンブロット分析によりCD6、CD63、およびCD81のマーカーが含まれていることを確認しました。この方法は、小さな細胞外小胞の分離と、小さな細胞外小胞の遺伝子発現の分類またはタンパク質分析を可能にし、多くの下流の研究アプリケーションを開きます。
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概要
このプロトコルは、フローサイトメトリのソーティングパラメータを最適化することで、小型の細胞外小胞の迅速かつサイズ特異的な解決方法を提供します。これらの最適化により、前方散乱対サイズ散乱を使用して、小型の細胞外小胞の代表的な集団を取得することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 細胞外小胞
背景
- 小型の細胞外小胞は細胞間コミュニケーションに重要な役割を果たします。
- これらの機能を研究するためには、分離方法が不可欠です。
- フローサイトメトリはこれらの小胞をソートするための強力なツールです。
- ソーティングパラメータを最適化することで、分離サンプルの品質を向上させることができます。
研究の目的
- 小型の細胞外小胞の迅速な分離方法を開発すること。
- 効果的なソートのためのフローサイトメトリパラメータを最適化すること。
- 代表的な小胞集団の収集を確実にすること。
使用された方法
- フローセルソーターの標準的な起動手順。
- レーザー出力と流体圧の最適化。
- 超音波で洗浄された50マイクロメートルのジェットと空気ノズルの使用。
- 前方散乱対サイズ散乱に基づくソーティング。
主要な結果
- 小型の細胞外小胞の成功的な分離。
- フローサイトメトリの重要なソート設定の確立。
- 得られた代表的な集団の実証。
- ソートプロセスの効率の向上。
結論
- 最適化されたプロトコルは、小型の細胞外小胞の分離を向上させます。
- フローサイトメトリはこの目的に効果的に使用できます。
- 将来の研究は、これらの最適化されたパラメータに基づいて構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput, size-specific isolation of small extracellular vesicles (sEVs) is critical for enabling robust biomarker discovery and mechanistic studies in biopharma R&D. The lack of standardized sEV isolation methods has historically limited translational research and downstream assay development. Optimized flow cytometric sorting parameters now provide a reproducible, scalable solution for generating high-purity sEV populations, supporting portfolio-wide biomarker and drug intervention pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sEV-mediated signaling pathways for target validation.
- Supports biological de-risking by isolating vesicles with defined size and marker profiles.
- Facilitates predictive confidence in functional studies by reducing sample heterogeneity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity sEV preparations for downstream assay workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative output by minimizing background noise.
- Enables scalable, high-throughput screening of sEV-associated biomarkers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sEV isolation with disease-relevant biomarker discovery and validation.
- Ensures continuity from discovery through preclinical evaluation of vesicle-based signatures.
- Reduces risk of confounding variables in translational studies by ensuring sample consistency.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized flow cytometric sorting method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by isolating vesicles with defined characteristics.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sEV samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust size and marker-based readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity by standardizing sEV isolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for sEV isolation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sEV research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sEV isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable biomarker studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vesicle-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and vesicle biology for optimal parameter selection.
- Demands access to high-sensitivity flow cytometers and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating and sorting protocols.
- May require adaptation of settings for different cell sources or vesicle populations.
- Practical limitations include instrument sensitivity and potential overlap with electronic noise at lower size thresholds.
