蛍光発生RNAアプタマーの in vitro および細胞ターンオン動態の決定
August 9th, 2022
このプロトコルは、蛍光発生RNAアプタマーであるホウレンソウ2とブロッコリーの動態を決定するための2つの方法を提示します。最初の方法では、プレートリーダーを使用してin vitro で蛍光発生アプタマー動態を測定する方法を説明し、2番目の方法では、フローサイトメトリーによる細胞内の蛍光発生アプタマー動態の測定を詳述します。
in vitroおよび細胞の蛍光発生アプタマー動態を研究することで、ユーザーはアプタマー色素の相互作用が関心のあるプロセスをリアルタイムで研究するのに十分な速さであるかどうかを評価することができます。提示された技術は、細胞の内側と外側の両方で定量的な速度論的測定を可能にし、どちらもアプタマーの用途に応じて関連する可能性があります。提示された方法は、代替アプタマーや低分子用のRNAベースのバイオセンサーなど、あらゆる蛍光発生RNAシステムに適用できます。
まず、サーモサイクラーからRNA再生プログラムを設定します。選択してプログラムを作成します 新しいプログラムを作成する「新しいフェーズを追加」と新しいステップを追加「保存を押す前に温度固有のステップを複数回追加します」プログラムに応じて追加の設定を調整します。ホウレンソウ2本とブロッコリーRNAを再生するには、0.5ミリリットルの薄肉PCRチューブ内の二重蒸留水中で各RNAの2つのマイクロモル茎を準備します。
次に、等量の2-x再生バッファーを加えて、1マイクロモルRNA溶液を作ります。チューブをサーモサイクラーに入れます。保存した再生プログラムを開き、実行を押します「次に、プレートリーダーインジェクタープログラムを設定します。
蛍光プレートリーダーで、温度を選択します」摂氏37度に設定します。キネティクスを開始する前に、温度がこの値に平衡化されていることを確認してください。プレートリーダーソフトウェアを開きます。
設定を選択「次に取得ビュー」速度論的測定のプログラムを入力するには、各ウェルのループ「を選択します。次に、ベースライン設定を60ベースライン読み取りに設定し、スマートインジェクション設定を10マイクロリットルの注入に設定します。蛍光読み取り励起波長を448ナノメートル、発光波長を506ナノメートル、カートリッジをモノラルに設定します。
合計読み取り時間を 10 分に設定し、読み取り間隔を 0.5 秒に設定します。PMTと光学系を読み取りごとに6回の点滅に設定します。次に、次のウェルへのループを入力します。
プレートリーダーインジェクターを準備するには、プレートリーダーで「注入」を選択し、指示されたときに廃棄物収集プレートを供給します。次に、洗浄を選択し、プレートリーダーの指示に従って、1ミリリットルの二重蒸留水、75%エタノール、次に蒸留水で注入チューブを洗浄します。次に吸引を選択します「インジェクターが余分な液体を排出できるようにします。
次に、「prime」を選択して、2つの260マイクロリットルの100マイクロモルDFH Bでインジェクターをプライミング I.To、80マイクロリットルの結合バッファーマスターミックスを96ウェルクリアボトムプレートの1ウェルに追加して1回のキネティクス実験を実行します。次に、10マイクロリットルの変性RNAを追加します。インジェクター内のプレートとD F H B I溶液を摂氏37度に15分間平衡化させます。
次に、読み取り領域の下のソフトウェア設定で分析するウェルを選択します。次に、[ホーム]タブで、[実行]を選択して、前述のキネティクスプログラムを実行します。すべての実験が完了するまで、このプロセスを繰り返します。
実行後、インジェクターを洗浄して、前に示したように、残りのD F H B I溶液を注入チューブから取り除きます。実験ファイルを設定するには、フローサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。実験エクスプローラータブ内でフローサイトメーターを右クリックして新しいファイルを作成します"ユーザー名.
次に、ドロップダウンウィンドウで新しい実験を選択し、コンピューター画面の新しいウィンドウが表示されたら、実験タイプをチューブとして選択します」そして、[OK]を選択します新しい実験ファイルで、グループフォルダーを右クリックして、[新しいサンプルチューブの追加]を選択します「特定の時点ごとにサンプルチューブにラベルを付け、サンプルを右クリックして複製します」ドロップダウンメニューで[名前の変更]を選択します。次に、1つのXPB Sと3マイクロリットルの誘導細胞をAI培地に添加して希釈した細胞溶液を培養チューブに調製した。色素を添加する前に、細胞のバックグラウンド蛍光を測定して、時間の経過に伴う折り目がオンになるのを観察します。
色素を添加したら、PBSの細胞を含む培養チューブをサンプルチューブリフターに入れ、リフターをサンプル注入針に持ち上げます。次に、収集パネルタブで適切なサンプルファイルを選択し、[記録]をクリックします「実行が完了したら、培養チューブでサンプルチューブリフターを手で下げます。すすぎステップを開始し、流体システムをフラッシュし、各生物学的複製サンプル間のキャリーオーバーを最小限に抑えます。
次のサンプルに移動するには、レコードアイコンの下にあるサンプルチューブ名の近くにある右矢印アイコンをクリックして、次のサンプルファイルを選択します。色素を含む細胞の蛍光を測定するには、1.4マイクロリットルの濃縮色素ストックを細胞を含む1つのXPB Sに加え、最終濃度50マイクロモルのD F H B I 1 T.培養チューブの蓋を固定し、3〜5回反転させて溶液を均一に混合します。次に、蓋を外し、培養チューブをサンプルチューブリフターに入れます。
ホルダーをサンプル注入針に上げた後、適切なサンプルファイルの下にあるレコード」アイコンをクリックします。次いで、startを押してタイマーを開始し、「ホウレンソウ2種とブロッコリーの蛍光発生アプタマーのインビトロ動態、DFHBi色素への結合に対する二相会合動態を表示した。両方のアプタマーについて、速度論データは、長い測定時間で一相よりも二相会合によってよりよく適合した。
最良適合曲線は、高速関連と低速関連の速度定数と半減期値を決定しました。結合能力状態のホウレンソウ2種は、ブロッコリーよりも速いターンオンを示した。両方のアプタマーについての第2相動態は類似しており、共通の律速段階に対応し得る。
アプタマー速度論曲線は、同程度の高速会合RNAで構成されています。ホウレンソウ2種のT RNAを発現する細胞の場合、平均蛍光強度またはMFIはゼロ時点で直ちに増加する。さらに、細胞蛍光は5分以内にその最大平衡化MFI値に達した。
対照的に、対照細胞はバックグラウンド蛍光が低く、DMS O添加によるMFI値の変化は見られませんでした 提示された方法により、研究者は、蛍光発生アプタマーのRNAベースのセンサーをより迅速に作成する方法を決定できます。
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概要
このプロトコルは、蛍光RNAアプタマーSpinach2とBroccoliの運動学を決定するための2つの方法を概説しています。最初の方法は、in vitro測定にプレートリーダーを使用し、2番目の方法は細胞測定にフローサイトメトリーを使用します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 分子生物学
背景
- 蛍光RNAアプタマーは、分子間相互作用のリアルタイム研究に有用です。
- アプタマーの運動学を理解することは、様々な生物学的プロセスでの応用にとって重要です。
- これらの方法は、異なるRNAシステムとバイオセンサーに適応できます。
- 測定技術には、in vitroと細胞環境が含まれます。
研究の目的
- リアルタイムでのRNAアプタマーの運動学を評価すること。
- 様々な蛍光RNAシステムに適用可能な方法論を提供すること。
- アプタマー相互作用の定量的測定を容易にすること。
使用された方法
- プレートリーダーを使用したin vitro運動学測定。
- フローサイトメトリーを使用した細胞運動学測定。
- サーモサイクラーでのRNA再自然プログラム設定。
- PCRチューブでのRNAサンプルの調製。
主な結果
- in vitroと細胞内でのアプタマー運動学の測定に成功。
- リアルタイム研究に適した、速いアプタマー-染料相互作用を実証。
- 様々なRNAベースのバイオセンサーに適用可能な方法。
- 両実験設定に対して定量的データを取得。
結論
- 提示された方法は、RNAアプタマー運動学の効果的な研究を可能にします。
- in vitroと細胞測定の両方が実現可能で有益です。
- これらの技術は、RNAベースの応用研究を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative determination of fluorogenic RNA aptamer turn-on kinetics is critical for enabling real-time RNA visualization and biosensor applications in live-cell systems. Accurate kinetic profiling ensures that aptamer-dye interactions are sufficiently rapid to support dynamic studies of gene expression and metabolite signaling. This capability directly impacts the predictive confidence and translational value of RNA-based discovery tools across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of RNA function and pathway activity in live cells.
- Enables biological de-risking by confirming aptamer responsiveness aligns with experimental timescales.
- Facilitates functional target validation for RNA-based biosensors and reporters.
Screening & Assay Development
- Provides validated kinetic parameters for assay standardization and reproducibility.
- Enables development of high-throughput screening assays for RNA-targeted compounds.
- Delivers quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biosensor performance with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-based tools into preclinical workflows.
- Improves predictive de-risking by quantifying aptamer kinetics in physiologically relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
These kinetic measurement methods integrate at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a foundation for robust RNA-based tool deployment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying real-time RNA dynamics.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized kinetic benchmarks.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence readouts and kinetic rate constants for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures biosensor kinetics are compatible with preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse fluorogenic RNA systems and biosensors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurement protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency in RNA tool development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-based discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and fluorescence-based kinetic analysis.
- Depends on access to plate readers with injectors and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of kinetic measurement protocols.
- Adaptable to a range of fluorogenic RNA aptamers and biosensor platforms.
- Limited by the diffusion rates and cellular uptake characteristics of specific dyes and cell types.
