Name: 細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぼう、アクトミオシンゲルのポロ弾性特性をin vitroで解析する手法。細胞骨格モデルとしてネットワークと溶媒の動態を定量化し、ミオシン収縮性と流体流動の相関を解明する。

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タンパク質の精製とラベリングを提供してくれたDina Aranovichに感謝します。G.L.は、ジャボチンスキー博士号奨学金を提供してくれたイスラエル科学技術宇宙省に感謝しています。A.B.G.は、イスラエル科学財団(助成金2101/20)と科学技術省-イスラエル国(助成金3-17491)の財政的支援に感謝しています。

1.ガラス表面処理と不動態化:
注:このセクションには、(i)洗浄と親水化、(ii)シラン化、および(iii)表面不動態化の3つの主要なステップが含まれています( 図1を参照)。
<ol><li>洗浄と親水化<ol><li>ガラス表面の洗浄にはピラニア溶液を使用してください。 注:ピラニア溶液は、30%H 2 O 2と70%H2SO4の混合物です(材料表)。その主な目標は、カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させることです。このようにして、ガラス表面は親水性となる。</li>
		<li>10-12 #1.5(22 mm x 22 mm)ガラスカバーガラスカバースリップ(材料表)を自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダー(ベース面積:5.5 cm x 5.5 cm)に入れます。ポリテトラフルオロエチレンホルダーを400 mLビーカー(材料表)に移し、300 mLのピラニア溶液で2時間インキュベートします。氷の上と化学フードでこのステップを行います。 注意: ホルダーベースにねじ込まれたポリテトラフルオロエチレンポールの長さは12 cmで、ビーカー(11 cm)よりも長く、ピラニア溶液へのホルダーの安全な移動/引き出しを可能にします。ピラニア溶液は依然として反応性が高く、非常に高温である可能性があるため、反応を停止することが不可欠です。反応を止める最も簡単な方法は、ピラニア溶液を(水道)水に注ぎ、(少なくとも)50倍に希釈することです。その後、溶液を安全に廃棄できます。使用済みのピラニア溶液を閉じたガラス瓶に入れないでください–これはボトルの爆発で終わる可能性があります。</li>
		<li>ポリテトラフルオロエチレンホルダーを新鮮な二重蒸留水(DDW)で満たされた清潔なビーカーに移して、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流します。</li>
		<li>ビーカーを超音波処理浴(材料表)に移し、25°Cで10分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。 新しいDDWでこの手順をさらに2回繰り返します。毎回新鮮な重水素水を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>シラン化<ol><li>ホルダーを300mLの純粋なメタノール(材料の表)で満たされたきれいなビーカー(400mL)に移し、次いで超音波処理浴(材料の表)に移す。25°Cで30分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。</li>
		<li>超音波処理後、15mLの重水素減少水、3.1mLの酢酸(材料表)、340mLのメタノール、および7.6mLのシラン(((3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン)を使用して調製したシラン溶液にホルダーを移す(材料表)。ビーカーをパラフィルムで密封し、4°Cの冷蔵庫で一晩保管します。 注意: シラン溶液の調製と取り扱いは、化学薬品フード内で行う必要があります。シラン化工程後、使用済みのシラン溶液(廃液)を薬液フード内の専用ガラス瓶に入れます。</li>
		<li>翌日、ホルダーを300 mLの純粋なメタノールで満たされた清潔なビーカーに15秒間移します。次いで、ホルダーを清潔なビーカーに移し、ポリテトラフルオロエチレンホルダーの底部を乾燥させる前ではなく、過剰のメタノールを除去した。ビーカーをオーブンに移し(材料表)、ガラスカバーガラスを120°Cで5分間乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>不活性ポリマーによる表面パッシベーション<ol><li>ガラスカバーガラスを不活性ポリマーでインキュベートすることにより、表面パッシベーションを実現します(材料表)。実験ごとに、2枚のカバーガラスを取り、最初にエタノール(EtOH)で洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます(重水素水腫/EtOH:30/70 vol / vol)(材料表)。</li>
		<li>各カバーガラスを1 mLの4 mg·mL−1 5 kDa分子量メトキシポリエチレングリコールマレイミド(mPEG-mal、Mw = 5 kDa)(材料表)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(材料表)中で22°Cで1時間インキュベートします。 注意: カバーガラスを疎水性パラフィルム層に置くと、親水性PEGポリマー溶液がガラスカバーガラス表面に閉じ込められます。インキュベーション時間は、最適なパッシベーションを達成するために重要です。45分から2時間の範囲のインキュベーション時間を使用してください。このインキュベーション時間を超えると、ガラスカバースリップの表面が劣化し、タンパク質の接着や透明性の低下につながる可能性があります。</li>
		<li>インキュベーションプロセスの最後に、各カバーガラスを5 mLの重水素減少水ですすぎ、N2 (ガス)の流れで乾燥させます。カバーガラスを真空下で乾燥させないでください。パッシベーション後はカバーガラスを濡らしておく必要があるため、すぐに1 mLの10 mM Trisをペグ化表面に置きます。カバーガラスは2時間以内に使用してください。 注意: ガラス表面の汚染を防ぐために、さまざまな手順を層流チャンバーで実行する必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>2. タンパク質精製
<ol><li>ゲルろ過法24を使用してウサギ骨格筋アセトン粉末からG-アクチンを精製する。<ol><li>アクチン精製には1週間かかります。精製した G-アクチンを G-バッファー (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN3, 0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP, 1 mM DTT) に保存し、氷上で保存します。2週間以内にソリューションを使用してください。 注意: 数日ごとに氷を交換してください。</li>
		<li>アクチンをマレイミド修飾蛍光色素16 で標識する(材料表)。GST-ファシンを小野らの方法に基づいて精製する25。両方のタンパク質を液体N2中で瞬間凍結し、−80°Cで保存する。</li>
	</ol></li>
	<li>標準プロトコールを使用して、ウサギ骨格筋からミオシンIIを精製する26。精製されたミオシンII(ダイマー)ストックバッファーには、10 mM Tris pH 7.4、0.5 M KCl、および35% w/vスクロースが含まれています。ミオシンを液体N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。 注:高濃度のKClはミオシンモーターを二量体形態に保ち、スクロースの割合が高いため、凍結時にモーターの活動が妨げられないことを保証します。ミオシンIIストック溶液を扱う場合は、粘性流体の取り扱いに専用のピペットを使用してください(材料表)。<ol><li>ミオシンII二量体を蛍光色素で標識し(材料表)、操作されたシステイン残基のペアで19,27。そのためにニワトリ砂嚢RLC変異体Aを使用する26.標識したミオシンIIを液体N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。 注:この標識手順は、標識されたミオシンが天然のミオシンIIタンパク質として活性であることを保証します。</li>
	</ol></li>
	<li>UV-Vis分光光度計(材料表)を使用してストックタンパク質溶液の吸光度を測定し、次の吸光係数を使用してBeer-Lambertの法則でタンパク質濃度を推定します:G-アクチン(ε290 = 26,460 M-1・cm-1)、GST-ファシン(ε 280 = 99,330 M−1・cm−1)、ミオシンII二量体(ε280 = 268,800 M−1・cm−1)、 RLC変異体A(ε280 = 3,960 M−1・cm−1)19。</li>
</ol>3. サンプル調製
注:ミオシンIIモーターと強力な受動架橋剤ファシンの大きな凝集体の存在下でアクチンモノマーを重合して、巨視的に収縮する弾性アクトミオシンネットワークを生成します19,23。蛍光ビーズを溶液に添加することで、ゲル収縮中の溶媒の流れを追跡できます。
<ol><li>タンパク質(「アクトミオシン」)溶液<ol><li>G-アクチンを除き、少量のアリコートで-80°Cに保ち、37°Cで解凍してから使用してください。アクトミオシン溶液の総容量は40μLです。</li>
		<li>10 mM Tris pH 7.4、2 mM MgCl2、25 mM KCl、1 mM ATP、ATP再生系(0.5 mg·mL-1クレアチンキナーゼおよび5 mMクレアチンリン酸)、200 μM EGTA (キレートCa2+イオン)、漂白防止溶液(0.1 mg·mL-1グルコースオキシダーゼ、0.018 mg·mL-1カタラーゼ、および5 mg·mL-1グルコース)を混合して溶液を調製します。 5 μM G-アクチン、280 nM GSTファスチン、および1.67 nM ミオシンII。標識G-アクチンの割合は5%(モル百分率)である。 注:ゲル収縮の進行段階での蛍光シグナルの飽和を避けるために、標識されたG-アクチンの割合を低くしてください。</li>
	</ol></li>
	<li>ミオシンIIモーター凝集体の調製<ol><li>ミオシンモーターを凝集体の形でタンパク質溶液に加える。大きなミオシン凝集体(150ミオシン二量体/凝集体)を形成するには、ミオシンストック溶液を10 mM Tris pH 7.4で希釈して、最終濃度25 mM KClにします。</li>
		<li>希釈したミオシン溶液を室温(RT)で10分間保持し、使用するまで氷に移します。モーターは最大2時間完全にアクティブです。</li>
	</ol></li>
	<li>溶媒流量の測定<ol><li>ゲル細孔を横切る溶媒の流れを追跡するには、蛍光ビーズをアクトミオシン溶液に加えます。ビーズを不動態化することにより、ビーズとアクトミオシンネットワークとの間の相互作用を減少させる。実際には、1 μLのビーズ(材料表)を5 μM G-アクチンとともにRTで20分間インキュベートした後、遠心分離(材料表)によって余分なG-アクチンを除去します(条件:6,000 x g 、4°Cで5分間)。</li>
		<li>10 mg·mL−1 ウシ血清アルブミン(BSA)(材料表)でこの手順を繰り返し、残りのコーティングされていない表面を(おそらく)ブロックします。実験では、1:10,000 vol/volの最終希釈でビーズを使用します。 注:ビーズ/ポアサイズ比がすべての段階で<1になるように、ビーズの直径をゲルの細孔サイズに適合させることが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>溶液粘度の影響<ol><li>アクトミオシン溶液にグリセロール(材料表)を添加して溶液の粘度を制御します。0%〜34%の範囲の重量パーセントでグリセロールを添加すると、溶液粘度が ηωから2.76 ηωに上昇し、 ここでηωは20°Cでの水の粘度である28。 注意: グリセロールを扱う場合、粘性流体の取り扱いには専用のピペットを使用することが不可欠です(材料表)。</li>
	</ol></li>
</ol>4. テストの実行
<ol><li>自家製サンプルホルダーの取り扱い<ol><li>PEG不動態化カバースリップの1つを取り、その上にグリースを塗ったパラフィルムスペーサーを置き、サンプルホルダーに入れます。 注意: パラフィルムスペーサーは任意のスペーサーと交換できます。</li>
	</ol></li>
	<li>アクトミオシン溶液の調製<ol><li>さまざまな微視的成分を組み込み、ミオシンIIモーター凝集体を添加し、最後にEGTAを添加することにより、マイクロ遠心チューブ内の氷上でアクトミオシン溶液を調製します。溶液をよく混ぜる。EGTAの添加により、アクトミオシンネットワーク重合が開始され、実験の開始時間が設定されます。</li>
	</ol></li>
	<li>その溶液1.1 μLをホルダーに取り付けられたカバーガラスに置き、2番目のカバーガラスを上に置きます。ホルダーをねじ込んでサンプルを密封します。このプロセスは、円盤状の形状を採用したドロップをわずかに絞ります。落下直径は2,800〜3,000μmの範囲です。</li>
	<li>サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。初期取得時間を短縮するために、事前に顕微鏡を準備してください。通常、混合後、サンプルイメージングを開始するのに1〜2分かかります。</li>
</ol>5.顕微鏡技術
<ol><li>専用ソフトウェア(材料表)で制御する倒立蛍光顕微鏡(材料表)を用いて試料を画像化します。<ol><li>2.5倍/0.075倍の低倍率のPlan-NEOFLUAR対物レンズ(材料表)を使用して、ゲル領域全体を視覚化し、その巨視的な収縮を経時的に追跡します。</li>
		<li>10x/0.3 Ph1 UPlanFL対物レンズ(材料表)を使用して、ネットワークの多孔性と構造を特徴付け、ネットワークの自己組織化と収縮を経時的に追跡します。 注:この目的は、ネットワーク内のミオシンIIモーター凝集体を局在化し、ゲル細孔を横切る蛍光ビーズの動きを追跡するのにも役立ちます。より高い倍率を使用することができ、これは視野の減少を犠牲にして、デュアルカラーイメージングモードでさらに重要です(材料表)。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルを488 nm(アクチン/蛍光ビーズ)および561 nm(ミオシンモーター凝集体/蛍光ビーズ)で励起します。電子増倍型電荷結合素子(EMCCD)カメラ(材料表)でストリーミングモードで専用ソフトウェア(材料表)で1フレームあたり100msの画像を取得します。 注意: 蛍光灯(材料表)の強度は、ネットワークの収縮中の信号飽和を避けるために、可能な限り低い値に保つ必要があります。</li>
	<li>同時2色イメージング<ol><li>このモードは、(i)アクチンネットワーク内のミオシンモーター凝集体の局在を検出すること、および(i)ネットワーク収縮中の内外の外向きの溶媒の流れを特徴付けることの2つの目的で使用します。</li>
		<li>アクチンモーターとミオシンIIモーターをそれぞれ488 nmと561 nmで励起し、デュアルエミッション装置(材料表)を使用してEMCCDカメラ(材料表)に同時に画像を記録します。同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲル(488 nm)と蛍光ビーズ(561 nm)を同時にイメージングします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

ここでは、多孔弾性アクトミオシンゲルの力学を細胞骨格のモデル系として特徴付けるためにin vitroアプローチが採用されており、より一般的には、多孔弾性材料として振る舞うことが示されている細胞質のモデルシステムとして3,5。細胞骨格(細胞質)のレオロジーは、多孔弾性拡散定数によって特徴付けられており、これは、加えられた機械的ストレスの後に細胞内細胞質液が細胞内に再分配するのにかかる時間を決定します。細胞は、このメカニズムを使用してその形状を調節することが提案されています5。
これらの知見に動機付けられて、私たちは多孔弾性を in vitroで研究するためのフレームワークを開発しました。提案モデルシステムを用いて、ミオシン収縮性が流体の流れの出現にどのように寄与するか、またネットワーク速度と溶媒速度の方向性と速度が時間と空間でどのように相関するかについての洞察を提供します。これにより、...

生細胞は独特の機械的性質を持っています。加えられた力に受動的に反応する能力に加えて、それらはまた、外部刺激に応答して能動的に力を生成することができる1。これらの特性は、特に細胞運動中のさまざまな細胞プロセスに不可欠であり、主に細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシン分子モーター、およびアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。これらのアクトミオシンネットワークは、アクチンフィラメントを架橋し、ATP加水分解によって燃料となるネットワークに機械的ストレスを積極的に生成するミオシンモータータンパク質によって駆動される固有の自己組織化および収縮特性を示します2。
細胞骨格の材料特性を研究するために、数多くの実験的および理論的研究が行われてきた3。一般に受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料4として振る舞うというものである。これは、短い時間スケールでは細胞骨格が弾性材料として振る舞い、長い時間スケールでは、架橋タンパク質とミオシンモーターの剥離(および再付着)により粘性流体として振る舞い、ネットワークが動的に回転することを可能にすることを意味します。しかし、多くの場合、粘弾性モデルは実験結果を記述できず、細胞骨格、より一般的には細胞質が多孔弾性活物質として記述されている図とより一致しています5,6。2つの主な特徴がこれらのタイプの材料を特徴付ける。(i)第1の主な特徴は、細胞ブレブ7、運動性8、細胞形状振動9などのプロセスの根底にあるミオシンモーターによって駆動される収縮性勾配によって、ゲル細孔を横切る浸透性細胞ゾル(「溶媒」)の流れの生成です。そのような細胞質流の出現は、ブレブのために局所的であり得るか、または細胞運動性のように局所的であり得る。後者の場合、細胞後部で加えられた収縮応力は、細胞前面に向かって細胞質液の流れを駆動し、それはラメリポディアアセンブリ8に必要なタンパク質プールを補充する。(ii)第2の主な特徴は、応力の緩和が拡散性であり、ゲル弾性率、ゲル多孔度、および溶媒粘度に依存する実効拡散定数によって特徴付けられることです5。多孔弾性拡散定数は、加えられた応力に対するシステムの応答速度を決定します。拡散定数が高いほど、応力の再分布が速くなります。これにより、ミオシンモーターによって生成される活発な収縮ストレスなど、外部または内部に適用された機械的ストレスの後に、細胞内細胞質液が細胞内に再分配されるのにかかる時間が決まります。したがって、これらの例は、細胞骨格と細胞質ゾルの機構が緊密に結合しており、別々に扱うことができないことを示しています3。
細胞はさまざまな方法で機械的特性を調節できるため、ネットワーク力学と流体力学の相互作用はよくわかっていません。強力な代替アプローチは、さまざまな微視的成分とシステムパラメータの完全な制御を可能にするin vitro再構成システムを使用することであり、これにより、これらのモデルシステムは物理分析に最適です10,11。このアプローチは、アクチンベースの運動性に対するタンパク質組成とシステム形状の影響を研究するために首尾よく採用されています12、13、14、15、16、17、18、アクトミオシンネットワークの2Dパターニング19、20、21、22、およびこの論文の焦点である多孔弾性アクトミオシンゲルのネットワーク収縮性と流体力学の間の相互作用23。
この原稿では、制御可能な寸法と材料特性の収縮弾性アクトミオシンネットワークの調製について、Ideses et al.23の研究に基づいて議論されています。収縮ゲルと排出溶媒のダイナミクスが分析および定量化され、これらのアクトミオシンゲルが多孔弾性活物質として記述できることが実証されます。応力拡散性に対する溶媒粘度の影響を研究することで、これらのネットワークの多孔弾性特性がさらに確認されます。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が提供されます。最後に、実験上の課題、一般的な落とし穴、および実験結果と細胞骨格との関連性についても説明します。

<table><tbody><tr><td>(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>175617</td><td>アルゴン雰囲気下 4°C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetic</td> acid <td>Bio-Lab ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>DMSOで希釈し、-20°Cのアルゴン雰囲気下で保存。C&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td><td>DMSOで希釈し、-20°Cのアルゴン雰囲気下で保存。C&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>4°Cで保管。C&nbsp;</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>カンパニーC9322</td><td>ストックボトルは、-20°Cの乾燥雰囲気(シリカゲル)下に保管されます。C</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>メゼルグレイザー</td><td>CG2222-1.5</td><td>ピラニア処理後、ミリク水で保存し、3週間以内に使用</td></tr><tr><td>クレアチンキナーゼ</td><td>ロシュ ライフサイエンス製品</td><td>10736988001</td><td>グリシン緩衝液で新鮮に調製し、氷上でケップし、3日以内に使用しました。&nbsp;ストックボトルは、乾燥した雰囲気(シリカゲル)の下で4°Cに保たれます。C</td></tr><tr><td>クレアチンホスフェート</td><td>ロシュライフサイエンス製品</td><td>10621714001</td><td>溶解したときは-20°Cに保つ必要があります。Cで3ヶ月以内に使用します。ストックボトルはアルゴン雰囲気下で保管され、4°Cで保管されます。C</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ロシュライフサイエンス製品</td><td>10708984001</td><td>溶解したときは-20°Cに保つ必要があります。Cおよび3か月以内に使用</td></tr><tr><td>デュアルビュー同時イメージングシステム&nbsp;</td><td>フォトメトリクス</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD カメラ</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD カメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>バイオラボ株式会社</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>Flourescence Lamp</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoresbriteYG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>直径 200 nm</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>溶解するときは-20°Cに保つ必要があります。Cで3ヶ月以内に使用します。</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td><td>-20 °C;Cで3ヶ月以内に使用します。ストックパウダーはアルゴン雰囲気下で保管され、-20°Cに保たれます。C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>216763</td><td>4 °Cで保存されています。C&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMDミリポア株式会社</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>メタノール</td><td>バイオラボ株式会社</td><td>1368052100 MgCl</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>442615</tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. 重量で小さなバッチに分割されます。-20°Cのアルゴン雰囲気下で保存。C</td></tr><tr><td>ナイルレッド ミクロスフィア</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>直径2300nm</td></tr><tr><td>対物レンズ (10x)</td><td>Leica Germany</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td></tr><tr><td>Objective (2.5x)</td><td>ライカ・ドイツ</td><td></td> <td>506304&nbsp;Plan-NEOFLUAR 開口数 = 0.075</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>WTC バインダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS バッファー</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>シャッター ドライバー</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>シリカゲル</td><td>メルク</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理機</td><td>エルマ</td><td>エルマソニック P</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>カルロ・エルバ</td> 試薬 <td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 デュアルチャンネル同時イメージングシステム</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 分光光度計</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&ndash;10 uL</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>データの定量化&nbsp;</td></tr><tr><td>メタモルフ&nbsp;</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>光学イメージングシステムの制御ソフトウェア、データ定量化(粒子追跡解析、ネットワークメッシュサイズ)</td></tr></tbody></table>

細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

細胞は活発にその形状を変えて運動性になることができ、これはそれらの内部構造を活発に再編成する能力に依存する特性である。この特徴は、細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシンモーター、および固有の収縮特性を示すアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。通常受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料として振る舞うというものです。しかし、このモデルは、細胞骨格を多孔弾性活物質(細胞質ゾルが埋め込まれた弾性ネットワーク)として記述する図とより一致する実験結果を常に説明できるとは限らない。ミオシンモーターによって生成された収縮性勾配は、ゲル細孔を横切る細胞質ゾルの流れを駆動し、細胞骨格と細胞質ゾルの力学が密接に結合していることを推測します。多孔弾性の主な特徴の1つは、ゲル弾性率、多孔性、および細胞質ゾル(溶媒)粘度に依存する有効拡散定数によって特徴付けられる、ネットワーク内の応力の拡散緩和です。細胞はその構造と材料特性を調節する多くの方法を持っているため、細胞骨格力学と細胞質ゾルの流れのダイナミクスがどのように結合しているかについての現在の理解はよくわかっていません。ここでは、細胞細胞骨格のモデル系としての多孔弾性アクトミオシンゲルの材料特性を特徴付けるために、 in vitro 再構成アプローチが採用されています。ゲル収縮はミオシン運動収縮性によって駆動され、それは浸透溶媒の流れの出現をもたらす。この論文では、これらのゲルを調製し、実験を実行する方法について説明します。また、溶媒の流れとゲルの収縮をローカルスケールとグローバルスケールの両方で測定および分析する方法についても説明します。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が示されています。最後に、細胞骨格力学との関連性を含め、実験上の課題と一般的な落とし穴について説明します。

実験ごとに2枚のガラスカバースリップが使用されます。ガラスカバーガラスは、PEGポリマーで洗浄および不動態化されています。パッシベーションは、可溶化タンパク質が実験の初期段階でガラス表面に付着するのを防ぎ、収縮ネットワークとガラス壁との相互作用を最小限に抑えるために不可欠です。良好な不動態化を達成できないと、非効率的な収縮につながる可能性があり、極端な場合にはアクチンネットワーク形成を阻害することさえあります。
図1は、表面処理手順の3つの主要なステップを説明しています。これらのステップには以下が含まれます:(i)カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させるピラニア溶液を使用した表面洗浄と親水化。(ii)シランをガラス表面に共有結合させることを目的とした(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランによる表面シラン化、各シラン分子がSH基で終わる。(iii)PEGポリマーによるパッシベーション(mPEG-mal、5 kDa)-このステップでは、PEGポリマーのマレイミド基が(3-メルカプトプロピル)ト...

この研究では、制御された条件下でのアクトミオシンゲルの多孔弾性を研究するために 、in vitro 再構成アプローチが採用されています。アクトミオシンゲルと包埋溶媒のダイナミクスが定量化され、それを通してネットワークの多孔弾性が実証されます。また、実験上の課題、一般的な落とし穴、および細胞骨格力学との関連性についても説明します。

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

私たちは、多孔弾性活性物質として振る舞うことが示されている細胞骨格、より一般的には細胞質のモデル系として、多孔弾性アクトミオシンゲルのメカニズムを特徴付けるためのin vitroアプローチを開発しました。この方法は、ミオシンの収縮性が流体の流れの出現にどのように寄与するか、およびネットワークと細胞質ゾル速度が時間と空間でどのように相関しているかについての洞察を提供します。このシンプルなアプローチにより、AFIMのような従来のツールでは使用できない高度な機器や技術を使用せずに、動的に進化するシステムの機械的特性を抽出することができます。この方法は、活性ゲルと包埋流体の特異性に関係なく、多孔弾性活物質のレオロジーに関する洞察を提供することができます。まず、自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダーに10〜12個の1.5番のガラスカバーガラスを置き、400ミリリットルのビーカーにピラニア溶液を準備します。化学フードで氷の上で溶液を準備します。ホルダーをピラニア充填ビーカーに移します。3時間後、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流すために新鮮な二重蒸留水で満たされたきれいなビーカーにホルダーを移し、ビーカーを80ヘルツの超音波処理浴に移し、摂氏25度で10分間フルパワーします。新鮮な二重蒸留水でこの手順をさらに2回繰り返します。塩類化のために、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに移し、次いで30分間超音波処理浴に移す。次に、ホルダーをシラン溶液に移します。ビーカーをパラフィルムで密封し、摂氏4度の冷蔵庫に一晩保管します。翌日、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに15秒間移します。ホルダーの底を乾かして余分なメタノールを取り除き、きれいなビーカーに移します。次に、ビーカーをオーブンに移して、ガラスのカバーガラスを摂氏120度で5分間乾燥させます。表面不動態化を実現するには、実験ごとに2つのカバースリップを取り、最初にエタノールで洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます。各カバーガラスを1ミリリットルのメトキシポリエチレングリコールマレイミドと1X PBSで摂氏22度で1時間インキュベートします。インキュベーションプロセスの最後に、ペトリ皿を傾けて取り外し、ペグします。各カバーガラスを5ミリリットルの二重蒸留水ですすぎ、窒素ガスの流れで乾かします。カバーガラスは不動態化後も濡れたままにしておく必要があるため、すぐに1ミリリットルの10ミリモルのトリスをペグ化面に置き、カバーガラスを2時間使用します。大きなミオシン凝集体を形成するには、ミオシンストック溶液を10ミリモルのトリスで希釈して、最終濃度の25ミリモルの塩化カリウムにします。希釈したミオシン溶液を室温で10分間保

the-mechanics-poro-elastic-contractile-actomyosin-networks-as-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

差動動的顕微鏡(DDM)は、動的光散乱と顕微鏡の機能を兼ね備えています。ここでは、DDMを使用して、ビメンチンネットワーク内の粒子の亜拡散およびケージドダイナミクスおよび活性ミオシン駆動アクチン - 微小管複合体の弾道運動を定量化することによって、再構成された細胞骨格ネットワークを特徴付けるプロセスを提示する。...

微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。...

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

この論文では、共絡アクチンフィラメントと微小管の調整可能な3次元複合ネットワークをエンジニアリングおよび特性評価するためのプロトコルを紹介します。複合材料は、ミオシンIIおよびキネシンモーターによって駆動される能動的再構成および弾道運動を受け、アクチン、微小管、モータータンパク質、および受動架橋剤の相対濃度によって調整される。...

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学ぼう、アクトミオシンゲルのポロ弾性特性をin vitroで解析する手法。細胞骨格モデルとしてネットワークと溶媒の動態を定量化し、ミオシン収縮性と流体流動の相関を解明する。

細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

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