Name: 左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学ぶ左冠動脈結紮術によるマウス心筋梗塞モデルの構築方法。炎症反応と病理生理学的変化を研究する再現性の高い外科的手法を習得し、心血管疾患の治療戦略開発に貢献する。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01HL143967、R01HL142629、R01AG069399、およびR01DK129339)、AHAトランスフォーメーショナルプロジェクトアワード(19TPA34910142)、AHAイノベーティブプロジェクトアワード(19IPLOI34760566)、およびALAイノベーションプロジェクトアワード(IA-629694)(PDへ)によってサポートされました。

本研究プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されました。体重24〜30gの8匹(偽n = 4およびMI n = 4)の1歳の雌C57BL / 6Jマウスをこれらの実験に使用しました。マウスの約100%および少なくとも80%が、それぞれ最初の24時間および28日間で生存した。
1.マウスの準備と気管内挿管
<ol><li>ビーズ滅菌器( 材料の表を参照)を250°Cに予熱し、オートクレーブ滅菌した手術器具を数分間入れます。</li>
	<li>3%イソフルランと1 L / min酸素を含む誘導チャンバーでマウスを5分間麻酔します。</li>
	<li>しっかりとしたつま先のつまみに対する反応をチェックして、マウスの麻酔の深さを確認してください。</li>
	<li>マウスの体重を測定して、術前の鎮痛薬であるブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の投与量を推定します。.薬物を腹腔内に注射する。</li>
	<li>電気かみそりを使用して胸部の左側の毛皮を整えます。</li>
	<li>その後、ポビドンヨードと70%エタノールで手術部位を3回消毒します。</li>
	<li>マウスを傾斜したボードの仰臥位に置きます。マウスの頭と手足を、それぞれ上顎切歯に取り付けられたゴムバンドと粘着テープを使用して固定します。麻酔下での乾燥を防ぐために、滅菌眼科用潤滑剤を目に塗布します。</li>
	<li>顎を開き、舌を口腔からそっと引き出します。</li>
	<li>喉頭鏡を使用して中咽頭を照らすことによって喉頭の開口部を特定します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>24 Gのカテーテル針から約0.5 cmを切り取り、鈍い針をプラスチックシールドに挿入します。プラスチック製のシールドが付いた鈍い針を気管に向けます。プラスチック製のシールドを気管に残して、針を取り出します。</li>
	<li>人工呼吸器( 材料の表を参照)を毎分137拍の呼吸数(この研究で使用したマウス用に最適化)と一回換気量0.18ccに設定します。人工呼吸器チューブをカテーテルシールドに接続し、人工呼吸器と同期した胸の動きを探して、正しい挿管を確認します。</li>
	<li>呼吸用保護チューブをカテーテルシールドから外し、予熱された温度制御された手術用ボード上で動物を仰臥位に置きます。マウスを人工呼吸器に再接続します。</li>
</ol>2.左冠状動脈の永久結紮術
<ol><li>手術部位をポビドンヨードと70%アルコールで消毒します。中央に四分の一サイズの穴がある滅菌ドレープを適用して、手術部位を固定します。鉗子を使用して皮膚をそっと持ち上げ、外科用ハサミを使用して左大胸筋と小筋の間の線に沿って小さな(1.5〜2 cm)皮膚横切開を行います。 注:はさみを使用して切開を行い、カットの深さと方向を必要な制御を提供します。</li>
	<li>下にある胸筋を鉗子と解剖ハサミで分離します。筋肉は、ゴムバンドに取り付けられた開創器を使用して分離されました。</li>
	<li>胸郭の自然な角度に従って、マイクロハサミで3番目の肋間腔を切開します。この段階では、心臓や肺の損傷を防ぐために細心の注意を払う必要があります。</li>
	<li>開創器を使用して肋骨をそっと伸ばし、左心室を露出させます。心膜脂肪を脇に動かし、左心房の端から心臓の頂点に向かって走るLCAを見つけます。</li>
	<li>パス 8-0ニードルホルダーの助けを借りてLCAの下にナイロン縫合糸。LCAをダブルノットでリゲートし、その後に2番目のノット(変更された外科医のノット)を付けます。 注:左心室の下脳室の白化により、LCA結紮が成功したことが確認されます。これに加えて、トロポニン測定、ECGモニタリング(ST上昇)、エコー/生体 内心臓依存MRI、またはマイクロCT画像も、同等のMI病変を確認することをお勧めします。</li>
	<li>開創器を取り外し、22Gのカテーテル針を胸腔に挿入します。プラスチックシールドの先端を胸腔に残して、針を取り外します。4-0ナイロン縫合糸を使用して胸郭を閉じます。</li>
	<li>シリンジを22 Gのプラスチックシールドに接続し、胸部を軽く押して負圧を確立し、胸腔に閉じ込められた余分な空気をゆっくりと取り除きます。プラスチックシールドを取り外します。</li>
	<li>4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。</li>
	<li>イソフルランの供給をオフにします。この段階で、マウスは人工呼吸器の上にいて酸素を供給しています。</li>
</ol>3.術後ケア
<ol><li>自発呼吸が始まったら、人工呼吸器のスイッチを切ります。 注:この手順は、マウスの準備からこのステップまで、動物あたり約30〜35分かかります。</li>
	<li>マウスをヒートランプの下に置き、スリープ状態になるまで監視します。動物は、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を回復するまで放置しないでください。</li>
	<li>手術後、動物を別のケージに入れ、完全に回復した後にのみ他の動物と一緒に元のケージに戻します。</li>
	<li>痛みや不快感の兆候がないかマウスを毎日監視します。</li>
	<li>手術後さらに2日間、6〜8時間ごとにブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の腹腔内注射を継続します。.</li>
</ol>4.心エコー検査の評価
注:心エコー検査は、MI後28日目に心不全のパラメーターを評価するために実施されました。
<ol><li>手術後28日後、マウスに3%イソフルランと1 L / min酸素を麻酔し、滅菌眼科用潤滑剤を目に塗布し、脱毛クリームを使用して胸毛を取り除きます。胸部をポビドンヨードと70%エタノールで3回消毒します。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスをイメージングプラットフォーム( 材料の表を参照)の上に仰臥位で固定し、麻酔システムに接続されたノーズコーン(1%〜2%イソフルランと1 L / min酸素)を使用して、手順全体を通して安定したレベルの麻酔を維持します。</li>
	<li>4本の足を電極ゲルでECG電極にテープで留めます( 材料の表を参照)。直腸プローブを挿入して動物の体温を監視します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>スキャニングゲル( 資料表を参照)を胸部に塗布し、トランスデューサーを垂直に配置し、胸骨傍線(胸部に平行)まで下げ、反時計回りに35°回転させて、左心室の胸骨傍長軸図を取得します。</li>
	<li>イメージングソフトウェアの Bモード イメージングボタン( 材料の表を参照)をタップして、心臓の完全な長軸ビューを取得します。ゲートサイズと明るさを調整し、後の測定のために [クリップ の保存]または [フレームの保存] を使用して画像を保存します16。</li>
	<li>Mモード(モーションモード)に切り替え、Mモード軸を乳頭筋のレベルに配置します。ゲートサイズを調整し、Mモードスタートボタンをタップします。[クリップの保存]または[フレーム16,17の保存]を使用して画像を保存します。</li>
	<li>4Dモードの画像取得プロセスは自動化されているため、データを取得する前に、ECGと呼吸信号がアクティブであることを確認してください(図1)。</li>
	<li>Bモードでデータ集録を開始します。4Dスキャンパネルを開き、3Dモーターを起動します。4Dスキャンパネルで画像パラメータを設定し、スキャンボタンをタップして スキャン を開始します。2Dビューで画像をレビューした後、4Dにロードボタンを使用して画像を 4D モードにロードします。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、開示する利益相反はありません。

MIのマウスモデルは心臓血管研究所で人気を集めており、この研究では、再現性があり臨床的に関連するMIモデルについて説明しています。このプロトコルは、いくつかの方法でLCAライゲーションプロセスを改善します。まず、キシラジン/ケタミンやペントバルビタールナトリウム14,15などの注射可能な術前麻酔薬の使用は避けられます。イソフルラン麻酔のみが使用され、他の薬剤と比較して、動物の生存率を高め(手術後28日の生存率>80%の生存率)、薬物誘発性合併症を最小限に抑え、心臓への影響を最小限に抑えます19。しかしながら、イソフルランはまた、他の麻酔薬と比較して低い程度ではあるが、心臓を遅くする20。このプロトコルには、気管切開21を回避する侵襲性の低い気管内挿管が含まれ、術後の痛みと不快感を軽減します。以前のマウスLCA結紮研究では、気管内挿管の視覚化を改善するために首の中央切開を行うことが...

心血管疾患は、毎年1,790万人の命を奪う主要な公衆衛生上の懸念事項であり、世界の死亡率の31%を占めています1。最も一般的なタイプの心血管異常は冠状動脈性心臓病であり、心筋梗塞(MI)は冠状動脈性心臓病の主要な症状の1つです2。MIは通常、脆弱なプラークの破裂による冠状動脈の血栓性閉塞によって引き起こされます3。結果として生じる虚血は、罹患した心筋の深刻なイオン性および代謝変化、ならびに収縮機能の急速な低下を引き起こす。MIは心筋細胞の死をもたらし、さらに心室機能障害や心不全につながる可能性があります4。
MI5の患者から得られた組織が不足しているため、患者におけるMIに関する研究は限られています。このように、MIのマウスモデルは、疾患メカニズムの研究と潜在的な治療標的の開発の両方に役立ちます。現在利用可能なMIのマウスモデルには、不可逆的虚血モデル(LCAおよびアブレーション法)および再灌流モデル(虚血/再灌流、I / R)6が含まれます。マウスの左冠状動脈(LCA)の永久結紮は最も使用されている方法であり、患者7,8,9のMIの病態生理学および免疫学を模倣します。永久MIは、電気的損傷または凍結損傷を伴うアブレーション法によっても誘発され得る。アブレーション法は、正確な位置10で均一なサイズの梗塞を生成することができる。一方、瘢痕形成、梗塞形態、および分子シグナル伝達機構は、アブレーション法によって異なり得る10、11。マウスI/R法は、再灌流療法の臨床シナリオを表すため、もう12つの重要なMIモデルです。I/Rモデルは、梗塞サイズの可変、初期損傷の反応の区別の難しさ、再灌流などの課題に関連しています6。
LCA結紮法は広く使用されていますが、生存率の低さと術後の痛みに関連しています13。このプロトコルは、マウスの準備と挿管、LCA結紮、術後ケア、およびMIの検証を含むLCA結紮のマウス外科MIモデルを実証します。 浸潤気管切開14を使用するのではなく、この方法は気管内挿管を使用します。動物は、喉頭鏡を使用して中咽頭を照らすことによって挿管され、手順をより簡単に、より安全に、そして外傷性を少なくします15。マウスは、手順全体を通して人工呼吸器サポートとイソフルラン麻酔下に保たれます。また、心エコー検査とマッソントリクローム染色を行い、MI後の心機能および心線維症をそれぞれ評価します。全体として、この方法は、MI後の病態生理学および炎症を研究するために使用できるMIの信頼性が高く再現性のある外科的マウスモデルを提供します。

<table><tbody><tr><td>22 G カテーテル針</td><td>Exel INT</td><td>26741</td><td>胸腔穿刺</td></tr><tr><td>24 G カテーテル針</td><td>Exel INT</td><td>26746</td><td>気管内挿管</td></tr><tr><td>4-0 ナイロン縫合</td>糸 <td>Covetrus</td><td>29263</td><td>筋肉と皮膚の縫合</td></tr><tr><td>8-0 ナイロン縫合</td>糸 <td>S&T</td><td>3192</td><td>LAD</td></tr><tr><td>麻酔気化器</td>の結紮 <td>獣医装備</td><td>VE-6047</td><td>麻酔サポート</td></tr><tr><td>動物生理学モニター</td><td>富士フイルム</td><td>VEVO 3100</td><td>心拍数、呼吸数、体温のモニター</td></tr><tr><td>ベタジン溶液</td><td>PBS 動物の健康</td><td>11205</td><td>抗刺激薬</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>コベトラス</td><td>55175</td><td>鎮痛薬</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>OMANO</td><td>OM2300S-V7</td><td>双眼電気</td></tr><tr><td>カミソリ</td><td>Wahl</td><td>79300-1001M</td><td>シェービング</td></tr><tr><td>電極ゲル</td><td>Parker Laboratories</td><td>W60698L</td><td>導電性ゲル</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコンラボラトリーズ</td><td>22-032-601</td><td>消毒剤</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11065-07</td><td>ステンレス鋼</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>Curity</td><td>CAR-6339-PK</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td>Satco</td><td>S4998</td><td>手術後のケア</td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>ケント科学</td><td>Surgi-M</td><td>温度制御</td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>発火器 500</td><td>11503</td><td>手術器具の滅菌</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>コベトラス</td><td>29405</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>マッソン&rsquo;s トリクローム染色キット</td><td>Thermoscientific</td><td>87019</td><td>心臓線維症の測定</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td>ステンレス製</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>FST</td><td>15000-02</td><td>ステンレス製</td></tr><tr><td>眼科用軟膏</td><td>Dechra</td><td>Puralube 獣医</td><td>滅菌眼用潤滑剤</td></tr><tr><td>スキャン ゲル</td><td>パーカー研究所</td><td>アクアソニック 100</td><td>水性超音波伝送ゲル</td></tr>は<tr><td>さみ</td><td>FST</td><td>14060-11</td><td>ステンレス鋼</td></tr><tr><td>小動物喉頭鏡</td><td>ペンセンチュリー</td><td>モデルLS-2-M</td><td>中咽頭を照らす</td></tr>小<tr><td>動物換気扇</td>ハーバー<td>ド大学装置</td><td>557058</td><td>人工呼吸器サポート</td></tr><tr><td>手術用ライト</td><td>コールパーマー41723</td><td></td><td>イルミネーター幅(インチ):7</td></tr><tr><td>Vevo 3100 前臨床イメージングプラットフォーム</td><td>富士フイルム</td><td>VEVO 3100</td><td>心エコー検査</td></tr><tr><td>VevoLABソフトウェア</td><td>富士フイルム</td><td>VevoLAB 3.2.6</td><td>心エコー検査データ分析</td></tr></tbody></table>

左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

虚血性心疾患とそれに続く心筋梗塞(MI)は、米国および世界中の主要な死亡原因の1つです。心筋梗塞後の病態生理学的変化を探索し、将来の治療法を設計するためには、MIの研究モデルが必要です。マウスの左冠状動脈(LCA)の永久結紮は、MI後の心機能と心室リモデリングを調査するための一般的なモデルです。ここでは、LCAの永久結紮による、侵襲性が低く、信頼性が高く、再現性の高い外科用マウスMIモデルについて説明します。私たちの手術モデルは、簡単に可逆的な全身麻酔、気管切開を必要としない気管内挿管、および開胸術で構成されています。MIを確実にするために心電図検査とトロポニン測定を実施する必要があります。 MI後28日目の心エコー検査は、心機能と心不全のパラメーターを識別します。心臓線維症の程度は、マッソントリクローム染色および心臓MRIによって評価することができる。このMIモデルは、MI後の病態生理学的および免疫学的変化を研究するのに役立ちます。

図1は、偽(図1A)およびMI(図1B)マウスの心エコー評価中の代表的な活動的ECGおよび呼吸信号を実証する。心エコーデータを取得する前に、アクティブなECGと呼吸信号の検証が重要です。 図2は、LCA結紮後28日後の心機能パラメータの心エコー測定を示しています。図2は、偽心臓(図2A)およびMI(図2B)心臓の傍胸骨短軸図のMモード画像を示す。図2Bは、LCA結紮後の心臓壁運動の欠陥を示しています。LV質量の増加(図2C)、駆出率の減少(図2D)、心拍出量の減少(図2E)...

ここに提示されるのは、マウスの左冠状動脈の永久結紮のための外科的処置である。このモデルは、心筋梗塞後の病態生理学および関連する炎症反応を調査するために使用できます。

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...

マウスの左動脈の永久結紮の外科モデルは、心筋梗塞後の病態生理学および関連する炎症反応を調べるために使用することができる。この方法は、MIの信頼性が高く生産可能なマウスモデルを提供し、簡単で安全で侵襲性が低い。まず、ビーズ滅菌器を摂氏250度に予熱し、オートクレーブ滅菌した手術器具を数分間入れます。しっかりとしたつま先のつまみに対する反応をチェックして、マウスの麻酔の深さを確認してください。マウスの体重を量って、術前の鎮痛薬ブプレノルフィンの投与量を推定し、腹腔内に注射します。電気かみそりを使用して胸部の左側の毛皮を整えます。手術部位を消毒した後、マウスを傾斜したボード上の仰臥位に置きます。マウスの頭と手足を、それぞれ上顎切歯と粘着テープに取り付けられたゴムバンドを使用して固定します。麻酔下での乾燥を防ぐために、滅菌眼科用潤滑剤を目に塗布します。顎を開き、舌を口腔からそっと引き出します。喉頭鏡を使用して口腔咽頭を照らすことによって喉頭の開口部を識別します。24ゲージのカテーテル針から約0.5センチメートルを切り取り、鈍い針をプラスチックシールドに挿入します。プラスチック製のシールドが付いた鈍い針を気管に向けます。プラスチックシールドを気管に残して、針を取り出します。人工呼吸器を毎分137拍の呼吸数に設定し、この研究で使用したマウスと一回換気量0.18の閉鎖能力に最適化します。人工呼吸器チューブをカテーテルシールドに接続し、人工呼吸器と同期した胸の動きを探して、正しい挿管を確認します。呼吸用保護チューブをカテーテルシールドから外し、予熱された温度制御された手術用ボード上で動物を仰臥位に置きます。マウスを人工呼吸器に再接続します。手術部位を消毒した後、鉗子を使用して皮膚をそっと持ち上げ、手術用ハサミを使用して左大胸筋と小胸筋の間の線に沿って小さな皮膚横切開を行います。下にある胸筋を鉗子と解剖ハサミで分離します。3番目の肋間腔を切開した後、開創器を使用して肋骨を静かに伸ばし、左心室を露出させます。心膜脂肪を脇に動かし、左心房の端から心臓の頂点に向かって走る左冠状動脈を見つけます。パス 8-0針ホルダーの助けを借りて左冠状動脈の下にナイロン縫合糸。左冠状動脈を二重結び目とそれに続く2番目の結び目でレゲートします。開創器を取り外し、22ゲージのカテーテル針を胸腔に挿入します。プラスチックシールドの先端を胸腔に残して、針を取り外します。4-0ナイロン縫合糸を使用して胸郭を閉じます。シリンジを22ゲージのプラスチックシールドに接続し、胸部を軽く押して負圧を確立し、胸腔に閉じ込められた余分な空気をゆっくりと取り除きます。プラスチックシールドを取り外します。イソフルランの供給をオフにし、酸素を供給する人工呼吸器にマウスを置きます。マウスの自発呼吸が1回始まり、人工呼吸器の電源を

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

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無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。...

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

学ぶ左冠動脈結紮術によるマウス心筋梗塞モデルの構築方法。炎症反応と病理生理学的変化を研究する再現性の高い外科的手法を習得し、心血管疾患の治療戦略開発に貢献する。

左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル

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