Name: インビトロ 基質スクリーニングのための精製組換え ショウジョウバエ カスパーゼを用いた切断アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ、精製組換えショウジョウバエカスパーゼDroncとDriceを用いたインビトロ切断アッセイによる基質スクリーニング法。このプロトコルは、カスパーゼ基質の高通量解析と細胞死メカニズムの解明に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

エリフ・カンバー・カヤ博士がラボでプロトコルを確立するのに協力してくれたことに感謝します。ガイ・サルヴェセン博士は、DriceC211A 変異体9を親切に提供してくれました。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立総合医学研究所(NIGMS)からの助成金番号2R35GM118330のMIRA賞によって資金提供されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

1. 細菌における組換えカスパーゼ発現
<ol><li>標準プロトコル23を使用して、目的の遺伝子(カスパーゼまたは推定基質)をN末端および/またはC末端タグを持つ細菌発現ベクターにクローニングします。 注:タグは組換えタンパク質の溶解度を高めることができ、組換えタンパク質の精製に使用されます。ここで、Dronc、Drice、およびそれらの触媒変異体はベクターpET28aにクローニングされ、N末端6xHisタグ(pET28a-6xHis-Dronc wt、pET28a-6xHis-Dronc C318A、pET28a-6xHis-Dricewt、pET28a-6xHis-Drice C211A)を提供する。(プライマー情報については、補足表1を参照してください)。</li>
	<li>標準的な手順23,24を用いて、目的の遺伝子を有するベクターをコンピテントBL21(DE3)pLysS 大腸菌細胞に形質転換する。形質転換混合物を適切な抗生物質(pET28aの場合はカナマイシン)を含むLB寒天プレートにプレートして、形質転換細菌を選択します。(別表2参照)</li>
	<li>プレートからコロニーを選び、適切な抗生物質を含む5 mLのLB培地に接種して、振とうプラットフォーム上で37°C、220 rpmで一晩増殖させます。</li>
	<li>翌日、抗生物質を含むLB培地30〜50 mL(サンプルあたり)を調製し、一晩培養した培養液1 mLを追加します。バイオフォトメーター/分光光度計を使用した600nm(OD600)での光学密度は、0.1〜0.2である必要があります。</li>
	<li>OD600 が0.6に達するまで、振とうプラットフォーム上で37°C、220rpmで培養物を成長させます。OD600 が0.6に達するまで、毎時ODを確認します。これには約2〜3時間かかります。</li>
	<li>タンパク質(カスパーゼ)の発現を誘導するには、IPTGを最終濃度0.1〜0.2 mMまで添加します(IPTGストックから1:1,000〜1:500に希釈、 補足表2を参照)。</li>
	<li>培養物を30°C、220rpmで3時間培養します。 注:時間と温度は、発現しているタンパク質の種類とその溶解度によって異なります。異なるカスパーゼまたは基質が発現する場合は、これらの条件を調整する必要があります。</li>
	<li>3時間後、培養液を50 mL遠沈管で2,000 x g、4°Cで20分間スピンダウンします。上清を捨ててペレットを進めます。 メモ: プロトコルはこの時点で停止し、後で続行できます。細菌ペレットは-80°Cで凍結することができる。</li>
</ol>2.小規模組換えカスパーゼ抽出
<ol><li>ペレット培養物を含む凍結チューブを-80°Cの保存から取り出し、氷上で10分間保持してペレットを柔らかくします。</li>
	<li>10分後、1 mLの血清学的ピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤、10 mg/mLのリゾチームおよび50 U/mLのベンゾナーゼを添加した0.6 mLの細菌細胞溶解バッファー(補足表2)をペレット含有チューブに加えます。</li>
	<li>同じピペットチップで、ペレット粒子のない透明な淡黄色の溶液が見えるまで上下にピペッティングしてペレットを溶解します。氷上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>ライセートを適切な遠心チューブに移し、ライセートを17,000 x g で4°Cで40分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。これはカスパーゼを含む粗抽出物です。</li>
	<li>チューブを氷上に保ち、Ni-NTAアガロースで精製を進めます。</li>
</ol>3. 小規模Hisタグカスパーゼ精製
<ol><li>Ni-NTAアガロースの50%スラリーを、ステップ2.5からのカスパーゼ抽出物の各チューブに0.2 mL加えます。エンドオンエンドローテーター上でチューブを4°Cで1時間回転させます。</li>
	<li>1時間後、Ni-NTAアガロースを含む抽出物を、先端をそのままにして1 mLのポリプロピレンカラムに加え、ラックに入れます。5分間放置します。</li>
	<li>5分後、カラムのキャップを外し、上澄み液を重力流で流出させます。</li>
	<li>Ni-NTAアガロースの充填樹脂を乱さずに1 mLの洗浄バッファー(補足表2)をカラムに注意深く加え、重力流で洗浄します。</li>
	<li>洗浄ステップを3回実行します。</li>
	<li>カスパーゼを溶出するには、洗浄バッファーを完全に排出した後、1.5 mLの微量遠心チューブをカラムの収集ノズルの下に置きます。</li>
	<li>0.5 mLの溶出バッファー(使用直前に1xプロテアーゼ阻害剤を補充)を各カラムに加え、1.5 mLの微量遠心チューブに溶出液を回収します。 注:細かく精製された溶出液は透明になります。</li>
	<li>溶出液を氷上に保ち、Bradfordアッセイ25によってタンパク質の濃度を測定します。精製されたカスパーゼの純度/均質性をSDS-PAGEとそれに続くクーマシーブルー染色26で確認する。 注:50 mL LB培養の収量は、0.5〜1.5 mgのカスパーゼタンパク質の範囲です。溶出には0.5 mLの溶出バッファーを使用すると、濃度は1〜3 mg/mLの範囲になります。精製されたカスパーゼ溶出物は、溶解および精製の同じ日に in vitro 切断アッセイに使用することが重要です。</li>
</ol>4. 無細胞発現系における推定カスパーゼ基質の発現
注:このプロトコルでは、Droncの天然基質であるDriceは、 大腸菌 での組換え発現(上記のセクション3を参照)と、哺乳類の無細胞発現システムであるウサギ網状赤血球ライセート(RRL)での発現の両方によって調製されます(このセクション、以下を参照)。
<ol><li>標準的な手順23を用いて、推定基質の遺伝子をT7、T3、またはSP6プロモーターのいずれかを含む発現ベクターにクローニングする。 注:このプロトコルでは、DriceC211A がモデル基質として使用されており、遺伝子発現用のT7プロモーターを搭載し、イムノブロッティングによる検出のために推定タンパク質基質にN末端Mycタグでタグ付けするベクターpT7CFE1-N-Mycにクローニングされました。</li>
	<li>RRLでは、候補基質は放射性または非放射性のいずれかで合成することができる。<ol><li>非放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRL、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスロイシン(1 mM)、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを追加します。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。 注:RRLライセートには、100〜200 mg / mLの内因性タンパク質が含まれています。 インビトロ 翻訳反応の場合は、RRLを50%濃度で添加します(ここでは25 μL/50 μL反応)。</li>
		<li>放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRLライセート、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、2 μLのS35標識メチオニン(10 mCi/mLで1000 Ci/mmol)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。チップとチューブは放射性廃棄物容器に廃棄してください。 注意: ロイシンなしでアミノ酸混合物を追加しないでください。pT7CFE1ベクターは、タンパク質発現にT7プロモーターを使用します。他のベクターはT3またはSP6プロモーターを使用する。その場合、T7 RNAポリメラーゼの代わりにT3またはSP6 RNAポリメラーゼを使用する必要があります。DNAテンプレートが高純度であることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>反応液を30°Cで90分間インキュベートします。</li>
	<li>10秒間短時間回転させ、チューブを氷の上に置きます。RRL中の推定基質の発現レベルをSDS-PAGEおよびイムノブロッティング/オートラジオグラフィーで確認してください。 注:切断反応に添加されるRRL抽出物の量は、検出方法(イムノブロッティングまたはS35 オートラジオグラフィーのいずれか)で検出できるタンパク質の量に基づいている必要があります。 in vitro 切断アッセイ(次のセクション)に進むか、-80°Cで保存してください。</li>
</ol>5. RRLで生成された基質を用いた in vitro 切断アッセイ
<ol><li>セクション4で説明されているように、生成された推定基板を取ります。このプロトコルでは、N-Myc-DriceC211A がモデル基板として使用されます。</li>
	<li>推定基質の発現レベルに応じて(イムノブロットまたはオートラジオグラフィー分析によって個別に決定される、ステップ4.4を参照)、切断アッセイにおいて目的のタンパク質でプログラムされた1〜10μLのRRLを使用する。</li>
	<li>セクション1、2、および3で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg追加します。</li>
	<li>カスパーゼアッセイバッファーで総反応量を50 μLにします。</li>
	<li>反応物を30°Cの水浴中で3時間インキュベートします。切断アッセイに適切なコントロールを含めるようにしてください。ここでは、触媒変異体DroncC318A を対照として用いる。</li>
	<li>3時間後、チューブを氷上に移して反応を停止します。</li>
	<li>50 mM DTTを含むLDSサンプルバッファーを1容量加えます。LDSサンプルバッファーを添加して反応を完全に停止させます。</li>
	<li>サンプルを75°Cのヒートブロックで10分間インキュベートします。</li>
	<li>素早くスピンし、フリックして混合し、サンプルあたり24 μLをロードし、SDS-PAGE(セクション7を参照)を実行するか、サンプルを-20°Cで保存します。</li>
</ol>6.細菌発現組換え基質タンパク質を用いた in vitro 切断アッセイ
<ol><li>10 μgの精製候補基質(ここではセクション1、2、および3で生成した6xHis-DriceC211A)を0.5 mLマイクロ遠心チューブに追加します。</li>
	<li>セクション1および2で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg添加します。カスパーゼアッセイバッファーを使用して、総容量を50 μLにします。</li>
	<li>手順 5.5 から 5.9 に従います。</li>
</ol>7. SDS-PAGEとイムノブロッティング
<ol><li>切断反応(24 μL)を4%-12%トリス-グリシンまたはビス-トリスグラジエントゲル(材料表)にロードし、タンパク質電気泳動およびイムノブロッティング(またはS35標識基質を使用する場合はオートラジオグラフィー)を実行して、標準的な手順27,28を使用して結果を視覚化します。 注:ここでは、このプロトコルでは、MopsランニングバッファーとLDSローディングバッファーを含むBis-Trisグラジエントゲルを使用しました。一般に、トリス-グリシンゲルの一般的に使用されるPAGEプロトコルは、トリス-グリシン-SDSランニングバッファーとSDSローディングバッファーを使用して実行されます。</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+function+in+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase function in programmed cell death.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).</li>
<li>Hawkins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+cleaves+following+glutamate+or+aspartate+and+is+regulated+by+DIAP1%2C+HID%2C+and+GRIM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+an+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+is+regulated+by+DIAP1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1.</a> EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).</li>
<li>Timmer, J. C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).</li>
<li>Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apaf-1%2C+a+human+protein+homologous+to+C.+elegans+CED-4%2C+participates+in+cytochrome+c-dependent+activation+of+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.</a> Cell. 90 (3), 405-413 (1997).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+and+substrate+specificity+of+the+Drosophila+initiator+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+melanogaster+ICE%2FCED-3-related+protease%2C+drICE%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE.</a> EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).</li>
<li>Denton, D., Mills, K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+for+studying+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols for studying cell death in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).</li>
<li>Dorstyn, L., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+analysis+of+the+activation+of+the+Drosophila+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).</li>
<li>Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDPs%3A+caspase-dependent+non-lethal+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).</li>
<li>Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+message+from+the+Holy+Land%3A+The+first+international+conference+on+nonapoptotic+roles+of+apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins.</a> FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).</li>
<li>Baena-Lopez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+about+the+caspase-dependent+functions+without+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">All about the caspase-dependent functions without cell death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).</li>
<li>Florentin, A., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+levels+and+execution+efficiencies+determine+the+apoptotic+potential+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).</li>
<li>Amcheslavsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+localization+of+apoptotic+caspases+for+non-apoptotic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions.</a> Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).</li>
<li>Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+membranes+non-apoptotic+compartments+for+apoptotic+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases.</a> Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave%3A+towards+more+accurate+prediction+of+caspase+substrate+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites.</a> Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave+2.0%2C+a+new+approach+for+predicting+caspase+and+granzyme+cleavage+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets.</a> Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).</li>
<li>Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+mono-ubiquitylation+of+the+Drosophila+initiator+caspase+Dronc+functions+in+both+apoptotic+and+non-apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways.</a> PLoS Genetics. 13 (2), 1006438(2017).</li>
<li>Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caspases: preparation and characterization.</a> Methods. 17 (4), 313-319 (1999).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%284th+edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Hirano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).</li>
<li>Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Fogarty, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+reactive+oxygen+species+drive+apoptosis-induced+proliferation+via+Drosophila+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages.</a> Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interactions+between+Drosophila+caspases+and+the+proapoptotic+genes+rpr%2C+hid%2C+and+grim%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).</li>
<li>Edfors, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+validation+of+antibodies+for+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced validation of antibodies for research applications.</a> Nature Communications. 9 (1), 4130(2018).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Brizzard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging.</a> Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).</li>
<li>Kanuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+cell+death+pathway+by+Dapaf-1%2C+a+Drosophila+Apaf-1%2FCED-4-related+caspase+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator.</a> Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+is+a+Drosophila+homologue+of+Apaf-1%2FCED-4+and+functions+in+an+evolutionarily+conserved+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway.</a> Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).</li>
<li>Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAC-1%2C+a+Drosophila+homolog+of+APAF-1+and+CED-4+functions+in+developmental+and+radiation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis.</a> Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).</li>
<li>Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Apoptotic+caspase+activity+preferentially+targets+a+novel+consensus+sequence+associated+with+cytoskeletal+proteins+in+the+developing+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844(2022).</li>
</ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

カスパーゼとカスパーゼ機能に関する私たちの知識の大部分は、過去30年間のアポトーシスにおける激しい研究から得られています。イニシエーターカスパーゼがエフェクターカスパーゼをタンパク質分解的に処理することは非常によく確立されており、アポトーシス中に数百のタンパク質がエフェクターカスパーゼ基質として同定されています5,29。対照的に、非アポトーシスプロセスに対するカスパーゼの機能およびそれらが処理している非アポトーシス基質についてはほとんど知られていない。イニシエーターカスパーゼがここで重要な意思決定者であると考えられます。アポトーシスの間、それらはエフェクターカスパーゼを活性化し、細胞死を引き起こします。しかしながら、非アポトーシスプロセスを誘発するために、それらは非アポトーシスプロセスを制御する異なるタンパク質(エフェクターカスパーゼ以外)を活性化し得る。このプロトコルは、ショウジョウバエ17,30の開始カスパーゼDroncの基質として候補タンパク質をテストします。
切断アッセイにおいて試験される基質は、RRLなどの in vitro 哺乳動物無細胞発現系のいずれかで、または 大腸菌での組換え発現によって産生され得る。細菌発現よりもRRLを用いた インビトロ 発現にはいくつかの利点があります。RRL発現プロトコルはシンプルで高速であり、多くの異なる基質を並行して調製することができます。多くの場合、目的のタンパク質を含むRRL抽出物は、切断アッセイで使用する前に-80°Cで保存できます(ただし、これは基質ごとに個別に決定する必要があります)。推定基質はS35-Metで標識することができ、SDS-PAGE後のオートラジオグラフィーによる分析が容易である。これは、基質特異的抗体が利用できない場合に特に有用である。あるいは、S35−Met標識が望まない場合、推定基質をFlag、HA、またはMycタグなどの一般的なタグでタグ付けすることができ、これにより、イムノブロッティングによるカスパーゼ切断の検出が可能になります。
このプロトコルの成功は、組換えDroncおよびDriceタンパク質の慎重かつ一貫した精製にかかっていることを強く強調する必要があります。残念ながら、これらのタンパク質は、冷蔵庫にも冷凍も、短期間でも保存できません。それらは、保存された形で一晩で酵素活性を失います。したがって、それらは切断アッセイの日に新たに調製される必要がある。試験する候補タンパク質に関係なく、DriceC211Aは、Droncwt製剤の酵素活性を検証するためのポジティブコントロールとして常に使用する必要があります(図2B、Cを参照)。あるいは、DroncおよびDrice調製物の活性は、蛍光発生合成テトラペプチド基質2、9、31のインビトロ切断によっても試験することができる。
抗体が候補基質を検出するために使用される場合、それらはユーザ32、33によって検証される必要がある。これは、Flag、HA、Mycなどのエピトープタグを検出する市販の抗体にも当てはまります。抗体の質が悪いと、重要な結果が不明瞭になる可能性があります。異なるタグを持つN末端とC末端の両方で候補基質を二重エピトープタグ付けすることも推奨されます34。切断が発生した場合、二重タグ付けは両方の切断産物を追跡するのに役立ち、切断が1つ以上の部位で発生したかどうかを解明するのに役立つ可能性があります。
このプロトコルは、Droncの既知の生物学的基質であるDriceを簡単に検証できますが、制限もあります。1つの制限は、これが組換えタンパク質を用いた in vitro プロトコルであることである。これらのアッセイでは、カスパーゼは非生理学的に高濃度で存在し、これは大腸菌で自発的に自動処理できることの観察から明らかである 。 自発的な自動処理は、通常、生理学的条件下では発生しません。この高いカスパーゼ濃度は、偽陽性をもたらす偽活性を引き起こす可能性があります。偽陽性は、 in vitro 切断反応におけるカスパーゼ濃度を下げることによって排除することができる。さらに、以下でより詳細に概説するように、本物の基質を確認し、偽陽性を排除するために追加のアッセイが必要です。
組換えカスパーゼは、in vivoの通常の細胞環境におけるものと同じ特異性を有しない可能性がある。例えば、カスパーゼの活性は、翻訳後修飾によって修飾することができる。これらは組換えタンパク質には存在しません。さらに、生体内では、Droncをはじめとする開始剤カスパーゼがアポトソームなどの大きなタンパク質複合体に組み込まれる。このプロトコルの条件下では、アポトソームの形成は達成されない。それにはショウジョウバエApaf-1(別名ダークまたはHac-1)35-37の組換え発現が必要であり、独自の課題があります。したがって、インビトロでは、Droncはインビボで持っているのと同じ特異性を持たない可能性があります。
また、Droncは非アポトーシスプロセスのために異なるタンパク質複合体に組み込まれることも考えられる。これは、Droncに異なる切断特異性を与える可能性があり、これはDroncが非アポトーシス条件下でアポトーシスを誘導しない理由も説明できる可能性があります。これに関連して、CasCleaveは既知の切断コンセンサス部位を使用して、新しいカスパーゼ基質を予測する。しかし、同じ切断コンセンサス部位が非アポトーシスプロセスにも使用されるかどうかは不明です。実際、最近、カスパーゼ-3は、ニワトリ胚の発達中の聴覚脳幹における非アポトーシスプロセス中にその好ましいコンセンサス部位を変化させることが示された38。同様に、開始カスパーゼが異なるタンパク質複合体に組み込まれている場合、それらは異なる特異性を有する可能性があり、したがって異なるコンセンサス配列で切断され得る。
これらの制限は、このプロトコルに記載されるインビトロ切断アッセイのみに依存するだけでは十分ではないことを示しています。このプロトコルを使用して得られた結果をさらに検証するために、代替アプローチを採用する必要があります。理想的には、in vivoアッセイを使用して、以下の質問に対処する必要があります:候補タンパク質はin vivoでの非アポトーシスプロセス中にタンパク質分解的に処理されていますか?もしそうなら、同じ切断部位がインビボとインビトロで使用されますか?切断部位の突然変異誘発によって切断がブロックされた場合の結果は何ですか?候補基質の処理はカスパーゼに依存していますか、もしそうなら、どれですか?非アポトーシスプロセスに対する切断断片の役割は何ですか?これらの問題は、標準的な遺伝学的およびトランスジェニック法を用いて、C.エレガンスやショウジョウバエなどの遺伝子モデル生物で容易に対処することができる。
要約すると、このプロトコルは、酵素的に活性なカスパーゼ、特に ショウジョウバエ カスパーゼDroncおよびDriceを生成するための信頼性の高い一貫した方法を説明しています。このプロトコルの最終的な目標は、Droncが遺伝学的、生化学的、またはバイオインフォマティクスのアプローチによって同定された候補基質を in vitroで切断できるかどうかを調べることです。前の段落で説明したように、これらのタンパク質を in vivoでカスパーゼ基質として検証するには、追加のアッセイが必要です。後生動物全体のカスパーゼ遺伝子の保存の程度を考えると、このプロトコルを他の生物からのカスパーゼにも適応させることができるはずです。

プログラムされた細胞死またはアポトーシスは、カスパーゼと呼ばれる高度に特殊化された細胞死プロテアーゼのクラスによって実行されます(参考文献1でレビュー)。カスパーゼは、触媒部位にCys残基を含むCysプロテアーゼです。彼らはコンセンサス切断部位を定義し、Asp残基の後にタンパク質分解的に基質を切断します(ただし、ショウジョウバエカスパーゼDroncはGlu残基の後に切断することも報告されています2)。それらは、イニシエーター(頂端または上流としても知られている)およびエフェクター(実行者または下流)カスパーゼに細分される。イニシエータカスパーゼはエフェクターカスパーゼを活性化します。例えば、哺乳動物において、開始剤カスパーゼカスパーゼ−9は、エフェクターカスパーゼカスパーゼカスパーゼ−33を切断および活性化する。同様に、ショウジョウバエメラノガスターでは、カスパーゼ-9-オルソログドロンクがカスパーゼ-3-オルソログDrice 2,4を切断して活性化します。アポトーシスの間、エフェクターカスパーゼは何百もの基質を切断し、細胞の死をもたらす5。
カスパーゼは、細胞内で不活性なプロ酵素(チモーゲン)として合成されます。この形態では、N末端プロドメイン、プロ酵素の中央部に触媒Cysを持つ大きなサブユニット、C末端1に小さなサブユニットが含まれています(図1)。活性化のメカニズムは、開始剤カスパーゼとエフェクターカスパーゼで異なります。開始剤カスパーゼ(カスパーゼ-9、Dronc)は、活性化のために二量体化を必要とし、これはアポトソーム6と呼ばれる大きなタンパク質複合体への取り込みによって起こる。アポトソームへの組み込みのために、カスパーゼ-9とDroncはN末端プロドメインにカスパーゼ活性化および動員ドメイン(CARD)を持っています(図1)。アポトソーム成分Apaf-1にもCARDが含まれており、CARD/CARD相互作用を介してカスパーゼ-9またはDroncをアポトソーム3,6,7にリクルートします。カスパーゼ-9およびDroncはアポトソーム内でタンパク質分解的にプロセシングすることができるが、このプロセシングは酵素活性に完全には必要ではない8,9。
対照的に、エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ-3、Drice)は、そのプロドメインにCARDを持たず、活性化のために大きなタンパク質複合体に組み込まれません1。それらは、それぞれ活性カスパーゼ-9またはDronc1によるタンパク質分解切断に依存しています。活性エフェクターカスパーゼは、2つの大きなサブユニットと2つの小さなサブユニットで構成される四量体を形成し、2つの触媒部位を含みます(図1)。このプロトコルにとって重要なことは、大腸菌におけるカスパーゼの組換え発現は、Apaf-1の非存在下であっても、Drice 10およびDronc 2,8,9,11,12を含むカスパーゼの自動処理および活性化を引き起こす。この自動処理により、組換えカスパーゼタンパク質を用いた候補基質のin vitro切断アッセイを行うことができます。
カスパーゼはアポトーシスに関与するだけでなく、増殖、分化、細胞移動、神経細胞の剪定、自然免疫など、多くの非アポトーシス機能を持つこともできます13,14,15。現在、非アポトーシスプロセス中に活性カスパーゼを含むにもかかわらず、細胞がどのように生き残ることができるかは不明です。これらの細胞は、致死レベル16でのみカスパーゼを活性化するか、または原形質膜17,18などの細胞の非アポトーシス区画に活性カスパーゼを隔離する可能性があります。したがって、非アポトーシス基質の同定と検証は、カスパーゼが非アポトーシスプロセスをどのように媒介するかを明らかにするだけでなく、活性カスパーゼの存在下で細胞がどのように生き残ることができるかを理解するのにも役立ちます。
カスパーゼ基質としての候補タンパク質は、遺伝的および生化学的方法を用いて同定することができる。同定されたタンパク質は、コンセンサスDronc切断部位の存在について確認することができる。これは、タンパク質配列を視覚的に検査するか、CasCleave(https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20などのより洗練されたオンラインバイオインフォマティクスツールを使用することによって行うことができます。これらのツールは、カスパーゼの既知のコンセンサス切断部位と構造的考慮事項を使用して、カスパーゼの新しい標的を予測します。CasCleaveには、ヒトCaspases-1、-3、-6、-7、および-8からの検証済み基質の情報が組み込まれていますが、これらのカスパーゼとそのコンセンサス切断部位は十分に保存されているため、ここで説明する目的にも役立つ可能性があります。しかし、Dronc切断部位は明確に定義されていないため(2件の研究では、TATD/E 2とLALD9の2つの異なる最適な切断部位が特定された)、候補基質は、Driceを含む他のカスパーゼ切断部位の存在についても調べられている。
カスパーゼの予測基質を検証するには、追加のアッセイが必要です。これらのアッセイの1つは、所与のカスパーゼが実際にin vitroで候補タンパク質を切断できることの実証である。ここでは、 in vitro カスパーゼ切断アッセイのための便利なプロトコルを提供します。このプロトコルを使用して、候補基質はカスパーゼとしてDroncでテストされます。また、Driceの基板としてテストすることもできます。このプロトコルは ショウジョウバエ のカスパーゼDroncとDrice用に書かれていますが、他の生物のカスパーゼにも適応できます。
DroncおよびDriceの抽出および精製は、in vitro切断アッセイとともに、これらのカスパーゼによる触媒活性が失われるため、同じ日に実行する必要があります。このプロトコルは、以前の出版物8、9、11、12、21、22から変更および最適化されています。このプロトコルでは、4つの異なるカスパーゼタンパク質が大腸菌株BL21(DE3)pLysSで組換え発現されます。これらのタンパク質は、6xHis-Dronc wt、6xHis-Dronc C318A、6xHis-Dricewt、および6xHis-DriceC211Aです。これらの各タンパク質は、精製のためにN末端に6つのヒスチジン残基(6xHis)でタグ付けされています。Dronc wtおよびDricewtは野生型タンパク質であり、組換え発現時に活性カスパーゼに自動処理することができる。DroncC318AおよびDriceC211Aは、触媒Cys残基をAla残基に変更するDroncおよびDriceの変異型をコードする。これらのコンストラクトは触媒的に不活性であり、自動処理できません (図2Aを参照)。それらは切断アッセイのコントロールとして使用されます。DriceC211Aは自動処理できないため、ここで説明するin vitro切断アッセイにおけるDroncwtのモデル基質としても使用されます。

<table><tbody><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>抗His 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG、HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>抗Myc抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG、HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>#6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS Competent Cells</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>画像ソフトウェア付き</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II</td><td>化学発光イメージング用</td></tr><tr><td>化学発光基板</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>34095</td><td>化学発光イメージング用</td></tr><tr><td>切断ショウジョウバエ ICE (drICE) (Asp230) 抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てキュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14955128</td><td>細菌の増殖とタンパク質濃度の測定に使用</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ、1000 mL</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS49801L</td><td>LB寒天培地の調製およびオートクレーブ用</td></tr><tr><td>三角フラスコ、250 mL</td><td>ミリポアシグ</td><td>マCLS4980250</td><td>細菌培養の増殖と誘導用。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン-テトラ酢酸(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ゲルタンク SDS-PAGEシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Halt プロテアーゼ阻害剤カクテル (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&nbsp;</td><td>この研究</td><td>N/A</td><td>著者から入手可能</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&nbsp;</td><td>この研究</td><td>N/A</td><td>著者から入手可能</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&nbsp;</td><td>この研究</td><td>N/A</td><td>著者から入手可能</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&nbsp;</td><td>この研究</td><td>N/A</td><td>著者から入手可能</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル-&szlig;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天、ミラー (粉末)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス、ミラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr>リ<tr><td>ゾチーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>微生物プレートインキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティ</td>フィック<td>11-690-650D</td><td>形質転換後のコロニー増殖用</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、0.5mL</td>エ<td>ッペンドルフ</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、1.5mL</td>エ<td>ッペンドルフ</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Midiprepキット</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>ミニチューブローテーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-450-127</td><td>細菌溶解物とNi-NTAアガロースを混合するための</td></tr><tr><td>ミニプレップキット</td><td>キアゲン</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>電動ピペットコントローラー</td><td>ギルソン</td><td>F110120</td><td>血清ピペット使用のため</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 to 12%、Bis-Tris、1.0 mm、Midi Protein Gel、20ウェル</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー (4x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS RUNNING BUFFER (20x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>温度制御付きオービタル振盪インキュベーター</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>C25 インキュベーター シェーカー</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 100 mm x 15 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>プレーティングビーズ</td><td>Zymo research</td><td>S1001</td><td>AmpR/KanR プレートに培養を広げる</td></tr><tr><td>ポリプロピレンカラム (1 mL)</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Hisタグ付きタンパク質の精製用</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88863</td><td>RRL発現用クローニング基質用</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 mL ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>フィッシャー科学</td><td>352029</td><td>成長するプラスミド培養用</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>精製中にポリプロピレンカラムを保持するため</td></tr><tr><td>冷蔵高速遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アバンティ J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>プロメガ</td><td>N251A</td><td>RRL発現用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ファルコンチューブ、15 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ファルコンチューブ、50 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 血清ピペット、滅菌セル</td><td>トリート</td><td>229001B</td><td>50 mLチューブでの細菌細胞溶解用</td></tr><tr><td>TnT 結合網状赤血球溶解物 -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>Western wet transfer cassette</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>STM2001</tr></tbody></table>

インビトロ 基質スクリーニングのための精製組換え ショウジョウバエ カスパーゼを用いた切断アッセイ

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

カスパーゼは、アポトーシスおよび非アポトーシスプロセスに関与する非常に特異的な細胞死プロテアーゼです。アポトーシス中のカスパーゼの役割は非常に明確に定義されており、カスパーゼの多くのアポトーシスタンパク質分解基質が同定および特徴付けられていますが、非アポトーシスプロセスに対するカスパーゼの役割は十分に理解されていません。特に、カスパーゼの非アポトーシス基質はこれまでにほとんど同定されていない。ここでは、潜在的なカスパーゼ基質の同定および特徴付けを容易にするために、 インビトロでの カスパーゼ切断アッセイにおける候補基質の試験を可能にするプロトコルが記載されている。このプロトコルには、組換えカスパーゼタンパク質の生産と精製、組換えまたは無細胞発現系での候補基質の生産、および実際の in vitro 切断反応とそれに続くSDS-PAGEおよびイムノブロッティングが含まれます。このプロトコルは、 ショウジョウバエ のカスパーゼDroncとDriceに合わせて調整されていますが、哺乳類を含む他の生物のカスパーゼにも簡単に適応できます。

このプロトコルは、大腸菌におけるカスパーゼタンパク質誘導、組換えショウジョウバエカスパーゼDroncおよびDriceの精製、候補基質の合成、および候補基質(ここではDriceC211A)およびカスパーゼDroncとのin vitro切断反応のための段階的な指示を提供します。触媒変異体Drice C211Aは、自動処理活性を持たず(図2A)、Droncwtによって切断されるまで全長のままであるため、このアッセイのモデル基質として使用されました。DriceC211Aは、Droncwt製剤が酵素活性を有することを検証するためのポジティブコントロールとして常に使用する必要があります。
図2Aは、組換えカスパーゼの発現および精製の代表例を提供する。4つの異なる組換えカスパーゼが誘導および精製されました:6xHis-Droncwt、6xHis-DroncC318A、6xHis-Dricewt、および6xHis-Drice C211A。精製したカスパーゼをSDS-PAGEで実行し、イムノブロットし、抗His抗体(希釈1:5,000、続いて抗マウスIgG、HRP結合抗体(1:10,000))でブロットを調べました。未処理の6xHis-Dronc(proDronc)は55 kDaの相対分子量(MW r)で動作し(レーン2)、未処理の6xHis-Drice(proDrice)のMWrは35 kDa(レーン4)です。カスパーゼの自動処理は、N末端にHisタグが存在するためにカスパーゼの大きなサブユニットを表す小さなMWrのバンドの出現によって見ることができます(図1)。6x-Droncの場合、大きなサブユニットのMWrは40 kDa(レーン1)です。6x-Driceの大きなサブユニットは23 kDa(レーン3)で動作します。触媒変異体6xHis-DroncC318Aおよび6xHis-DriceC211Aは自動処理に失敗し、完全長タンパク質としてのみ検出可能です(レーン2および4)。
図 2B細菌で産生および精製された6xHis−Droncwt調製物が酵素活性を有することを実証するために、このプロトコルに記載されるようなインビトロ切断アッセイを実施した。陰性対照として、触媒変異体6xHis-DroncC318Aを用いた。基板はRRLで生成されたN-Myc-DriceC211Aであり、N末端にMycタグがタグ付けされている。インビトロ切断反応後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、イムノブロットし、抗Myc抗体(1:1,000に希釈)とブロットをインキュベートし、続いて抗マウスIgG、HRP結合抗体(1:10,000))でインキュベートしてN-Myc-DriceC211Aを検出しました。カスパーゼの切断の成功、したがって酵素活性は、全長の未処理の基質と比較して、より小さいMWrの少なくとも1つのバンドの出現によって実証することができる。未処理の全長N-Myc-Drice C211AのMWrは40 kDa(レーン2および4)ですが、処理済みのN-Myc-DriceC211Aの大きなサブユニットは30 kDa(レーン3)で動作します。レーン1は、プログラムされていないRRLライセート(プラスミド/転写産物は追加されていない)を表します。レーン2は、RRL発現によるDriceC211Aのインビトロ産生を実証する。レーン3は、6xHis-Droncwtによるインビトロ切断反応を含む。レーン4には、6xHis-DroncC318Aとのインビトロ切断反応が含まれています。
図 2Cこのプロトコルに従って、組換えおよび精製カスパーゼ(6xHis-Droncwtおよび6x-His-DroncC318A)および基質(6xHis-DriceC211A)の両方を使用するin vitro切断反応を、SDS-PAGEおよびイムノブロットによって分析した。切断反応の分析には、抗切断Drice抗体(1:5,000に希釈、続いて抗ウサギIgG、HRP結合抗体(1:10,000))をこのイムノブロットに使用しました。抗切断されたDrice抗体は、6xHis-DriceC211Aの大きなサブユニット(23 kDa)でそのネオエピトープを検出します 6xHis-Droncwt(レーン1)による処理後。触媒変異体6xHis-DronC318Aは、このアッセイでは6xHis-Drice C211Aを処理できず、全長6xHis-DriceC211Aは35 kDaのかすかな未処理バンドとして現れます(レーン2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg"> 図1:イニシエータカスパーゼカスパーゼ-9およびドロンクおよびエフェクターカスパーゼ-3およびドライスのドメイン構造。 カード - カスパーゼ活性化および募集ドメイン。Cys - 触媒システイン残基の相対位置;L - 大きなサブユニット。S - 小さなサブユニット。N末端プロドメインの位置が示される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg"> 図2:代表的な結果。 (A)抗His抗体でプローブした精製組換え6xHis-Droncおよび6xHis-Drice調製物のイムノブロット分析。未処理(プロドロンクとプロドリス)と切断された6xHis-Droncと6xHis-Driceは矢印で示されます。MWマーカーは左側に示されています。(B)抗Myc抗体でプローブしたカスパーゼ6xHis-Droncwt(レーン3)または6x-His-DroncC318A(レーン4)を使用したRRL生成N-Myc-Driceのin vitro切断反応のイムノブロット分析。プログラムされていない(N-Myc-DriceC211A)RRL反応は、レーン1と2でロードされ、分離されます。未処理(プロドリス)および切断されたN-Myc-Driceは矢印で示されています。MWマーカーは左側に示されています。(C)細菌で発現および精製された組換え6xHis-Drice C211Aとカスパーゼ6xHis-Droncwt(レーン1)または6x-His-DroncC318A(レーン2)のin vitro切断反応のイムノブロット分析、抗切断Drice抗体でプローブ。全長(proDrice)および切断された6xHis-DriceC211Aは矢印で示されています。MWマーカーは左側に示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
附則表1 この表には、pET28aベクターのクローニングに使用されるプライマーが含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
附則表2 この表には、バッファーとメディアの構成が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、組換え ショウジョウバエ カスパーゼDroncおよびDriceを発現および精製するためのプロトコル、および in vitro 切断アッセイにおけるそれらの使用を紹介します。

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

カスパーゼは、アポトーシスおよび非アポトーシスプロセス中に基質を切断するシステインプロテアーゼです。このプロトコルは、ショウジョウバエ由来の開始カスパーゼDroncの推定基質を同定するためのインビトロ切断アッセイを記載している。注意深く従えば、このプロトコルは、カスパーゼDroncまたは他のカスパーゼの推定基質のハイスループットスクリーニングのための信頼できる手順を提供します。このプロトコルは、ショウジョウバエカスパーゼDroncを使用したin vitro切断アッセイ用に設計されていますが、哺乳類を含む他の生物からのカスパーゼにも簡単に適合させることができます。組換えカスパーゼの精製とin vitro切断アッセイは、これらのカスパーゼ調製物が酵素活性を急速に失うため、同じ日に実施することが重要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるプラティバ・ヤリキパティ博士です。まず、マイナス80°Cの貯蔵庫からペレット培養物を入れた凍結チューブを取り出し、氷上に10分間保持してペレットを柔らかくします。10分後、1ミリリットルの血清学的ピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤、リゾチーム1ミリリットルあたり10ミリグラム、およびベンゾナーゼ1ミリリットルあたり50単位を添加した0.6ミリリットルの細菌細胞溶解バッファーをペレット含有チューブに加えます。同じピペットチップで、ペレット粒子のない透明で淡黄色の溶液が見えるまで上下にピペッティングしてペレットを溶解し、氷上で30分間インキュベートします。ライセートを適切な遠心チューブに移し、摂氏4度で40分間17, 000 Gで遠心分離します。上清をカスパーゼを含む粗抽出物である1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、チューブを氷上に置きます。カスパーゼ抽出物の各チューブにニトリロ酢酸アガロースの50%スラリー0.2ミリリットルを加え、摂氏4度で1時間、エンドオンエンドローテーター上でチューブを回転させます。1時間後、Ni-ニトリロ酢酸アガロースを含む抽出物を、先端をそのままにして1ミリリットルのポリプロピレンカラムに加え、ラックに入れ、5分間静置してNi-ニトリロ酢酸アガロースを沈降させます。5分後、カラムのキャップを外し、上澄み液を重力流で流出させます。次に、Ni-ニトリロ酢酸アガロースの充填樹脂を乱すことなく、1ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに慎重に添加し、重力流で洗浄します。カスパーゼを溶出するには、洗浄バッファーを完全に排出した後、1.5ミリリットルの微量遠心チューブをカラムの収集ノズルの下に置きます。次に、各カラムに0.5ミリリットルの溶出バッファーを加え、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに溶離液を回収します。溶離液を氷上に保ち、ブラッドフォードアッセイでタンパク質の濃度を測定します。推定基質の発現レベルに応じて、切断アッセイで目的のタンパク質でプログラムされた1〜10マイクロリットルのウサギ網状赤血球ライセートを使用し、氷上に保ちます。以前に生成した精製カスパーゼタンパク質を10マイクログラム加え、カスパーゼアッセイバッファーで総反応量を50マイクロリットルにします。反応物を摂氏30度のウォーターバスで3時間インキュベートし、切断アッセイに適切なコントロールが含まれるようにします。3時間後、チューブを氷上に移して反応を停止し、50ミリモルDTTを含むLDSサンプルバッファーを1容量加えます。サンプルをヒートブロックで摂氏75度で10分間インキュベートします。すばやく回転し、フリックして混合し、サンプルあたり24マイクロリットルをロードし、SDSページを実行するか、サンプルを摂氏マイナス20度で保管します。4つの異なる組換えカスパーゼを誘導し、精製し、SDS-PAGEで分析し、イムノブロットし、ブロットを抗ヒスチジン抗体でプローブしました。未処理の6x-ヒスチジンDroncは55キロダルトンの相対分子量で動作し、未処理の6x-HisDRYEの分子量は35キロダルトンです。カスパーゼの自動処理は、より小さな分子量のバンドの出現によって見える。切断されたドロンクの場合、それは40キロダルトンのバンドです。劈開されたドリスの場合、それは23キロダルトンのバンドです。in vitro切断反応後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、イムノブロットし、ブロットを抗Myc抗体とともにインキュベートして、アミノ末端MycタグDrice C211Aを検出しました。結果は、細菌で生産および精製された6x-ヒスチジンDronc野生型製剤が酵素活性を有することを実証した。これは、切断されたプロドリスと比較して、切断されたドライスのバンドが小さいことによって明らかになります。組換えカスパーゼと基質の両方を使用するin vitro切断反応をSDS-PAGEとイムノブロットで分析しました。切断反応の分析のために、抗切断Drice抗体をこのイムノブロットに使用した。結果は、細菌で生産および精製された6x-HisDronc調製物が酵素活性を有することを実証した。これは、切断されたプロドリスと比較して、切断されたドライスのバンドが小さいことによって明らかになります。組換えカスパーゼは酵素活性を急速に失うことを忘れないでください。マイナス80°Cでも保管できません。インビトロ切断アッセイは、同じ日に実施する必要があります。in vitro切断アッセイにおける陽性ヒットは、in vivoで検証する必要があります。これは、細胞またはショウジョウバエやC.エレガンスなどの遺伝子モデル生物で行うことができます。

in-vitro-cleavage-assays-using-purified-recombinant-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の"フィレット"の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。...

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

このビデオでは、CRISPR-Cas9を使用してゲノムを改変したトランスジェニックショウジョウバエを特定するためのスクリーニング方法を説明しています。CRISPR-Cas9は、科学者が生物のゲノムを操作する方法に革命をもたらした強力なゲノム編集ツールです。このプロトコル例では、トランス活性化配列の挿入によりブランチレス(bnl)遺伝子の最初のエクソンが置き換えられ、bnl遺伝子特異的なドライバーラインであるbnl-LexAが作られる、CRISPRで生成された変異体を同定する方法を見ていきます。...

ゲノム修飾のスクリーニング:ショウジョウバエのCRISPR生成変異体を同定する方法

ショウジョウバエ胚への小分子の導入は、新規化合物、薬物、および毒素の生物学的活性を特徴づけるだけでなく、根本的な発生経路を探査するための大きな可能性を提供しています。本明細書に記載される方法は、 ショウジョウバエ胚モデルの有用性を拡大し、このアプローチには自然な障壁を克服する手順の概要を説明します。...

の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。...

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。...

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。...

アポトーシス細胞の食作用アッセイショウジョウバエ胚

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。...

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

ショウジョウバエは、がん治療の潜在的な用途を有する薬剤のスクリーニングに適した広く使用されている実験モデルです。ここでは、ヘテロクロマチン形成を促進する低分子化合物をスクリーニングする方法としてショウジョウバエ可変眼色表現型を用いるものについて述べている。...

ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬の同定のためのスクリーニング方法

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

学ぶ、精製組換えショウジョウバエカスパーゼDroncとDriceを用いたインビトロ切断アッセイによる基質スクリーニング法。このプロトコルは、カスパーゼ基質の高通量解析と細胞死メカニズムの解明に有用です。

インビトロ基質スクリーニングのための精製組換えショウジョウバエカスパーゼを用いた切断アッセイ

さらに動画を探す

インビトロ 基質スクリーニングのための精製組換え ショウジョウバエ カスパーゼを用いた切断アッセイ

さらに動画を探す

インビトロ基質スクリーニングのための精製組換えショウジョウバエカスパーゼを用いた切断アッセイ