Name: 単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ成人ヒト一次心筋細胞の収縮性測定法。MyoBLAZERシステムを用いた非侵襲的な光学記録により、薬剤誘導性収縮変化をリアルタイムで評価し、心不全治療薬の前臨床開発を支援します。

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この研究は、AnaBios CorporationとNIH Small Business Innovation Research(SBIR)の助成金(1R44TR003162-01)の支援を受けました。

すべての方法は、関連するガイドラインと規制に従って実施されました。研究に使用されたすべてのヒトの心臓は移植不可能であり、米国(US)の死体臓器提供者からのインフォームド・リーガル・コンセント(本人または近親者)によって倫理的に入手された。回復プロトコルと in vitro 実験は、米国臓器調達移植ネットワーク(OPTN)内の移植センターの治験審査委員会(IRB)によって事前承認されました。さらに、ドナーの心臓のすべての移植は完全に追跡可能であり、米国連邦当局によって定期的に見直されます。
注意: このプロトコルの実行中は、適切な個人用保護具(実験室用コート、安全メガネ、手袋など)の着用を含む、必要なすべての安全手順を適用してください。
1.心筋細胞の単離(収縮性測定の1日前)
<ol><li>ドナーの心臓は、実験室に到着したらすぐに氷冷した独自の心臓麻痺溶液6で再灌流し、脳室から酵素的に成人のヒト一次筋細胞を分離します11、12、13、14、15。</li>
	<li>次いで、心筋細胞を懸濁液中に維持し、10mLの溶液A(110mMスクロース、0.005mMCaCl2、3mMMgCl2、70mMKOH、60mMラクトビオン酸、10mMKH2PO4、20mMタウリン、20mML-ヒスチジン、20mMHEPES、2mML-グルタミン酸、2mML-(-)-リンゴ酸、 pH 7.4 with KOH)を20 mLウィートンバイアル(材料表)に入れ、実験的に調べるまで冷蔵温度で加熱します。 注:バイアルごとに200,000個の細胞を保管してください。</li>
</ol>2.ラミニンコーティングの準備(収縮性を測定する1日前)
<ol><li>ガラスカバーガラス1枚(25 mm x 25 mm角、材料表)を8ウェル培養プレートの各ウェルに置きます(材料表)。</li>
	<li>次に、カバーガラスを5 μg/mLの濃度のラミニンでコーティングします。これを行うには、800 μL のヒト組換えラミニン 521 ストック(材料表、-20°C で保存)を 7.2 mL の溶液 B (145 mM NaCl、4 mM KCl、2.5 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、11.1 mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.4 with NaOH) に加え、よく混合します。</li>
	<li>希釈したラミニン溶液200 μLを各カバーガラスの中央に滴下します。次に、プレートに蓋をして、4°Cの冷蔵庫に積み重ねます。 注:ラミニンでコーティングされたカバーガラスが十分にあることを確認するために、複数の8ウェル培養プレートを準備します。</li>
</ol>3.Ca2+耐性心筋細胞の調製(収縮性測定当日)
<ol><li>冷蔵庫から細胞のバイアルを取り出し、バイアルから溶液Aを吸引し、冷蔵した10 mLの溶液Bを加えます。 注:細胞が吸引されていないことを確認し、バイアル壁の上部の内側にピペットを置いて、溶液Bをバイアルに分散させます。</li>
	<li>細胞のバイアルに蓋をし、静かに渦を巻いて、細胞が溶液B全体に分散するようにします。最後に、細胞を室温(RT)で1時間沈降させます。</li>
</ol>4.記録システムの準備(収縮性測定当日)
注:記録システムには、温度制御ボックス、刺激装置、コンピューター制御の圧力駆動灌流、圧力駆動灌流ボトル、関心領域(ROI)の選択と収縮性過渡現象の表示を可能にする社内取得ソフトウェア、倒立顕微鏡、細胞チャンバー、およびカメラが含まれています(図1)。
<ol><li>吸引真空システムをオンにします。次に、顕微鏡カバーを取り外して電源を入れ、カメラを接続し(材料表、 図1)、最後にファンがオンになっていることを確認して、カメラが過熱しないようにします。</li>
	<li>次に、顕微鏡加熱プレート(材料表)と温度制御ボックス(材料表、図1)の電源を入れ、適切な動作温度に設定します。次に、電界刺激装置(材料表、図1)と圧力システムをオンにします。最後に、溶液のチューブ(材料表)を記録チャンバー(材料表、図1)に接続します。</li>
</ol>5. 試験化合物の調製(収縮性測定当日)
<ol><li>希薄ジメチルスルホキシド(DMSO;資料表)溶液C(145 mM NaCl、4 mM KCl、1.8 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、11.1 mMグルコース、10 mM HEPES、pH 7.4、NaOH)中で1,000倍して、0.1% DMSOビヒクル溶液を作製します。</li>
	<li>治療曝露量0.001 μMの1倍、10倍、100倍、1000倍で化合物を試験するには、試験化合物を1 mMの濃度でDMSOに溶解します。</li>
	<li>この溶液をDMSOで段階的に希釈し、さらに3つのDMSOストック(例:0.001 mM、0.01 mM、0.1 mM)を生成します。最後に、各試験化合物ストックを100 mLの溶液Cで1,000倍に希釈して、最終試験濃度(0.001 μM、0.01 μM、0.1 μM、および1 μM)を取得します。</li>
	<li>ビヒクル溶液と化合物の最終マイクロモル濃度の溶液を 100 mL のガラスボトルに添加し(材料表、図 1)、ボトルを圧力駆動灌流システムに接続します(材料表、図 1)。 </li>
	<li>次に、200〜300 mbarの圧力を使用してコンピューター駆動プログラム(材料表)で灌流システムをプライミングし、1.8 mL / minの速度で一定の灌流流量を供給します。 注:試験化合物が溶解性の問題に関連していることが判明した場合は、実験を行わないでください。また、細胞への実験的適用の30分以内に原液から化合物試験溶液を調製します。</li>
</ol>6.心筋細胞のプレーティング(収縮性測定当日)
<ol><li>ラミニンコーティングされたカバーガラスが入った8ウェルプレートを4°Cの冷蔵庫から取り出し、1枚のカバーガラスを非常によく洗浄された記録チャンバーに慎重に置きます(図1)。次に、8ウェルプレートを4°Cの冷蔵庫に戻して、次のメッキを行います。 注意: 糸くずの出ないワイプ(材料表)を使用して、カバーガラスをラミニンの薄層でコーティングしたまま、コーティングされたカバーガラスを拭き取ります。また、使用済みのカバーガラスは必ず鋭利な容器に廃棄してください。</li>
	<li>次に、エスカレートした細胞のバイアルを取り出し(ステップ3.2)、バイアルから溶液Bを吸引して、細胞を失わずにできるだけ小さな容量(~200 μL)に到達します。次に、200μLの細胞を倒立顕微鏡のステージに取り付けた記録顕微鏡チャンバーに分注します(材料表)。</li>
	<li>細胞をカバーガラスに5分間沈殿させます。細胞が完全に沈殿するのを待っている間に、顕微鏡で視野を開き、細胞密度が実験を開始するのに十分(~70%)であるかどうかを判断します。 注:200 μLを超える分注を行う場合は、吸引によってすべての細胞が吸引されないようにしてください。</li>
</ol>7.心筋細胞の収縮性の記録
<ol><li>めっき終了後、圧力駆動灌流システム(材料表)を用いて溶液Cと連続的に灌流することにより、セルを5分間平衡化します。吸引を正しく調整し、温度制御ボックスと加熱プレートの両方をオンにして、~35°Cになるように設定します。</li>
	<li>次に、1Hzのペーシング周波数(3msのバイポーラパルス)で、電界刺激装置に接続されたチャンバーの反対側に配置された一対の白金線を使用して、電界刺激装置で超閾値電圧で細胞を刺激します。</li>
	<li>刺激パルスの振幅を1Vに設定し、心筋細胞が収縮-緩和サイクルを生成し始めるまで振幅を上げます。実験全体で 1.5 倍のしきい値を使用します。 注:棒状の形態と明確な縞模様を持つ健康な細胞を選択してください。次に、視野を調整し、できるだけ多くの収縮セルを視野に入れることに焦点を合わせます(図2A)。</li>
	<li>次に、細胞のデジタル化された画像を光収縮記録システムの取得ソフトウェアに表示します。このソフトウェアは、150 FPSの高解像度、高フレームレートのカメラ(材料表、 図1)を使用して、同じフレームに複数の筋細胞を含むビデオストリームを記録します。 注:これにより、複数の健康な筋細胞のサルコメア動態を同時に捕捉および測定するのに十分な時間的および空間的分解能が得られます。最新の高コア数プロセッサは、ビデオストリームからのサルコメア長の変化をリアルタイムで並列計算するために活用されています(光学濃度データは、健康な心筋細胞の画像上に配置され、収縮軸に平行に配置されたユーザー定義の関心領域(ROI)から収集されます( 図2B)。光強度データは、心筋細胞のZ線に対応する明るいバンドと暗いバンドを示しています(図1、 図2C)。最後に、これらのデータは監視目的でユーザーに表示され、後で分析するためにディスクに保存されます(図2C)。<ol><li>焦点が合っていないセルの領域は避けてください。また、薬剤の適用中に細胞の収縮が変化すると、ROIが細胞の収縮を読み取れなくなる可能性があるため、ROIを細胞の端の近くに配置しないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>ROIの選択が完了し、収縮が使用に必要な基準を満たしている場合(例:サルコメア短縮>1%、1Hzのペーシング周波数を適用した場合のリズミカル収縮、不整脈イベントの欠如)、実験を開始して化合物の効果を評価します。刺激プロトコルと化合物の試験濃度の適用順序を 表1に示します。取得ソフトウェアは、データの取得と表示、および検査濃度と処理時間のラベル付けを自動的に管理します。 注意: 収縮がベースライン車両期間全体を通じて安定した振幅にとどまる場合は、テスト濃度を適用します。ランナップまたはランダウンのいずれかを表示しているセルを失格にします。</li> また、実験全体を通して、灌流が異なる試験濃度に切り替わっていることを確認してください。
	<li>実験とサーバーへのデータ保存が完了したら、灌流とヒーターのスイッチを切り、刺激を停止し、顕微鏡チャンバーを蒸留水で洗浄し、ガラスカバーガラスを取り外し、チャンバーを完全に乾燥させます。 注:チャンバーを完全に洗浄することは、次の細胞セットを早期に化合物に曝露して収集したデータを無効にすることを避けるために重要です。</li>
	<li>次に、心筋細胞の新しいめっきを行い、化合物の試験を完了するか、新しい化合物を試験するのに十分なデータを得るために追加の実験を行います。</li>
</ol>8.光収縮性記録システムをオフにする
<ol><li>化合物の毎日の試験が完了したら、まずシステムの洗浄に必要のないすべての機器の電源を切り、オフライン分析のためにデータをコピーします。</li>
	<li>次に、最終試験濃度の溶液が入った100 mLのガラス瓶(材料表)を取り出し、RBS 25濃縮液(材料表)で半分満たされたガラス瓶と交換します。RBS溶液を顕微鏡チャンバーに5分間通した後、チャンバーから灌流チューブを外し、蒸留水で洗浄し、最後に完全に乾燥させます。 注意: フラッディングを防ぐために、バキュームがうまく機能していることを確認してください。</li>
	<li>次に、灌流チューブをドレナージチューブに接続します。圧力駆動灌流システムのソフトウェア(材料表)を使用して、圧力と流量が適切に設定されていることを確認しながら、RBS溶液を10分間実行します。次に、1%DMSOを5分間灌流し、次に蒸留水を15〜20分間灌流して、灌流システムの洗浄を完了します。</li>
	<li>顕微鏡のライトを消し、カバーをかぶせます。次に、顕微鏡の側面にあるボックスからカメラワイヤーを抜き、ファンの電源を切ります。使用済みのすべてのボトルが洗浄とオートクレーブのために送られていることを確認してください。最後に、すべての排水バケットが1/4以下であることを確認します。 注意: 翌日に使用するのに十分なラミニンコーティングされたカバーガラスがあることを確認してください。</li>
	<li>最後に、各記録システムで行われたすべての実験の取得フォルダ内のファイルをコピーし、安全なバックアップサーバーに貼り付けて、オフラインでさらに分析します。次に、取得フォルダからすべてのデータファイルを削除します。</li>
</ol>9. 収縮性データの解析
<ol><li>解析ソフトウェアとカスタムメイドのマクロを使用してオフライン解析を実行し、データを平均化します。解析ソフトウェアは、取得ソフトウェアによって生成されたサルコメアダイナミクスデータからさまざまなメトリックを計算して報告します。これらのパラメータの詳細なリストを 図2Dに示します。 注:低レベルのソフトウェア技術を適用すると、多くの記録の実行を5秒で分析できます。薬物誘発性の収縮性の変化を評価するための主要なパラメータは、収縮性の振幅です(サルコメア短縮%=サルコメア長の変化)。これは、ピーク収縮/静止時のサルコメア長として計算され、各テスト濃度の最後の 20 回の収縮性過渡現象で平均化されます。</li>
	<li>各心筋細胞の特定のベースラインビヒクル制御条件に対する平均収縮性振幅に対する試験化合物の影響を定量化します。</li>
	<li>平均結果をSEM±平均として表し、収縮性振幅に対する試験化合物の濃度効果をプロットしたグラフを作成します。次に、解析ソフトウェア(材料表)を用いて濃度-応答曲線をHill式に当てはめ、IC50(収縮振幅を50%抑制する濃度)とEC50(収縮振幅を50%増加させる濃度)の値を導き出します。</li>
	<li>収縮性の振幅に加えて、他のパラメータも計算できます。<ol><li>後収縮:後収縮を、次の通常の収縮の前に発生し、異常で同期されていない収縮を引き起こす心筋細胞の自発的な二次収縮の一過性として識別します。</li>
		<li>収縮障害:収縮障害を、電気刺激が収縮を誘発できないことと特定します。</li>
		<li>短期変動 (STV) と代替: 収縮振幅変動のポアンカレ線図でこれら 2 つのパラメーターを可視化します。<ol><li>STV (∑|CAn + 1 − CAn|(20× √2)−1)各コントロールおよびテスト物の濃縮期間の最後の20回のトランジェント。オルタナンを、短い収縮と長い収縮性の振幅トランジェントを交互に繰り返すものとして識別します。</li>
			<li>不整脈誘発性の発生率を計算するには、STV値を各細胞のビヒクル制御値に正規化し、収縮後、収縮不全、STV、およびオルタナンをプロットし、各シグナルを示す細胞の発生率の%として表します。</li>
		</ol></li>
		<li>時間 Ato ピーク、30% 緩和までの減衰 (Decay 30)、90% 緩和までの減衰 (Decay 90)、90% 緩和までの時間 (TR90) (図 2D)、ベースライン サルコメア長、50% ピークまでの時間、ピーク高さ、ピーク収縮性におけるサルコメア長、最大収縮速度、および最大緩和速度12 の計算を使用して、マルチパラメトリック機構プロファイリングを完了します。.収縮性の振幅と同様に、これらのパラメータを各心筋細胞の特定のベースラインコントロール条件に関連させて表し、濃度応答プロットにグラフ化します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

すべての著者はAnaBios Corporationの従業員であり、競合する利害関係がないことを宣言します。

この原稿は、新規化合物の急性有効性と心毒性の試験を可能にする簡略化されたミディアムスループット法のための、成人ヒト心筋細胞収縮性ベースの光学系の詳細なプロトコルを提供します。この光収縮性記録システムは使いやすく、複数の細胞からの並列記録を可能にし、細胞の健康状態、生理学、薬理学の同時評価を可能にし、自動化された迅速なデータ解析(複数の細胞の実行を5秒で分析)を備えており、迅速なデータ収集(30分/化合物/デバイスごとの濃度反応曲線)を可能にします。これらの特性を考慮すると、記録システムは、心筋細胞の収縮性に対する薬物の影響を検出するだけでなく、創薬の初期段階における創薬化学の取り組みをサポートするための構造活性相関データを提供するためにも使用できます16。心筋細胞単離プロトコルから数千万の細胞を得ることができるため、現在、光収縮性記録システム-心筋細胞プラットフォームの適用が検討されており、低コストで検査能力の向上(ウェルベースのプレートを使用)を達成しています。さらに、記録システムで測定された収縮期および弛緩パラメータに対する薬物効果の評価は、変力性薬物のマルチパラメトリックな機構プロファイリングを提供することができる12。さらに、心筋細胞の収縮性データを使用して、新薬を心毒性が最も高いものから最も低いもの(安全マージンなど)および最も有効性の低いもの(力価マージンなど)にランク付けできます。心筋の収縮性の臨床的低下と関連している開発プログラムを支援するために、フォローアップの心筋細胞収縮性研究を実施することもできます12。
ヒト心筋細胞収縮性光学記録システムを使用するもう一つの大きな利点は、製薬業界におけるデータ生成のための動物の使用を回避または代替する代替方法と見なすことができるため、3R(置換、縮小、精緻化)17 との整合性です。この3Rの利点は、学術的な心臓研究にも拡張できます。心筋細胞の生理学と薬理学に関する現在の知識のすべては、動物の心臓から分離された細胞で行われた学術研究から来ています18。このように、ヒト心筋細胞の光学的収縮性モデルは、重要なトランスレーショナル研究の可能性を開きます。これらの研究を実施するには、ヒト成人心筋細胞の保存と輸送のためのプロトコルを開発する必要があり(現在、AnaBiosの研究室で評価中)、収縮性システムは、非ヒト心筋細胞からのサルコメア長の変化を記録する能力を持っている必要があります(これは、サルコメアが種間でよく保存されているため、光学的収縮性記録システムの場合です)。
ヒト心筋細胞収縮システムは、いくつかの生理学的条件(例えば、電気機械結合、心拍数を模倣したペーシング周波数、体温、すべてのヒト心臓標的の統合)をエミュレートすることができ、創薬における重要な要素としての翻訳価値を実証しています11,12,13,14ただし、心臓の収縮周期中に見られる機械的負荷とせん断応力の変化を模倣することはできません。心臓の細胞外マトリックスの構造と機能は、現在、よりよく理解されており19、そのようなマトリックスの開発は、機械的負荷の制限を克服するのに役立つ可能性があり、現在、AnaBiosの研究室で、異なる心臓のような硬さを持つマトリックスが評価されています。ヒト心筋細胞の光学的収縮性のシステムのもう一つの限界は、心臓に供給する神経のネットワーク(例えば、交感神経線維および副交感神経線維)の欠如である20。この神経と心臓の接触は、神経伝達物質(例、βアドレナリン受容体のアゴニストであるイソプロテレノール、M2ムスカリン受容体のアゴニストであるアセチルコリン)の併用によって再確立でき、この化合物は心筋細胞の収縮性に対する潜在的な効果について評価されます。さらに、収縮性トランジェントは、活動電位とCa2+トランジェントの同時測定なしで記録され、心電図やCa2+ハンドリングに対する薬物効果を評価する際にも不可欠です。この省略はシステムの限界と見なすことができますが、活動電位信号(電流クランプ法または電圧感受性色素による)およびCa2+過渡現象(Ca2+インジケーター/色素による)の記録は細胞毒性と関連している可能性があるため、それほど重要ではありません。このような細胞毒性作用は、心臓の収縮性を調節する新薬の評価に影響を与える可能性があります。それどころか、心筋細胞の健康、生理機能、および薬理学を維持する非侵襲的な光学的方法の使用は、このプロトコルに記載されている記録システムのように、最高品質の収縮性データが得られることを保証するだけでなく、ヒトにおける新薬の収縮効果をよく予測できるデータも提供します。

心筋の自然な収縮能力を表す心筋収縮性(異方性)は、心機能の重要な特性であり、電気機械的結合のダイナミクスに依存します。心筋収縮性の薬物誘発性の変化は、心臓病(例えば、心不全)を治療するために望まれ、心毒性の文脈では求められていない(例えば、左心室駆出率の低下)。したがって、前臨床収縮性モデルは、新薬が臨床開発中に成功できるようにするために、正確な予測性と関連付ける必要があります。しかし、還元主義的な人工細胞モデル(例えば、特定の心臓標的を過剰発現する遺伝子操作された不死化細胞株)および非ヒト動物モデルに依存する現在の前臨床戦略は、重大な限界を示しており、高い薬物減少率(すなわち、高い偽シグナル率)と関連していることがわかっています1,2,3,4。.したがって、ヒトにおける薬物転帰を予測し、新しい治療法の発売を加速させるためには、高出力(すなわち、高率の真のシグナル)に関連する、新しく信頼性の高いヒト細胞の心臓収縮性モデルを確立することが不可欠です5。
研究6,7,8,9,10および心筋細胞分離技術11,12,13,14,15のためにヒトドナー心臓を回収するために最近確立された画期的な方法は、前臨床開発中にヒトベースの研究を実施するためのユニークな機会を提供しました。この目的のために、成人のヒト初代心筋細胞は、ヒトの心臓収縮性における薬物誘発性の変化を評価する上ですでに有用性を示しています11,12,13,14。本稿では、成人のヒト心筋細胞における新規化合物の収縮性効果を調査するためのプロトコルについて詳述しています。

<table><tbody><tr><td>100&ndash;1000 &マイクロ;L フィルター、ワイドオリフィス、滅菌チップ</td><td>ピペット</td><td>UF-1000W</td><td></td></tr><tr><td>100 mL、デュラン圧力プラスボトル</td><td>DWK ライフサイエンス</td><td>218102406</td><td></td></tr><tr><td>1 L、0.22 &micro;m 真空フィルター システム</td><td>VWR</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>290 mmol/kg 浸透圧 標準</td><td>Wescor</td><td>OA-029</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ pH メーター</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>カメラ&nbsp;</td><td>Optronis GmbH</td><td>Cyclone-25-150-M</td><td></td></tr> <tr><td>https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass</td><td>Corning</td><td>2845-25</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone-25-150</td><td>Optronis</td><td></td><td>https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/</td></tr> <tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>デジタルタイマー/ストップウォッチ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>8ウェル長方形ポリスチレン滅菌培養プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>73521-426</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific</td></tr><tr><td>FHD 顕微鏡チャンバーシステム</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow EZ、コンピュータ駆動プログラムバージョン1.1.0.0を搭載したモジュール式圧力ベースのフローコントローラ。</td><td>Fluigent OxyGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘビーデューティー真空ボトルVWR</td><td></td><td>16211-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LM521-05</td><td></td></tr><tr><td>Idexクロマトグラフィーチューブ、天然FEP、1/16 "OD x 0.030" ID</td><td>Cole-Palmer</td><td>1520L</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtechサイエンス Kimwipes</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112577</td><td></td></tr><tr><td>ラクトビオン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49449</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 温度制御 ステージウォーマー</td><td>AmScope</td><td>TCS-100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer フィールドスティミュレーター</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc 長方形ディッシュ</td><td>Thermo Scientific</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 顕微鏡&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE</td></tr><tr><td>pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards</td><td>Oakton</td><td>WD-05942-10</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Prism ソフトウェア</td><td>GraphPad ソフトウェア - Dotmatics</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.graphpad.com/ RBS 25 液体洗剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83460</td><td></td></tr><tr><td>シャープス コンテナ</td><td>Uline</td><td>S-15307</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot 解析ソフトウェア</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td>https://systatsoftware.com/</td></tr> <tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>温度制御ボックス</td><td>ワーナーインスチュアーメンツ</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>蒸気圧浸透圧計</td><td>ELITechGroup</td><td>モデル 5600</td><td></td></tr><tr><td>ウィートン 20 mL バイアル</td><td>DWK ライフサイエンス</td><td>225288</td><td></td></tr></tbody></table>

単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

心臓の収縮性の変化の評価は、新しい心臓および非心臓標的化合物の前臨床開発において不可欠です。この論文では、細胞の正常な生理機能と薬理学を維持する非侵襲的な光学的方法であるMyoBLAZERを利用して、成人のヒト一次心室心筋細胞の収縮性の変化を評価するためのプロトコルについて説明します。この光学記録法は、複数の細胞からの収縮性トランジェントを並行して連続的に測定し、視野内の個々の細胞について中程度のスループットと貴重な情報の両方を提供し、薬物効果のリアルタイム追跡を可能にします。心筋細胞の収縮は、ペースの速い電界刺激によって誘導され、取得した明視野画像は、複数の心筋細胞にわたるサルコメア短縮を測定する画像処理ソフトウェアに送られます。この方法では、収縮期と緩和期の動力学に関連するさまざまなエンドポイントが迅速に生成され、得られたデータは、さまざまな濃度の試験品に関連して解釈できます。この方法は、前臨床開発の後期段階でも採用され、進行中の臨床試験をサポートするためのフォローアップメカニズム研究を実施します。したがって、成人のヒト原発性心筋細胞ベースのモデルと連続収縮性モニタリング用の光学系を組み合わせることで、前臨床医学開発における in vitro 心臓データ翻訳の新時代に貢献する可能性があります。

このプロトコルで記述されている器官提供者からの隔離された大人の人間の第一次心筋細胞の収縮性を測定し、試験混合物によって引き起こされる収縮性変数の急性変化を評価するためのプロシージャはある。収縮性過渡性の測定は、サルコメアのダイナミクスを測定するビデオベースの細胞形状システムであるMyoBLAZERを使用して行われ、成人の心臓の状態は、生理学的ペーシング周波数(1 Hz)で電気刺激で収縮性を誘導することによってエミュレートされます。心筋細胞の機能的生存率は、それらの興奮-収縮カップリング(すなわち、電気的興奮[筋膠性活動電位]と収縮を結びつける細胞処理)を評価することによって確認される。ヒト心筋細胞には自発的な収縮性過渡現象はなく、心筋細胞は収縮性/弛緩サイクルによる外部電気刺激に応答し(図2C、E)、およびβアドレナリン作動薬であるイソプロテレノール(図2F、G)にも応答します。イソプロテレノールは濃度依存的な収縮性の増加を引き起こし(図2G)、収縮性過渡性の動態に対するその影響も特徴付けることができます(図2D)12。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64394/64394fig01.jpg"> 図1:光収縮性記録システムの実験セットアップ。 明視野収縮性の記録は、前述のように成人ヒト原発性心筋細胞から行われます11,12,13,14。セットアップには、(A)温度制御ボックス、(B)フィールド刺激装置、(C、D)圧力駆動灌流システム、(E)コンピューター圧力駆動プログラム、(F)圧力プラスボトル、(G)取得ソフトウェア、(H)取得ソフトウェアによるROIの選択、(I)取得ソフトウェアによる収縮性トランジェントの表示、(J)倒立顕微鏡、(K)顕微鏡チャンバー、および(L)カメラ。機器のすべての機能は、材料表に記載されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64394/64394fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64394/64394fig02.jpg"> 図2:ヒト心筋細胞の収縮性測定とβアドレナリン作動性刺激の効果の検証。 (A)代表的な成人ヒト原発性心筋細胞の位相差顕微鏡画像、 (B)健康な心筋細胞の画像の上に配置され、収縮軸に平行なユーザー定義の関心領域(ROI)、 (C)(B)の同じROIから得られた収縮性トランジェントの表示)取得ソフトウェアで、(D)取得ソフトウェアで測定された収縮性トランジェントに関連するパラメータ:収縮性振幅、ピークまでの時間、減衰30、減衰90、TR90。ベースラインのサルコメア長、50%ピークまでの時間、ピーク高さ、ピーク収縮時のサルコメア長、最大収縮速度、最大緩和速度などの追加パラメータも測定できます。(E)ビヒクルコントロール(F)の存在下で、非選択的βアドレナリン作動薬である30 nMイソプロテレノールへの曝露後に、ペーシング周波数1 Hzで成人のヒト一次心室筋細胞から記録された典型的な収縮性過渡現象。パネルEとFで示された収縮性トランジェントは、同じ心筋細胞から収集されました。1Hzのペーシング周波数でペーシングしたヒト心筋細胞由来のイソプロテレノールを使用して、効力情報を生成しました。(g)イソプロテレノール(n = 8細胞)によるヒト心筋細胞収縮性測定によって生成された典型的な累積濃度-反応曲線。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64394/64394fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>灌流シーケンス</td>
			<td>車両ソリューション</td>
			<td>濃度 1 (μM)</td>
			<td>濃度 2 (μM)</td>
			<td>濃度 3 (μM)</td>
			<td>濃度 4 (μM)</td>
			<td>洗う</td>
		</tr><tr><td>施術時間</td>
			<td>120秒</td>
			<td>300秒</td>
			<td>300秒</td>
			<td>300秒</td>
			<td>300秒</td>
			<td>300秒</td>
		</tr><tr><td>刺激周波数</td>
			<td>1ヘルツ</td>
			<td>1ヘルツ</td>
			<td>1ヘルツ</td>
			<td>1ヘルツ</td>
			<td>1ヘルツ</td>
			<td>1ヘルツ</td>
		</tr></tbody></table>表1:刺激プロトコルと試験化合物の塗布順序。 収縮性トランジェントの安定性は、溶液C中で120秒間連続記録することによって評価され、ビヒクル制御(通常は0.1%DMSO中)が確立されます。その後、試験品の濃度を最低300秒間、または定常状態の効果が得られるまで適用します。4つの上昇試験物濃度が使用され、累積濃度-効果(C-E)曲線が得られます。試験片の累積追加が終了すると、300秒のウォッシュアウト期間を実施できます。

このプロトコルはMyoBLAZERシステム、前臨床開発の間にcontractilityの薬物誘発性の変更を評価するための信頼できるプラットホームのドナーの中心からの大人の人間の原発性心筋細胞のcontractilityを測定する方法を記述する。

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...

私たちのプロトコルは、成人のヒト一次心筋細胞の収縮性を測定するための信頼性の高いシステムを説明しています。私たちのシステムは、複数の細胞の収縮性を並行して連続的に測定し、薬物効果のリアルタイム追跡を可能にする、中程度のスループットの非侵襲的な光記録法です。私たちの方法は、心不全の矯正に最も望ましいプロファイルを持つ新しい分子の発見をサポートします。また、薬物誘発性収縮性リスクを予測するための前臨床アプローチも提供します。まず、8ウェル培養プレートの各ウェルにガラスカバースリップを1枚入れます。800マイクロリットルのヒト組換えラミニン521ストックを7.2ミリリットルの溶液Bに加え、よく混合することにより、ラミニン1ミリリットルあたり5マイクログラムを調製する。200マイクロリットルの希釈ラミニン溶液をカバースリップの中央に加えます。プレートに蓋をして、摂氏4度の冷蔵庫に積み重ねます。ジメチルスルホキシドまたはDMSOを溶液Cで1000倍希釈して、0.1%DMSOビヒクル溶液を作成します。0.001マイクロモルの治療曝露量の1倍、10倍、100倍、1000倍で化合物を試験するには、化合物を1ミリモルの濃度でDMSOに溶解します。DMSO試験化合物溶液をDMSOで段階希釈し、さらに3つのストックを作製します。最後に、1000年前の各試験化合物ストックを50ミリリットルの溶液Cで希釈して、最終的な試験濃度を取得します。ビヒクル溶液および化合物の最終マイクロモル濃度の溶液を50ミリリットルのシリンジに加える。シリンジを重力流システムに接続し、重力流システムをプライミングします。ラミネートコーティングされたカバースリップが入った8ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、カバースリップ1枚を清潔な記録チャンバーに入れます。次のメッキまでプレートを冷蔵庫に戻します。エスカレートしたバイアルから溶液Bを吸引し、細胞を失うことなく最小容量に到達します。次に、倒立顕微鏡のステージに取り付けられた記録顕微鏡チャンバーに200マイクロリットルの細胞溶液を分注し、細胞をカバースリップに5分間沈殿させます。次に、顕微鏡で視野を開き、細胞密度が実験を開始するのに適しているかどうかを判断します。プレーティングが完了したら、重力流灌流システムを使用して溶液Cで連続的に灌流することにより、セルを5分間平衡化します。吸引力を正しく調整し、温度制御ボックスと加熱プレートをオンにして、摂氏35度になるように設定します。次に、チャンバーの両側に一対の白金線を配置した電界刺激装置で、1ヘルツのペーシング周波数で閾値超電圧で細胞を刺激します。刺激パルスの振幅を1ボルトに設定し、心筋細胞が収縮-弛緩サイクルを生成し始めるまで振幅を増やします。棒状の形態と明確な縞模様を持つ健康な細胞を選択し、視野を調整し、収縮する細胞をできるだけ多く視界に入れることに集中します。次に、細胞のデジタル化された画像を光収縮記録システムの取得ソフトウェア内に表示した。関心領域または ROI を選択するときは、焦点が合っていない領域やセルの端に近い領域を避けてください。化合物の効果を評価するための実験を開始します。データ取得ソフトウェアがデータ取得を管理します。検査濃度と治療時間を自動的に表示し、ラベリングします。収縮がベースライン車両期間全体を通じて安定した振幅にとどまる場合は、テスト濃度を適用します。ランナップまたはランダウンのいずれかを表示するセルを失格にします。解析ソフトウェアとカスタムメイドのマクロを使用してオフライン解析を実行し、データを平均化します。このソフトウェアは、取得ソフトウェアによって生成されたサルコメアダイナミクスデータからさまざまな指標を計算して報告します。各心筋細胞の特定のベースラインビヒクル制御条件に対する平均収縮性振幅に対する試験化合物の影響を定量化します。平均結果を平均プラス/マイナスSEMで表し、収縮性振幅に対する試験化合物の濃度効果をプロットしたグラフを作成します。次に、濃度応答曲線を丘陵方程式に当てはめて、IC50 と EC50 の値を導き出します。次に、後収縮を、次の規則的な収縮の前に発生し、異常で同期されていない収縮を引き起こす心筋細胞の自発的な二次収縮一過性として特定します。収縮の失敗は、電気刺激が収縮を誘発できないことと特定します。短期変動 (STV) と、収縮振幅変動のポアンカレ線図のオルタナンを可視化します。各対照および試験物の濃度期間の最後の 20 回の過渡現象で STV を計算します。次に、オルタナンを反復的で、短い収縮と長い収縮性を交互に繰り返す振幅トランジェントとして識別します。不整脈誘発性の発生率を計算するには、STV値を各細胞のビヒクル制御値に正規化し、収縮後、収縮不全、STV、およびオルタナンをプロットし、各シグナルを示す細胞の発生率のパーセントとして表します。ピークまでの時間、30%、90%の緩和までの減衰、90%の緩和までの時間、ベースラインのサルコメア長、50%ピークまでの時間、ピーク高さ、ピーク収縮時のサルコメア長、最大収縮速度、および最大緩和速度を計算して、マルチパラメトリック機構プロファイリングを完了します。次に、これらのパラメータを各心筋細胞の特定のベースラインコントロール条件に関連させて表し、濃度応答プロットにグラフ化します。この研究は、ヒト心筋細胞の収縮性測定の検証、およびベータアドレナリン作動性刺激の効果を示しています。ヒト心筋細胞には自発的な収縮性過渡現象はなく、心筋細胞は収縮性-緩和サイクルを伴う外部電気刺激、およびベータアドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノールに応答します。イソプロテレノールは濃度依存的な収縮性の増加をもたらし、収縮性過渡性の動態に対するその影響も特徴付けられました。収縮性の測定に続いて、蛍光指示薬によるカルシウムの過渡性の測定を行うことができます。このようなデータは、収縮性の変化がカルシウムの動態の変化を必要とするかどうかを判断するのに役立ちます。私たちの方法は、心臓研究者がヒト心筋細胞の生理学と薬理学をよりよく理解し、新薬の構造、活性、および関係を確立し、それらの作用機序を探求するための道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

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マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

人工多能性幹細胞（hiPSC）が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。...

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

このプロトコルは、皮をむいた心筋細胞を用いた心機能の抽出および評価の技術を段階的に記述することを目的とする。この方法論は、マウスから男性まで、異なる心臓の場所から収集することができる小さな凍結生検を使用して、myofilament機能の測定および急性調節を可能にする。...

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。...

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルを、虚血による組織損傷の定量的評価方法と共に提示する。このモデルは、薬物スクリーニングおよび虚血性心疾患に関するさらなる研究のための有用なプラットフォームを提供することができる。...

hiPSC由来心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルと心筋細胞収縮の映像的比較

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。...

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro...

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

学ぶ成人ヒト一次心筋細胞の収縮性測定法。MyoBLAZERシステムを用いた非侵襲的な光学記録により、薬剤誘導性収縮変化をリアルタイムで評価し、心不全治療薬の前臨床開発を支援します。

単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

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