Name: スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ 3Dエンジニアリング筋肉組織と磁気センシングを用いた前臨床薬物検査法。24ウェル同時評価で収量を向上させ、心筋・骨格筋疾患の創薬研究とin vitro疾患モデリングに貢献します。

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この研究は、食品医薬品局からの資金提供(U01 FD006676-01が保健環境科学研究所に授与)と国立衛生研究所からの資金提供(HL151094からガイセ博士に授与)によって部分的に支援されました。この原稿の作成にご協力いただいたアレック・S・T・スミス博士に感謝します。

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 150(2013).</li>
<li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126(2018).</li>
<li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145(2020).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885(2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918(2020).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li>
<li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Enineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li>
<li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879(2022).</li>
<li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombin-fibrinogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
<li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li>
<li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li>
<li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+cover%3A+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094%2C+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li>
<li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3-Butanedione+monoxime+%28BDM%29+as+a+myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li>
<li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime%2C+a+chemical+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li>
<li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764(2021).</li>
<li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li>
<li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+cells%2C+nerves%2C+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Smooth+Muscle+Research%22%5BJournal%5D)">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).</li>
<li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells%3A+close+neighbors+and+privileged+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis%3A+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li>
<li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
</ol>

すべての著者は、Mantarrayハードウェアと関連ソフトウェアを商品化する会社であるCuri Bio Inc.の従業員および株主です。

この研究では、24ウェル消耗型キャスティングキット内で3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成する方法について説明します。これらの方法に従うことにより、その後の薬物スクリーニングのための鋳造失敗なしに、24の組織の完全な配列を一貫して達成することが可能です。このような結果を達成するための重要な考慮事項は、キャスティング中にすべてのステップを氷上で実行してヒドロゲルの早期重合を防止すること、組織キャスティング前の細胞解離試薬の除去、各組織の細胞とヒドロゲル懸濁液の徹底的な混合、組織間のピペットチップの交換、および熱不活性化FBSの使用(使用する場合)です。また、キャスティングが開始されるとポスト格子が移動せず、ヒドロゲルが形成されると穏やかに移送されるようにすることが重要です。
主な変更には、心臓と骨格のEMTを達成するための異なる細胞型の使用、および細胞の成熟と組織の安定性を促進するためのさまざまな濃度の基底膜タンパク質を含むヒドロゲルのドーピングが含まれます。このようなドーピングの有益な効果はケースバイケースでテストする必要がありますが、特定の状況下で機能的転帰と組織寿命を改善することが示されています14、16、22。また、記載されている細胞密度はガイドであり、さまざまな細胞株に合わせて最適化する必要があるかもしれないことも注目に値します。代替のヒドロゲル組成物はまた、達成されたEMTの構造的および機能的特性を改変する手段として考えることもできる23、24、25。天然の筋肉微小環境には、血管新生、神経支配、および筋細胞を形態および機能的に支持するためのマトリックス沈着を促進するための支持細胞タイプも含まれる26,27。ここで説明するシステムは、現在、線維芽細胞を3D心臓組織に組み込んでいるが、追加の細胞型は、in vitroで治療化合物の安全性および有効性を研究するためのより生理学的関連モデルを作成する可能性がある。以前は、さまざまな支持細胞タイプが3Dエンジニアリング組織にうまく統合されており、磁気センシング収縮性プラットフォーム28,29,30を使用した将来の研究のためのエキサイティングなテンプレートを提示しています。
このプロトコルのトラブルシューティングは、鋳造プロセス中の信頼性の低い組織または一貫性のない組織の形成に集中しています。ヒドロゲルはキャストされるため、混合中の細胞の均一な分布を促進しながら、ヒドロゲルに気泡が形成されないように注意する必要があります。理想的な細胞密度、細胞比率、およびマトリックス組成を特定するために、新しい細胞タイプごとに最適化実験が必要になる可能性があります。
この技術の主な制限は、24個のEMTのフルプレートを確立するために必要なセルの数が多いことです。ここに示されているデータでは、プレートあたり1500万個の心筋細胞と1800万個の骨格筋芽細胞を使用しました。特定の研究者は、このような大きな細胞物質のプールにアクセスできない場合があり、このプラットフォームを最大限に活用する能力を阻害する可能性があります。エンドユーザーが磁気センシングハードウェアにアクセスできない場合、ポストたわみの測定を光学的に実行する必要があるため、スループットが大幅に低下し、複数のウェルにわたる筋肉収縮の同時記録が妨げられます。しかし、Mantarrayハードウェアはこれらの制限を克服し、複数の構造にわたって同時にEMT収縮の連続的かつ非侵襲的な分析が可能な最初の商用システムを提供します。
24の井戸にわたる磁気センシングは、EMT機能発達の縦断的研究をリアルタイムで容易にし、化学的、環境的、または遺伝的操作に対する急性反応の正確な測定を可能にします。磁気センシングには、複数の組織にわたる同時測定などのいくつかの利点があり、複雑なデータ分析は必要ありませんが、光学検出法はカルシウムフラックスや電圧マッピングなどの生理学的指標の同時測定を可能にします。ただし、結果のセクションに示されているようなデータセットは、このテクノロジーが医薬品開発分野で持つ幅広いアプリケーションを示しています。人工筋肉の収縮出力を直接評価する手段を提供するアッセイは市場に出回っていないため、これらの方法は前臨床開発パイプラインに革命を起こす可能性を秘めています。

人工多能性幹細胞(iPSC)モデルは、治療薬の発見と開発、ならびに基礎生物学的研究と疾患モデリングの前臨床パイプラインの主要なプレーヤーになりつつあります1,2,3,4,5。iPS細胞に由来する心筋や骨格筋などの収縮組織は、筋収縮力と動力学の直接評価が組織全体の機能を研究するための定量的指標であるため、ヒトのin vitro研究の予測力を向上させる大きな可能性を秘めています4,6,7,8。典型的には、収縮力の測定は、基質のたわみ9,10の光学的追跡によって間接的に、または力変換器4,11,12への細胞/組織の付着によって直接的に得られている。これらの方法は正確ですが、本質的にスループットが低く、通常、データを収集して分析するには高度なスキルを持つオペレーターが必要です。
以前の研究では、磁場センシングがこれらの障害を回避し、複数の組織構築物にわたって同時に操作された筋肉機能を評価するための代替方法を提供することが示されています13。Mantarray(eNgineered Tissue ARRAY用磁気測定分析装置)3D収縮性プラットフォームは、この技術に基づいて構築されており、操作された筋肉組織の収縮性を高度に並列的に測定できるデバイスを使用しており、3D細胞モデルの複雑さとハイスループットスクリーニングを活用しています14。このプラットフォームは、標準的な細胞培養インキュベーター内外の心臓および骨格筋組織の収縮機能をラベルフリーで定量的にリアルタイムでモニタリングできるため、光学ベースの収縮イメージングと分析が不要になります。この技術は、健康な細胞株と病気の細胞株の直接比較を容易にし、収縮組織に対する薬物の効果の測定を可能にし、新規および既存の治療化合物の定量化可能な in vitro、安全性、および有効性のデータを確立します。
操作された3D筋肉組織は、Mantarray消耗型24ウェル鋳造プレートを使用して、再現性の高い方法で2つの支柱間で製造できます(図1)。1つのポストは剛性があり、もう1つのポストは柔軟性があり、小さな磁石が含まれています。組織構築物が収縮すると、フレキシブルポストと埋め込まれた磁石が変位します。EMTプレートは機器内に配置され、後変位はプレートホルダーの下の回路基板上の磁気センサーのアレイ を介して 測定されます。磁場の測定された変化は、数学的アルゴリズムを使用して絶対収縮力に変換されます。この装置は、迅速なデータサンプリングレートを採用しており、収縮頻度、速度、崩壊時間など、アッセイ対象の細胞タイプの機能容量と成熟度に関する詳細情報の収集を可能にします。これらの機能測定は、磁気センシングプラットフォームと同時に24ウェルすべてにわたって取得することも、従来の光学的方法を使用して個別かつ順次取得することもできます。
この研究では、フィブリンベースのヒドロゲルで3D骨格筋と心臓微小組織を操作するための再現性の高い方法について説明します。短時間の80分間の反応中に、トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒し、浮遊培養で筋細胞が発達するための足場を提供します15。間質細胞はマトリックスのリモデリングを助け、筋肉細胞がヒドロゲル内に合胞体を形成するにつれて組織は収縮します。これらの組織の収縮性は、化合物曝露の前後に磁気センシングアプローチを使用して分析され、用量反応薬物研究で使用するためにこのモダリティを検証しました。健康なドナー生検からの初代ヒト筋芽細胞を商業的に入手し、ベンダーのプロトコルに従って2Dで培養しました。骨格筋成長培地を用いて細胞を3回の継代で増殖させ、3D組織を作製するのに十分な細胞数を生成した。間質細胞およびhiPSc由来心筋細胞をベンダーのプロトコルに従って3日間培養し、細胞を組織に鋳造する前に凍結保存からの回復を可能にしました。磁気センシングプラットフォームを使用して収集できるデータセットのタイプを示す代表的な結果が提供されています。これらの方法を使用した人工組織の生成に関連する一般的な落とし穴についても説明します。

<table><tbody><tr><td>100 & マイクロ;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>ThermoFisher</td><td>150466</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Steriflip フィルター</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>500 mLフィルターフラスコ</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td></td><td></td>S2GVU05RE</tr><tr><td>6-アミノカプロン酸</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cardiosight メンテナンス培地</td><td>NEXEL</td><td>CM-002A</td><td></td></tr><tr><td>Cardiosight プレーティング培地</td><td>NEXEL</td><td>CM-020A</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM刺激装置&nbsp;</td><td>アイオノプティクス&nbsp;</td><td></td><td></td>EM</tr><tr><td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td><td></td><td>Primary - DIFF</td><td></td></tr><tr><td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td><td>Curi Bio</td><td>Primary - MAINT</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ジストロフィン抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab154168</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10082147</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>フィブリノーゲン (ウシ)</td><td>Sigma</td><td>E8630</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10</td><td>Gibco</td><td>11550043</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>Z359629</tr><tr><td>HS-27A 線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>ヒト骨格筋筋芽細胞&nbsp;</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>CC-2580</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック 0.2 & マイクロ;m シリンジフィルター</td><td>コーニング</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック 10 mL シリンジ</td><td>BH サプライ</td><td>BH10LL</td><td></td></tr><tr><td>マンタレー インスツルメント</td><td>キュリ バイオ</td><td>MANTA-24-B1</td><td>システム</td></tr><tr><td>マンタレー プレートキット</td><td>キュリ バイオ</td><td>MA-24-SKM-5</td><td>5キットパック</td></tr><tr><td>マンタレー刺激蓋&nbsp;</td><td>Curi Bio</td><td>EM</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (ECM)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td><td>NEXEL</td><td>C-002</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Nikon Ti2E</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Pan Myosin Heavy Chain 抗体&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレンイミン)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤</td><td>StemCell Technologies</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RPMI Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>骨格筋成長培地 (SkGM-2)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3245</td><td></td></tr><tr><td>標準 24 ウェルプレート</td><td>Greiner</td><td>M8812&nbsp;</td><td>他のメーカーのプレートは収まりません</td></tr><tr><td>標準 6 ウェルプレート</td><td>ThermoFisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175 フィルターフラスコ</td><td>ThermoFisher</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T225 フィルターフラスコ</td><td>ThermoFisher</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1217702</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr></tbody></table>

スケーラブルな3dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

in vitroで健康状態と病状を正確にモデル化することは、新しい治療戦略と治療法の開発に不可欠です。心臓および骨格筋疾患の場合、収縮力と動力学は、筋肉機能を評価するための重要な指標を構成します。人工多能性幹細胞から人工筋肉組織(EMT)を生成するための新しく改良された方法により、収縮組織に対するin vitro疾患モデリングの信頼性が向上しました。しかし、浮遊細胞培養物から組織を再現性よく作製し、その収縮性を測定することは困難です。このような手法は、多くの場合、高い故障率に悩まされており、複雑な計測器とカスタマイズされたデータ分析ルーチンが必要です。3D EMTをラベルフリーで高度に並列化され、自動化しやすい収縮性アッセイと組み合わせて利用する新しいプラットフォームとデバイスは、これらの障害の多くを回避します。このプラットフォームは、事実上あらゆる細胞源を使用して、3D EMTの容易で再現性のある製造を可能にします。次に、複雑なソフトウェア分析ルーチンを必要とせずに、24の組織を同時に測定する機器を介して組織収縮性を測定します。この装置は、マイクロニュートンの力の変化を確実に測定できるため、用量依存的な化合物スクリーニングにより、収縮出力に対する薬物または治療の効果を測定することができます。この装置で作られた人工組織は完全に機能し、電気刺激を受けるとけいれんや破傷風の収縮を引き起こし、数週間または数ヶ月にわたって培養中で縦断的に分析することができます。ここでは、予期せぬ心毒性のために患者が死亡した後に臨床試験から引き出された薬物(BMS-986094)を含む、既知の毒物による急性および慢性投与下の心筋EMTからのデータを示します。ミオシン阻害剤による治療に応答して操作された組織における骨格筋機能の変化も提示される。このプラットフォームにより、研究者は、最小限の追加トレーニングやスキルで、複雑で情報が豊富なバイオエンジニアリングモデルシステムを創薬ワークフローに統合できます。

細胞は、2ポスト消耗プレート内の操作された筋肉組織にキャストされました(図1)。成功したEMTは均一に見え、マトリックスはポスト間で均等に分散されます(図2A)。マトリックスはまた、両方の支柱を包み込み、組織の同等のアンカーポイントを生成する必要があります。この方法では鋳造の失敗はまれであり、通常は目視検査で明らかです。EMT製造の失敗は、ポストからの組織の剥離(図2B)などの壊滅的な障害から、気泡やポストへの取り付けの緩みなどのより微妙な構造上の欠陥(図2C、D)までさまざまです。軽微な欠陥のある組織はまだ実行可能である可能性がありますが、これらの組織からのデータは、妥協のないEMTに匹敵することを確認するために注意深く調べる必要があります。たとえば、EMT内の気泡は、組織が時間の経過とともに圧縮されるにつれて絞り出され、収縮不全のない完全に機能する構造になります。ただし、気泡の位置が機能回復に影響を与える可能性があるため、これらの組織はケースバイケースで評価する必要があります。たとえば、ポストで発生する気泡は、組織の付着に影響を与える可能性があり、ポストへの長期的な付着を妨げる可能性があります。
細胞がヒドロゲル内のマトリックスをリモデリングすると、組織は最初の24時間以内に圧縮を開始します(図3)。圧縮は段階的なプロセスであり、通常、培養の最初の2〜4週間にわたって進行します。全体として、組織圧縮は技術的複製と生物学的複製の間で一貫しています(図4)。一部の細胞株は、組織が時間の経過とともに成熟するにつれて、他の細胞株よりもマトリックスを圧縮するのが正常です。コンストラクト内の筋原性細胞の割合は、EMT圧縮の速度と全体的な程度に影響を与えます。心臓と骨格筋の両方の細胞株の総筋原性含有量は、操作された組織間の変動を最小限に抑えるために80%を超える必要があります。これは、細胞株間で収縮力と動態を比較する場合に特に重要です。
キャスティング後の最初の数日以内に、心筋細胞は培養中に自発的に鼓動し始め、筋肉が収縮するたびに柔軟なポストをリズミカルに曲げます。骨格筋構築物は、分化開始後7日目までに電気刺激に応答して収縮する。フィールド刺激は、カスタム24ウェル電極蓋に取り付けられた外部刺激装置 を介して 骨格筋組織に適用されました。各ウェルの1対のカーボン電極で作製された蓋は、組織の24ウェルプレートの上にあり、各EMTを同時に刺激して筋肉収縮を誘発します。組織は、機能測定中に1Hzで10msのパルス持続時間の間、10V刺激を使用してペーシングされました。収縮組織は、融合した骨格筋芽細胞を示し、機能的なサルコメアと収縮機構を備えた筋管を形成します。ミオシン重鎖(MyHC)およびジストロフィンに対して陽性の骨格EMTは筋管膜に局在しており、断面免疫組織化学的分析で古典的なリング形状を明らかにしています(図5)。EMTが機能すると、磁気センシング機器で収縮性を毎日測定し、構造が時間の経過とともに発達および成熟するにつれて力と動力学を追跡できます。心臓組織と骨格筋組織はどちらも、3D培養で数週間から数か月間収縮性を維持し(図6)、幅広い収縮性研究に使用できます。
磁気検出アプローチは、ドキソルビシン(図7)やBMS-986094(図8)などの構造的心毒性物質、および筋収縮性に影響を与える他の薬物の急性および慢性の影響を同時に測定するために使用できます。収縮検出の光学的追跡法も使用できますが、測定は順次行う必要があるため、急性薬物効果を研究する場合は注意が必要です。3D培養における心臓および骨格EMTの寿命が延びることにより、これらの組織での長期的な薬物研究が可能になります。これにより、ユーザーは、ドキソルビシンで発生するように、時間の経過とともに心毒性効果を示す可能性のある化合物への反復投与、および継続的な長期曝露の影響を調査できます。ドキソルビシン(dox)は抗癌化学療法薬です17。患者に投与される薬物の量は、癌の種類、患者の年齢、患者の身長および体重、ならびに他の要因によって異なります。このため、広範囲の濃度と送達スケジュールにわたってdoxの効果をテストすることが重要です。ここでは、心臓EMTを3つの別々の濃度(0.1 μM、1 μM、および10 μM)のdoxで27日間にわたって治療しました(図7)。グループは、ボーラス治療または72時間ごとの培地交換を伴う連続投与のいずれかで各濃度のEMTを治療することによってさらに層別化されました。ドックスのボーラス治療を受けたウェルは、3つの別々の時点で薬物にさらされ、投与間の回復を可能にしました。ボーラスと継続的曝露の2つの最高用量は、研究全体を通して収縮力の発生の即時かつ長期の停止を示しました。中濃度および最低濃度は、投与方法に応じて、組織に異なる影響を及ぼした。薬物の最低濃度では、ボーラス群は対照群と差を示さなかった。しかし、収縮力は2週間の連続曝露後に減少した。薬物のミッドレンジ濃度は興味深い効果をもたらしました。連続投与は治療の最初の数日間で力を低下させ、実験を通して続いたが、ボーラス群は、薬物が3日後に洗い流されたときに収縮力が対照レベルに戻ることを示した。しかし、薬物の2番目のボーラスは力の完全な停止を引き起こし、その後回復せず(図7)、この濃度で繰り返し投与すると、この薬物で治療された患者に心毒性効果がある可能性があることを示しています。この研究の広い範囲は、時間と実験条件の両方で、長期間にわたって収縮性を維持し、化学物質曝露に反応し、単一の筋肉組織セット内での長期薬物研究を可能にするため、毒性スクリーニングにおける3D操作組織の有用性を強調しています。これにより、慢性曝露で心毒性作用を及ぼす可能性のある化合物を特定するだけでなく、投与の潜在的な心毒性タイミングの検出も容易になります。
人工ヒト筋肉組織におけるin vitro毒性試験は、臨床試験においてヒト患者の安全を確保するのに役立つ1つの方法です。BMS-986094は、C型肝炎の治療に使用されるヌクレオチドポリメラーゼ(NS5B)阻害剤です。ブリストル・マイヤーズ スクイブが患者18,19の予期せぬ心不全のいくつかの症例のために開発を中止したとき、この薬は第II相臨床開発中でした。ここでは、BMS-986094を心臓EMTに適用して、3Dエンジニアリングされた筋肉組織が薬物に対して心毒性反応を起こすかどうかをテストしました(図8)。3つの異なる濃度の薬物を適用し、組織を13日間にわたってモニターした。収縮力は、用量依存的に薬物の添加により低下した(図8A)。心毒性化合物への継続的な曝露により、拍動速度が遅くなり、最終的に期待どおりに停止したため、けいれん頻度も有意に影響されました(p &lt; 0.05、図8B)。これらの結果は、3Dエンジニアリングされたヒトの筋肉組織を使用して、新薬の市場投入を容易にし、心毒性のために最終的に失敗する化合物にフラグを立てる方法を示しています。さらに、この技術は、臨床試験で患者に投与される前に危険な薬物を暴露することにより、命を救う可能性があります。
ヒトの収縮組織に対する急性および慢性的に適用された薬物の効果を測定する能力は、安全性と有効性について治療法を研究する際の重要な第一歩です。ただし、適用される薬物の濃度は生理学的に関連性があり、 in vitro 試験に適していることを知っておくことが重要です。骨格筋組織を使用して、完全用量反応曲線における2,3-ブタンジオンモノオキシム(BDM)のIC50 値を確立しました。.この薬は骨格筋ミオシン-II20のよく特徴付けられたATPase阻害剤です。BDMは、サルコメア21のアクチンフィラメントによるミオシンクロスブリッジ形成を防止することにより、筋肉収縮を阻害します。ここに示す結果は、薬物が塗布されたときの絶対力の用量依存的な減少と、薬物が洗い流されると収縮力の完全な回復を明らかにし、一過性の効果が組織内の細胞を殺すだけでなく、筋肉の収縮を防ぐことを示しています(図9A)。さらに、調べた7つの濃度にわたって完全な用量反応曲線を測定し、これらのヒト微小組織において3.2mMのIC50 を確立した(図9B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> 図1:2ポストマンタレー消耗型24ウェルプレートでのEMTキャスティング 。 (A)筋原性細胞および間質細胞は、組織キャスティングの前に2D表面上で培養した。(B)細胞を2D表面から持ち上げ、細胞外マトリックスタンパク質と混合して、挿入図に示す個々のプレートキャスティングウェルでヒドロゲルを形成します。(C)すべてのウェルに操作された組織を含む24ウェルプレート。(D)弛緩および収縮した人工筋肉を示す代表的な組織、磁気ポストの変位を比較(緑色のバー)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> 図2:成功したEMTキャスティングと失敗したEMTキャスティング。 (A)理想的な人工筋肉組織は、組織全体に均一な細胞/マトリックス組成でポストの周りに均一に圧縮された24時間後のキャストです。(B)可撓性ポストからのヒドロゲルの剥離を示す失敗したEMT。 (C)組織全体に気泡を含むEMT。(D)両方の支柱の周りの不均等な組織沈着。組織は片側の柔軟な支柱に緩く固定されています。スケールバーは1mmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> 図3:時間の経過に伴う人工筋肉組織の圧縮。 (A)鋳造後1日目に示すEMT構築物。組織は分化培地に移され、細胞融合およびヒドロゲル圧縮の0日目に開始される。(B-E)7日目から21日目までの同じEMTは、時間の経過とともに2つのポスト間の全長がわずかに短く、EMTの中央セクションで測定すると幅が狭くなることを示しています。スケールバーは1mmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> 図4:時間の経過に伴うEMT直径。 組織の4枚のプレートを21日間にわたって追跡し、圧縮全体のEMT直径を比較しました。各組織は、光学顕微鏡を用いて毎週中央切片を通して測定した。時点は、プレート間で一貫したEMTサイズを示します。マトリックスのリモデリングが安定するため、21日目に最大圧縮に達します。この表は、組織の各プレート内の圧縮の標準偏差(全体に対する%)と、すべてのプレートの平均偏差を示しています。色付きのバーは個々のプレートです。エラーバーは、プレート内のEMTのSDです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> 図5:操作された骨格筋組織の免疫組織化学。 EMTは培養10日目に固定され、パラフィンに包埋されました。薄い断面(7 μm)を、イメージング前にミオシン重鎖およびジストロフィンに対する抗体で染色しました。緑=MyHC、赤=ジストロフィン、青=DAPI。対物レンズ倍率は40倍です。スケールバーは50μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> 図6:操作された筋肉組織の収縮力の経時変化 。 (A)培養7日目から63日目までの心臓EMTから測定された平均絶対けいれん力。グループあたりn = 3。(B)培養7日目から53日目までの初代細胞株に由来する骨格EMTの平均絶対けいれん力。n = 3です。エラーバーは両方のグラフのSDです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> 図7:人工筋肉組織における急性および慢性のドキソルビシン治療。 0.1 μM、1 μM、および10 μMの3つの別々の用量濃度のdoxが、ボーラスで送達されるか、27日間にわたって操作された筋肉組織に継続的に投与されました。薬物のボーラス用量は、X軸の緑色の矢印で示されている、0、12、および24日目の培地変更時に追加されました。薬物は、X軸上の黒と緑の矢印で示され、連続投与のために培地が変化するたびに培地に添加された。ベースライン値(薬物前治療)からの力の変化率はY軸にあり、治療の日数単位の時間はX軸にあります。明るいオレンジ = DMSO 連続制御、濃いオレンジ = DMSO ボーラス制御、ライトグリーン = 0.1 μM ドックス連続、ダークグリーン = 0.1 μM ドックスボーラス、ライトブルー = 1 μM ドックス連続、ダークブルー = 1 μM ドックスボーラス、ライトイエロー = 10 μM ドックス連続、濃い黄色 = 10 μM ドックスボーラス。エラーバーはSDです。条件あたりn = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> 図8:人工筋肉組織におけるBMS-986094による慢性治療。 EMTは、0.4 μM(緑)、2 μM(濃い青)、および10 μM(水色)のBMS-986094で13日間処理されました。(A)収縮性けいれん力(Y軸)は、最初の2日間ですべての薬物濃度で減少しますが、DMSOの対照組織は時間の経過とともに強くなり続けます(X軸)。(B)心拍速度、またはけいれん頻度は、グラフAに示す収縮力の停止と並行して用量依存的な方法で停止します。 DMSO(灰色)の対照組織は、実験全体を通して規則的な拍動率を維持します。エラーバーはSDです。条件あたりn = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> 図9:人工骨格筋組織におけるBDMに対する用量反応 。 (A)初代細胞由来EMTが3D培養の16日目に2,3-ブタンジオンモノオキシム(BDM)にさらされると、絶対けいれん力は用量依存的に減少します。絶対けいれん力は、薬物が洗い流されるとベースライン値に近い値に戻ります。(B)ベースライン値に正規化された絶対けいれん力は、BDMに曝露されると用量依存的に減少し、完全な用量反応曲線とIC50 値が得られます。n = 4用量あたり。エラーバーはSDです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

当社のプラットフォームは、3Dエンジニアリングされた筋肉組織と磁気センシングハードウェアを使用して、24ウェルの収縮性を同時に測定します。これにより、ヒトの筋肉組織を用いてin vitroで新しい治療法を評価するためのより高いスループットの方法が提供されます。当社の鋳造方法は、3Dエンジニアリングされた筋肉組織を製造する際の一貫性と再現性を向上させます。当社のプラットフォームでの収縮性測定と分析のための磁気センシングハードウェアを備えた消耗可能な24ウェル鋳造プレートを設計しました。この方法は、収縮性に影響を与えるあらゆる筋肉疾患のin vitro疾患モデリング、創薬、および遺伝子治療に関する貴重な洞察を提供することができます。現在、運動ニューロンを3Dコンストラクトに組み込み、神経筋接合部モデルも作成しています。まず、事前に冷却した組織キャストキットを細胞培養フード内のコールドブロックまたは氷に置きます。キャスティングプレートを氷の上に平らに置きます。トロンビンをベース培地に加えてトロンビン溶液を作り、ポスト格子をキャスティングプレートから新しい滅菌24ウェルプレートに移動します。50マイクロリットルのトロンビン溶液をキャスティングプレートの各プレチルドウェルにピペットで入れ、格子をキットに戻します。キャスティングキットを氷の上に置いておきます。次に、500ミリリットルのRPMI培地、10ミリリットルのB27、および2.5グラムのアミノカプロン酸(ACA)を加えて、心臓EMT培地を調製します。組織をキャストするために使用されるEMT培地を取り出し、それに10マイクロモルのROCK阻害剤を追加します。初代筋芽細胞用に50ミリリットルのF10培地と0.25グラムのアミノカプロン酸(ACA)を加えて骨格EMT培地を準備します。IPSC由来の筋芽細胞には0.1グラムのACAを使用してください。次いで、ACAを含む流延媒体を滅菌濾過する。細胞培養グレードの解離試薬と等量のEMT培地を摂氏37度に温めます。この加温されたEMT培地は、解離試薬を希釈するために使用されます。細胞をPBSで洗浄し、温めた解離試薬を加えて細胞を持ち上げます。摂氏37度で5分間、または細胞が持ち上がるまでインキュベートし、プレートの側面をタップして2〜3分ごとに培養を確認します。細胞が持ち上げられたら、それらを50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。P-1000ピペットで粉砕し、単一細胞懸濁液を確保します。プレートとフラスコを追加のEMT培地で洗浄して残りの細胞を収集し、それらを円錐管に加えます。ここでも、細胞を粉砕して、単一の細胞懸濁液を確保します。EMT培地を加えて解離プロセスを終了し、細胞数のために細胞懸濁液のサンプルを採取します。自動セルカウンターまたはトリパンブルーの血球計算盤を使用して細胞カウントを実行します。細胞を200 Gで4分間スピンさせ、上清を吸引し、細胞を5ミリリットルのEMTベース培地に再懸濁して、残留解離試薬を除去します。再度4分間遠心分離した後、上清を吸引し、適切な密度で細胞懸濁液を調製します。所望の数の組織を構成するのに必要な各細胞溶液の体積を計算し、計算された細胞量を15ミリリットルの円錐管にピペットで入れます。EMTあたり10マイクロリットルのフィブリノーゲンを細胞懸濁液に加え、氷の上に置きます。各EMTの最終組織構築物に90マイクロリットルの細胞懸濁液、10マイクロリットルのフィブリノーゲン、および50マイクロリットルのトロンビン溶液が含まれていることを確認します。細胞培養フードで、組織キャスティングキットの蓋を外し、ポスト格子を氷の上に平らに置いた状態でキャスティングプレートを置きます。細胞フィブリノーゲン混合物を混合し、P-200ピペットで100マイクロリットルを吸引する。50マイクロリットルのトロンビン溶液で調製したウェルに100マイクロリットルの混合物を加え、5回粉砕してよく混合する。ピペットを最初のストップを超えて押したり、気泡が発生しないように粉砕後にチップを取り外したりしないでください。すべての組織をキャストする前に、コニカルチューブで細胞懸濁液を混合します。人差し指と片手の親指を使用して格子と鋳造ウェルプレートの両方を同時に保持して格子の動きを避けるか、プレートを氷の上に平らに保ち、氷のバケツを揺り動かして鋳造プレートを覗き込みます。すべての組織がキャストされるまで、各組織に新しいP-200チップで繰り返します。播種したキットを慎重にインキュベーターに移し、摂氏37度で80分間インキュベートします。次に、心臓組織用のEMT培地を1ウェルあたり2ミリリットル入れた新しい24ウェルプレートを準備し、プレートを摂氏37度でインキュベートして培地を温めます。80分間のインキュベーションの後、1ミリリットルのEMT培地をキャスティングウェルの端に静かに加え、摂氏37度でさらに10分間インキュベートします。10分間のインキュベーションの後、ポスト格子を注意深く持ち上げ、組織をキャスティングプレートから加温した培地で調製した24ウェルプレートに移します。最後に、組織を入れたプレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに戻します。EMTの生成の失敗は、支柱からの組織の剥離などの壊滅的な障害から、気泡や両方の支柱の周りの不均等な組織の堆積などのより微妙な構造上の欠陥にまで及ぶ可能性があります。鋳造の翌日のEMTコンストラクトがここに示されています。骨格筋組織を、細胞融合およびヒドロゲル圧縮のゼロ日目から分化培地に移した。7日目から28日目まで、同じEMTは、EMTの中央部を通して測定すると、2つの支柱間の全長がわずかに短く、幅が狭くなりました。4枚の組織プレートを21日間にわたって追跡し、圧縮全体を通してEMT直径を比較した。時点は、プレート間で一貫したEMTサイズを示します。マトリックスのリモデリングが安定する21日目に最大圧縮に達します。EMTの免疫組織化学がここに描かれています。EMTは培養10日目に固定され、パラフィンに包埋されました。薄い断面は、イメージング前にミオシン重鎖およびジストロフィンに対する抗体で染色した。これらのグラフィック画像は、心臓EMTと骨格EMTから経時的に測定された平均絶対けいれん力を表しています。人工心臓組織における急性および慢性のドキソルビシン治療がここに示されています。Doxの3つの異なる用量濃度が、ボーラスで送達されるか、または27日間にわたって操作された心臓組織に継続的に投与されました。操作された骨格筋組織におけるBDMに対する用量反応をこの図に示します。心拍数またはけいれん頻度は、EMTがこの化合物にさらされたときに心毒性を示す収縮力の停止と並行して用量依存的に停止します。.組織を鋳造する際に覚えておくべき最も重要なことは、細胞懸濁液や試薬を含むすべてを常に冷たく保ち、鋳造が開始されたらポスト格子を完全に静止させることです。

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