イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

私たちが開発したエピジェネティックサイレンシング技術は、遺伝子サイレンシング技術という大きな技術分野に属しています。エピジェネティックサイレンシングの開発に着手する前は、この分野には2つの選択肢がありました。一つはRNA干渉による遺伝子ノックダウン、もう一つは人工ヌクレアーゼによる遺伝子破壊です。

そして、人工ヌクレアーゼによる遺伝子破壊はDNAレベルで働きます。つまり、不活性化したい標的遺伝子があり、細胞に人工ヌクレアーゼを送達して、二重ストリングの切断を誘導します。この種の二重ストリングブレークは、非機能的なタンパク質の変性、または同時に転写分解のいずれかを最終的に課す退化合計、フレームシフト突然変異を実行する可能性があります。

したがって、エピジェネティックサイレンシングは、細胞、いわゆる人工転写抑制因子を送達することによって機能します。これらは、標的DNAに結合し、標的遺伝子にのみ課すことができるいくつかの小さなタンパク質、いわゆるエピジェネティックマルクスです。これらは化学修飾であり、DNAに沈着すると、クロマチンの圧縮につながる可能性があります。

クロマチンの圧縮は転写阻害につながるため、標的遺伝子の発現がなくなります。そして非常に重要なことは、この種の転写抑制状態は、細胞によって長期間結合される可能性があるということです。サイレンシングする標的遺伝子を発現する細胞株を同定するには、ヒトタンパク質アトラスで標的遺伝子を閲覧し、細胞株セクションをナビゲートして、目的の体細胞組織を代表する細胞株を同定します。

同定された細胞株から、効率的な一過性遺伝子送達プロトコルが利用可能な細胞株を優先します。次に、遺伝子ビューアを開き、標的遺伝子の領域を同定して、蛍光色素発現カセットを組み込みます。次に、CHOPCHOPを使用して、Beta-2M遺伝子の最初のイントロンの標的領域を切断するGNRAを特定して選択します。

次に、左相同性群、プロモーター遊離導入遺伝子発現カセット、および右相同性群からなるGNRA切断部位のドナーテンプレートを設計します。CRISPR Cas9ヌクレアーゼシステムとドナーテンプレートをK-562細胞株内にヌクレオフェクションで送達します。K-562細胞を少なくとも14日間培養します。

フローサイトメーターを用いて、蛍光レポーターの発現レベルを経時的にモニターします。FICOエーテリンチャンネルを活性化して、tdTomatoレポーターの蛍光強度を測定します。UCSC Genome Browserで標的遺伝子を閲覧し、CpGアイランドやH3K27アセチル化に富む部位など、転写活性を調節する可能性のある領域のヌクレオチド配列を抽出します。

選択したシーケンスをCHOPCHOPオンラインツールに貼り付けて、取得するGNRAの目的としてrepressionを選択します。CHOPCHOPは、ターゲット外一致の数と予測されたオンターゲット効率を考慮して、関心のある遺伝子配列にマッピングされ、スコアに従ってリストされたGNRAのリストを提供します。ターゲット配列ごとに少なくとも 10 個の GNRA を選択します。

ゲノム全体の他の遺伝子間配列と完全に一致しない状態で統合される領域全体にわたるGNRAを選択するようにしてください。化学的に有能な大腸菌細胞でETRSをコードするプラスミドを形質転換した後、制限酵素消化およびサンガーシーケンシングにより、ETR含有プラスミドの存在についてコロニーをスクリーニングします。phU6 GNRAバックボーン内のGNRAをクローニングするには、まず、分子生物学デザインソフトウェアを使用してオリゴを作製します。

プロトスペーサーの上流に5ヌクレオチド配列を付加し、この25ヌクレオチド長のオリゴを標識します。同様に、プロトスペーサーの逆補体の5ヌクレオチド配列とその下流のシトシンを付加して、25ヌクレオチド長のオリゴを生成し、標識します。これらのオリゴを無塩の一本鎖DNAオリゴとして合成し、100マイクロモルの水に再懸濁します。

各オリゴ1マイクロリットルを2マイクロリットルのアニーリングバッファーと16マイクロリットルの水に加えます。溶液を摂氏95度のサーモサイクラーに10分間入れてオリゴアニーリングを行います。その後、45分かけて摂氏25度まで徐々に冷まします。

アニーリングしたオリゴ1マイクロリットルを99マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で希釈します。次に、この希釈液の1マイクロリットルを、Bsa1制限酵素で消化した50ナノグラムのphU6 GNRAプラスミドでライゲーションします。20マイクロリットルの化学的に有能な大腸菌細胞を2マイクロリットルのライゲーション産物で形質転換しました。

プラスミドDNA産生のために複数のコロニーを選択し、サンガーシーケンシングによってプロトスペーサーのクローニングが成功したことを確認します。GNRAおよびCRISPR dCas9ベースのDTRをレポーター細胞株にアレイで送達するには、まず、各プラスミド500ナノグラムを含む別々のチューブを調製し、125ナノグラムの異なるGNRAコードプラスミドを試験用に加えます。GNRAおよびETRフリーの核形成条件を模擬処理サンプルとして含めます。

サンプルごとに少なくとも 3 つのテクニカルリプリケートを準備します。チューブあたり5番目のBeta-2M tdTomto K-562細胞に10倍の5回ペレットを塗布し、プラスミドミックスでヌクレオフします。以前に温めたRPMI 1640哺乳類細胞培養培地に細胞を200マイクロリットル再懸濁し、インキュベーターに入れます。

フローサイトメトリーを使用して、ETRの送達後のさまざまな時点でサイレンシングされた細胞の割合を測定します。Flora 4コーティング配列を含まない野生型細胞を使用してください。レポーターのネガティブセルのしきい値を設定します。

モック処理されたサンプルを使用して、レポーター陽性細胞のゲートを設定します。長期的なサイレンシング効率の観点から上位 3 つの GNRA を特定します。ファクトを使用して、これらのサンプルで安定的に維持されているレポーターの陰性部分母集団を選択します。

また、同じ処理で模擬処理されたサンプルの事実を実行して、その後の分析で適切な比較を可能にします。tdTomato蛍光レポーターは、CRISPR Cas9誘導トモロジー指向性修復により、ヒトΒ-2M遺伝子の最初のイントロンに組み込まれました。レポーター陽性のK-562細胞は、取り分後に処理されたサンプルに現れます。

トリプルETRの組み合わせをGNRAとともに一過性に送達すると、縦断的フローサイトメトリー分析を実施して、蛍光レポーターの発現を評価しました。急性分析ではレポーター抑制にピークが観察され、経時的にETRをコードするプラスミドの有糸分裂希釈により部分的に再吸収されました。ETRのGNRAの組み合わせによる標的遺伝子座へのCpGメチル化の効果的な沈着は、処理された細胞のかなりの部分におけるレポーターの恒久的な抑制によって明らかでした。

GNRAが異なれば、長期サイレンシング効率にばらつきが見られました。恒久的かつ効率的なエピゲノムサイレンシングを達成するための最も重要なステップの1つは、効果的な単一gRNAの同定です。そのためには、あらゆる種類のアプリケーションにおいて、転写制御因子の他の部位のプロモーターとアンサーを含む、最も応答性の高い配列の同定から始める必要があります。

どの領域が最も応答性が高く、効果的な領域であるかが特定されたら、誰でも異なる種類の単一gRNAを個別または単一gRNAの組み合わせとしてテストを設計する必要があります。エピゲノム編集の最も明白な用途の1つは、機能的突然変異の獲得における前臨床翻訳であり、この遺伝子のサイレンシングは特定の疾患の治癒に役立つ可能性があります。あるいは、特定のプロモーターのエピジェネティックな制御を特異的に変化させる能力は、臨床科学と基礎トランスレーショナルサイエンスの両方にとって非常に有用なツールになり得ることを心に留めておく必要があります。