Name: オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ全ゲノムシーケンス解析のバイオインフォマティクスパイプライン構築手法。抗微生物耐性メカニズムの解明と臨床・食品安全への応用可能性を探索する計算的手法です。

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ホセアントニオマガーニャリサラガ[No.481143]に授与された博士奨学金のために、メキシコ国立科学技術評議会(スペイン語の頭字語でCONACyT)に。

注:大腸 菌 株ACM5は、糞便性大腸菌群(FC)測定のために魚サンプルを処理および培養することによって回収されました12。魚のサンプリング中、魚は病気、細菌、または真菌感染の臨床的兆候を示さず、平均温度は22.3°Cでした。単離後、 大腸菌 分離物を生化学的試験にかけ、凍結保護剤としてDMSO(8%v/v)を含む脳心臓注入(BHI)ブロスで凍結保存しました。
1. 凍結 大腸菌 ACM5ストック培養の再活性化
<ol><li>凍結細菌ストックからチューブを開き、滅菌ループ、ピペットチップ、またはつまようじを使用して、凍結細菌培養物の表面をこすり落とします。</li>
	<li>細菌をルリア・ベルターニ(LB)寒天プレートにストリークし、37 ± 2°Cで24時間インキュベートします。</li>
</ol>2.抗菌感受性の決定
注:ここに記載されている抗菌剤感受性試験は、臨床検査基準研究所(CLSI)ガイドライン(M02 Ed13:2018)31に基づくディスク拡散法に対応しています。 大腸菌 ATCC 25922株は、品質管理のために必要です。
<ol><li>コロニー懸濁法による接種材料調製<ol><li>ステップ1.2でインキュベートしたLBプレートから、1つまたは2つのコロニーをミューラーヒントン(MH)寒天プレートにストリークし、37 ± 2°Cで18〜24時間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌ループを使用して、MH寒天プレート上で新たに継代培養した大腸 菌 分離物から2つまたは3つのコロニーを選択し、3 mLの滅菌MHブロスまたは0.85%(w / v)生理食塩水に再懸濁し、ボルテックスによって完全に混合して均一な細菌懸濁液を得ます。</li>
		<li>UV可視分光光度計( 材料の表を参照)を使用して、細菌懸濁液を0.5マクファーランド標準(約1〜2 x 108 細胞/ mLに相当)に匹敵する濁度に調整します。細菌懸濁液が軽すぎたり重すぎたりする場合は、必要に応じて 大腸菌 コロニーまたはMHブロスを追加します。準備から15分以内に準備された接種材料を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>試験寒天プレートの接種<ol><li>滅菌綿棒を調整した細菌懸濁液に浸します。綿棒を数回回転させ、チューブの内壁にしっかりと押し付けて、綿棒から余分な液体を取り除きます。</li>
		<li>寒天表面全体に綿棒を3倍ストリーキングし、毎回プレートを60°回転させて、MH寒天プレートを接種します。寒天の縁も拭いて、接種材料の均一な分布を確保します。</li>
		<li>ペトリ皿の蓋を3〜5分間半開きにして、水分を蒸発させます。</li>
	</ol></li>
	<li>接種寒天プレートへの抗菌ディスクの適用<ol><li>均等に分配し、各抗菌ディスク( 材料の表を参照)を接種した寒天プレートの表面に押し下げて、完全に接触するようにします。ディスク塗布後15分以内にプレートを反転させ、35 ± 2°Cで16〜18時間インキュベートします。 注意: 150mmと100mmのペトリ皿には、それぞれ最大12枚と6枚のディスクを使用する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>インキュベーション後、ノギスを使用して阻害サイズのゾーンを測定し、CLSIブレークポイント基準(M100-表2A)に従って結果の直径を解釈します32。</li>
</ol>3. ゲノムDNA(gDNA)の抽出と定量
<ol><li>ゲノムDNA抽出<ol><li>培養したばかりの 大腸菌 コロニーを5 mLのLBブロスに再懸濁し、37 ± 2°Cの振とうインキュベーター(180 rpm)で一晩インキュベートします。</li>
		<li>細菌懸濁液を3,500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します。</li>
		<li>DNA抽出キットのガイドラインに従ってgDNAを抽出します(材料の表を参照)。</li>
		<li>紫外可視分光光度計を用いて260/280 nm(比:&gt;1.8)および260/230 nm(比:2.0-2.2)の光学密度を測定し、gDNAの純度を確認します。0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、gDNAの完全性を検証します。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲノムDNA定量 注:蛍光アッセイキットの製造元によって承認された薄肉の透明な0.5 mL PCRチューブのみを使用してください(材料の表を参照)。<ol><li>サンプルとアッセイ標準に必要な数のチューブを設定します。メーカーのガイドラインに従って、キットに付属の成分Aと成分Bを混合して、実用的なアッセイ溶液を調製します。</li>
		<li>190 μLの作業溶液と10 μLの各標準物質を適切なチューブに加えて、アッセイ標準を準備します(2つの標準物質が必要です)。</li>
		<li>198 μLの作業溶液と2 μLのDNAサンプルを適切なチューブに加えます。すべてのチューブを5秒間ボルテックスして激しく混合します。泡を作らないように注意してください。</li>
		<li>すべてのチューブを室温で2分間インキュベートし、光から保護します。蛍光光度計を使用して、メーカーのガイドラインに基づいてすべてのチューブの蛍光を測定します(材料の表を参照)。</li>
		<li>シーケンシングを進めるために、gDNAサンプル濃度を適切に調整してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. DNAライブラリーの調製
注:DNAライブラリの調製とシーケンシングは、製造元のガイドラインとプロトコルに従って実行されました( 材料表を参照)。開始gDNA濃度は4.0 ngです。
<ol><li>タグ付け、PCR増幅、インデックス作成<ol><li>0.2 mL チューブに、2.5 μL のタグメンテーションバッファーと 2 μL のインプット gDNA (2.0 ng/μL) を加えます。ピペッティングで穏やかに混ぜます。</li>
		<li>1 μLの増幅バッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で280 x g で1分間スピンダウンします。</li>
		<li>サンプルをサーモサイクラー( 材料表を参照)に入れ、次のPCRプログラムを実行します:55°Cで5分間、次に10°Cで保持します。 サンプルが10°Cに達したら、直ちに反応を中和するために進行する。</li>
		<li>1 μLの中和バッファーをサンプルチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>各インデックスアダプター(インデックスi7およびi5)1.7 μLとインデックスPCRマスターミックス3 μLを加えます。ピペッティングで穏やかに混ぜます。室温で280 x g で1分間スピンダウンします。</li>
		<li>サンプルをサーモサイクラーに入れ、72°Cで3分間、95°Cで30秒間、95°Cで10秒間、55°Cで30秒間、72°Cで30秒間、72°Cで5分間の18サイクルで2回目のPCR反応を行い、10°Cで保持します。</li>
	</ol></li>
	<li>増幅されたライブラリのクリーンアップ<ol><li>市販の磁気ビーズ溶液( 材料表を参照)をメーカーのガイドラインに基づいてボルテックスして混合します。</li>
		<li>タグ付き/インデックス付きgDNAサンプルを新しい1.5 mLチューブに移し、gDNAサンプルの最終容量(≈13 μL)のμLごとに0.6 μLの磁気ビーズを追加します。ピペッティングで穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>上清が透明になるまで、サンプルチューブを磁気ラック( 材料の表を参照)に2分間置きます。ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除き、廃棄します。</li>
		<li>新たに調製した80%エタノール200 μLを混合せずに添加します。溶出液が透明になるまで30秒間インキュベートし、ビーズを乱すことなく上清を注意深く除去して廃棄します。</li>
		<li>2番目の洗浄ステップを実行します。200 μLの80%エタノールをビーズに加え、30秒間インキュベートします。溶出液が透明になったら、上清を取り出して廃棄し、ビーズを10分間風乾します。</li>
		<li>15 μLの10 mMトリスバッファー(pH 8)をビーズに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で2分間インキュベートします。サンプルチューブを再び磁気ラックに2分間置き、上清を取り除きます。</li>
		<li>14 μLの上清をサンプルチューブから新しい0.2 mLチューブに慎重に移します。これはクリーンアップされたライブラリです。 注:この時点で、クリーンアップされたライブラリは-20°Cで最大7日間保存できます。</li>
	</ol></li>
	<li>ライブラリの正規化<ol><li>ステップ3.2.5を除き、ステップ3.2に記載されるように蛍光アッセイによってクリーンアップされたライブラリを定量することに進む。</li>
		<li>クリーンアップしたライブラリを1%アガロースゲル電気泳動で可視化し、平均フラグメントサイズを決定します。</li>
		<li>次の式を使用してライブラリのモル濃度値を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64404/64404eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
		<li>モル濃度の値を使用して、再懸濁バッファー(RSB)とクリーンアップされたライブラリの適切な容量を計算し、個々のライブラリを開始濃度10 nMで希釈します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. ライブラリのプーリング、非自然化、シーケンサーの開始
<ol><li>製造元の指示に従って試薬カートリッジを解凍します。フローセルを冷蔵庫(4°C)から取り出し、室温に戻してからシーケンシングします。</li>
	<li>正規化された各ライブラリ(10 nM)の5 μLを低結合1.5 mLチューブにプールします。プールされたライブラリを適切な容量のRSBで4 nMで希釈します。</li>
	<li>プールされたライブラリ (4 nM) 5 μLと0.2 N NaOHの5 μLを新しい低結合1.5 mLチューブに加えます。ボルテックスで短時間混合し、280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、プールされたライブラリを一本鎖に変性させます。</li>
	<li>10 μLの変性プールライブラリと990 μLのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が行われるまで氷上に置きます。変性プールライブラリの濃度は20pMである。</li>
	<li>2 μLのコントロールライブラリ(10 nM)と3 μLのヌクレアーゼフリー水を混合することにより、4 nMの濃度でコントロールライブラリ( 材料の表を参照)を解凍して調製します。</li>
	<li>5 μLのコントロールライブラリ(4 nM)と5 μLの新たに調製した0.2 N NaOHを混合します。ボルテックスで短時間混合し、280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、コントロールライブラリを一本鎖に変性させます。</li>
	<li>10 μLの変性コントロールライブラリと990 μLのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が完了するまで氷上に置きます。変性コントロールライブラリの濃度は20pMである。</li>
	<li>新しい低結合1.5 mLチューブで、20 pMで594 μLの変性プールライブラリと20 pMで6 μLの変性コントロールライブラリを組み合わせます。適切に混ぜます。</li>
	<li>プレチルドハイブリダイゼーションバッファーを使用して、最終ライブラリミックス(20 pM)を600 μLの容量で最終負荷濃度1.2 pMに希釈します。</li>
	<li>最終的なライブラリミックスを試薬カートリッジにロードする前に、追加の熱前処理を実行して、フローセルへの効率的なロードを実現します。最終ライブラリーミックスを96°Cで2分間インキュベートします。 チューブを反転させて混合し、チューブを氷の上に5分間置きます。</li>
	<li>500 μLの最終ライブラリミックスを試薬カートリッジの設計したリザーバーにロードします。ガイドラインに従ってシーケンスを開始します。フローセルと試薬カートリッジをロードし、シーケンシングランを設定します。</li>
</ol>6. シーケンスデータ解析
注:一般的なWGSデータの前処理、ソフトウェア、パラメータ設定、および大腸菌ゲノムの配列解析の詳細については、補足ファイル1を確認してください。
<ol><li>シーケンシングデータサーバーに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。</li>
	<li>生のシーケンスデータの初期品質をサードパーティ製ソフトウェアで評価します。生のシーケンシング・データから、レムナント・アダプター・シーケンス、低品質の塩基(<q30 bp>補足ファイル1を参照)。</q30></li>
	<li>サードパーティ製ソフトウェアを使用して、品質チェックされたシーケンスデータをコンティフォールドレベルまたはスキャフォールドレベルにアセンブルします( 補足ファイル1を参照)。</li>
	<li>組み立てられたゲノムを含むFASTAファイルをRASTサーバーに送信することにより、ゲノムアノテーションを実行します(https://rast.nmpdr.org/)。</li>
	<li>FASTAファイルをゲノム疫学センター(CGE)(http://www.genomicepidemiology.org/services/)およびClermonTyping(http://clermontyping.iame-research.center/index.php)ウェブプラットフォームにアップロードして、疫学的特徴、ARG、VAG、およびプラスミドを特定します(補足ファイル1を参照)。</li>
	<li>FASTAファイルをPHASTERサーバーにアップロードして、プロファージ配列を特定します(https://phaster.ca/)。</li>
</ol>

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<li>Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+strategies+for+the+assembly+of+diverse+bacterial+genomes+using+MinION+long-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing.</a> BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).</li>
<li>Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+stability+among+O3%3AK6+V.+parahaemolyticus+pandemic+strains+isolated+between+1996+to+2012+in+American+countries%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomic+Data%22%5BJournal%5D)">Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries.</a> BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).</li>
<li>FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: 
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<li>Rantsiou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+microbiological+risk+assessment%3A+opportunities+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+foodborne+pathogen+surveillance%2C+source+tracking+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment.</a> International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

この研究は、病原性 大腸菌 変異体のゲノム特性評価のためのベンチトップシーケンサーとパイプラインを使用した細菌WGSワークフローの適応を示しています。使用するシーケンシングプラットフォームに応じて、特に増殖の遅い細菌を研究する場合、ウェットラボ手順(細菌培養、gDNA抽出、ライブラリ調製、シーケンシング)およびシーケンス分析のターンアラウンドタイム(TAB)は異なる場合があります。上記のWGSのプロトコルに従って、TATは4日以内であり、これは文献が現在述べているもの(<5日) 34に匹敵する。
大腸菌ACM5のゲノム配列決定の理論的カバレッジの深さは30倍と計算されました。それにもかかわらず、シーケンシングは38倍の深さでゲノムアセンブリの経験的データを生成しました。以前に推奨されたように35、これは全ゲノム表現を取得し、大腸菌ACM5の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴に関する下流のデータ分析を追跡するのに十分でした。抗菌...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64404">Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing</a>. The Authors section was updated from:
Jos&#233; Antonio Maga&#241;a-Liz&#225;rraga1, 
Bruno G&#243;mez-Gil2, 
Julissa Enciso-Ibarra2, 
Mar&#237;a Elena B&#225;ez-Flores1 
1Unidad de Investigaciones en Salud P&#250;blica &#8220;Dra. Kaethe Willms&#8221;, Facultad de Ciencias Qu&#237;mico Biol&#243;gicas, Universidad Aut&#243;noma de Sinaloa, Ciudad Universitaria 
2Centro de Investigaci&#243;n en Alimentaci&#243;n y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatl&#225;n en Acuicultura y Manejo Ambiental
to:
Jos&#233; Antonio Maga&#241;a-Liz&#225;rraga1, 
Bruno G&#243;mez-Gil2, 
Julissa Enciso-Ibarra2, 
Mar&#237;a Elena B&#225;ez-Flores1 
1Unidad de Investigaciones en Salud P&#250;blica &#8220;Dra. Kaethe Willms&#8221;, Facultad de Ciencias Qu&#237;mico Biol&#243;gicas, Universidad Aut&#243;noma de Sinaloa 
2Centro de Investigaci&#243;n en Alimentaci&#243;n y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatl&#225;n en Acuicultura y Manejo Ambiental

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Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing

水産養殖は、世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、その生産慣行は、人間の消費に対する増大する食料需要を満たすことを目的としています。世界の養殖生産量は、1997年の3,400万トン(Mt)から2017年には112Mtに3倍になりました1。生産の75%近くに貢献している主な種グループは、海藻、コイ、二枚貝、ナマズ、ティラピア(オレオクロミス 属)でした。1. しかし、微生物主体による病気の出現は、集中的な養殖のために避けられず、潜在的な経済的損失につながる2.
魚の養殖慣行における抗生物質の使用は、生産性の主な制限要因である細菌感染の予防と治療でよく知られています3,4。それにもかかわらず、残留抗生物質は水産養殖の堆積物と水に蓄積し、選択圧を発揮し、魚に関連する細菌群集と存在する細菌群集を改変します5,6,7,8。その結果、水産養殖環境は抗菌薬耐性遺伝子(ARG)の貯蔵庫として機能し、周囲の環境で抗生物質耐性菌(ARB)がさらに出現および拡散します9。魚の養殖慣行に影響を与える一般的に観察される細菌性病原体に加えて、エンテロバクター属、大腸菌、クレブシエラ属、サルモネラ属菌のヒト病原体株を含む腸内細菌科のメンバーにしばしば遭遇します10。大腸菌は、魚の養殖において魚粉と水から分離された最も一般的な微生物です11、12、13、14、15。
大腸菌は、哺乳類や鳥類の腸内細菌叢の共生メンバーとして胃腸管に生息する多用途のグラム陰性菌です。しかし、大腸菌は、土壌、堆積物、食物、水など、さまざまな環境ニッチにコロニーを形成し、存続する適応性の高い能力を持っています16。遺伝子水平伝播(HGT)現象による遺伝子の増減により、大腸菌は急速に適応した抗生物質耐性病原体に進化し、ヒトおよび動物に広範囲の疾患を引き起こす可能性があります17,18。単離起源に基づいて、病原性変異体は、腸病原性大腸菌(InPEC)または腸外病原性大腸菌(ExPEC)として定義される。さらに、InPECとExPECは、疾患の発現、遺伝的背景、表現型形質、および病原性因子(VF)に従って明確に定義された病理型に細分化されます16,17,19。
病原性大腸菌株の伝統的な培養と分子技術により、さまざまな病型の迅速な検出と同定が可能になりました。ただし、それらは時間と手間がかかり、多くの場合、高度な技術トレーニングが必要になる場合があります19。さらに、大腸菌のすべての病原性多様体は、その遺伝的背景が複雑なため、単一の方法を使用して確実に研究することはできません。現在、これらの欠点は、ハイスループットシーケンシング(HTS)技術の出現によって克服されています。全ゲノムシーケンシング(WGS)アプローチとバイオインフォマティクスツールは、微生物DNAの探索を手頃な価格で大規模に改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にしました20,21,22。生物学的な質問に応じて、いくつかのバイオインフォマティクスツール、アルゴリズム、およびデータベースを使用してデータ分析を実行できます。たとえば、主な目標がARG、VF、およびプラスミドの存在を評価することである場合、ResFinder、VirulenceFinder、PlasmidFinderなどのツールと、それらに関連するデータベースが適切な出発点になる可能性があります。Carriço et al.22は、生データの前処理から系統発生的推論まで、微生物WGS分析に適用されるさまざまなバイオインフォマティクスソフトウェアと関連データベースの詳細な概要を提供しました。
いくつかの研究は、抗菌薬耐性属性、病原性の可能性、および多様な起源に由来する大腸菌の臨床的に関連する変異体の出現と進化的関係の追跡に関するゲノム調査のためのWGSの幅広い有用性を実証しています23,24,25,26.WGSは、希少または複雑な耐性メカニズムを含む、抗菌剤に対する表現型耐性の根底にある分子メカニズムの同定を可能にしました。これは、獲得されたARG変異体、薬物標的遺伝子における新規変異、またはプロモーター領域27、28を検出することによるものである。さらに、WGSは、細菌株の耐性表現型に関する事前知識を必要とせずに抗菌剤耐性プロファイルを推測する可能性を提供する29。あるいは、WGSは、抗菌剤耐性と病原性の特徴の両方を持つ可動遺伝要素(MGE)の特性評価を可能にし、既存の病原体の細菌ゲノム進化を推進してきました。たとえば、2011年のドイツの大腸菌発生の調査中にWGSを適用した結果、明らかに新しい大腸菌の病理型のユニークなゲノム特徴が明らかになりました。興味深いことに、これらのアウトブレイク株は、腸管出血性大腸菌(EHEC)の病型30から志賀毒素をコードするプロファージを獲得した腸凝集性大腸菌(EAEC)グループに由来します。
この研究は、ベンチトップシーケンサーを使用した細菌WGSのワークフローの方法論的適応を示しています。さらに、Webベースのツールを使用してバイオインフォマティクスパイプラインが提供され、結果の配列を分析し、バイオインフォマティクスの専門知識が限られているかまったくない研究者をさらにサポートします。記載された方法により、2011年にメキシコのシナロア州で内陸養殖オレオクロミス属から単離された病原性大腸菌ACM5株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を解明することができました12。

<table><tbody><tr><td>Accublock Mini digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D0100</td><td>チューブのインキュベーション用ドライバス</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>DNAライブラリ精製用溶液中の磁気ビーズ</td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix Inc.</td><td></td><td>gDNA抽出されたDNAの品質を確認するUV-Vis分光光度計</td></tr><tr><td>LoBindチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030108418</td><td>DNAライブラリプーリング用1.5mL PCRチューブ</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>磁気ビーズベースのDNA精製に使用される磁気マイクロチューブラック</td></tr><tr><td>グラム陰性マルチバックI.D.</td><td>診断研究 (メキシコ)</td><td>PT-35</td><td>市販の抗菌剤感受性試験用ディスク</td></tr><tr><td>MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-420-1004</td><td>Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)</td></tr><tr><td>MiniSeq System Instrument</td><td>Illumina</td><td>SY-420-1001</td><td>Benchtop sequencer used for Next-generation</td></tr> sequencing <tr><td>MiniSpin centrifuge</td><td>エッペンドルフ</td><td>5452000816</td><td>チューブ用標準遠心分離機</td></tr><tr><td>Nextera XT DNAライブラリ調製キット</td><td>イルミナ</td><td>FC-131-1024</td><td>シーケンシング用のDNAライブラリを実行するための試薬。24サンプル用のボックス1およびボックス2試薬が含まれています</td></tr><tr><td>Nextera XTインデックスキットv2</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001、FC-131-2002、FC-131-2003、FC-131-2004</td><td>インデックスセット A、B、C、D</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>シーケンシング用DNAライブラリコントロール</td></tr><tr><td>精密ウォーターバス</td><td>LabCare America</td><td>51221081</td><td>細菌培養に使用されるウォーターバスシェーカー</td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HSアッセイキット</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33231</td><td>Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>Fluorometer used for fluorescence assay&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit Assay tubes</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assays&nbsp;</td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific</td><td>A24811</td><td>DNAライブラリ増幅に使用</td></tr><tr><td>Spectronic GENESYS 10 Vis</td><td>Thermo</td><td>335900</td><td>抗菌剤感受性試験における細菌懸濁液に使用</td></tr><tr><td>ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research Inc.</td><td>D4300</td><td>ゲノムDNA抽出用キット(50プレップ)</td></tr></tbody></table>

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing

水産養殖は世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、ティラピア(オレオクロミス属)養殖は養殖される主要な淡水魚の品種を構成しています。水産養殖は人為的発生源に由来する微生物汚染の影響を受けやすいため、抗生物質の広範な使用が必要であり、養殖システムは、大腸菌(大腸菌)などの抗生物質耐性菌および病原性細菌の重要な発生源になります。ここでは、内陸養殖オレオクロミス属から回収された病原性大腸菌株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を、全ゲノムシーケンス(WGS)およびインシリコ分析によって解明しました。抗菌薬感受性試験(AST)およびWGSを実施した。さらに、系統発生グループ、血清型、多遺伝子座配列タイピング(MLST)、獲得された抗菌剤耐性、病原性、プラスミド、およびプロファージ含有量を、利用可能な多様なWebツールを使用して決定しました。大腸菌分離株はアンピシリンに対する中程度の感受性のみを示し、WGSベースのタイピングによってONT:H21-B1-ST40株として特徴付けられました。単一の抗菌薬耐性関連遺伝子のみが検出されたが[mdf(A)]、非定型腸病原性大腸菌(aEPEC)病型からのいくつかの病原性関連遺伝子(VAG)が同定された。さらに、大きなプラスミドグループと18のプロファージ関連領域からのプラスミドレプリコンの貨物が検出されました。結論として、メキシコのシナロア州の養魚場から回収されたaEPEC分離株のWGS特性評価は、その病原性の可能性と生の水産養殖製品を消費することによる人間の健康リスクの可能性についての洞察を可能にします。環境微生物を研究するための次世代シーケンシング(NGS)技術を活用し、健康問題がどのように発生するかを知るためにワンヘルスフレームワークを採用する必要があります。

抗菌薬感受性はディスク拡散法によって決定され、6つの異なる抗菌クラス、すなわちアミノグリコシド、βラクタム、フルオロキノロン、ニトロフラン、フェニコール、および葉酸経路アンタゴニストにまたがる12の抗生物質のCLSIブレークポイント基準によって解釈されました。 大腸菌 ACM5は、1つのβラクタム薬を除くすべての抗生物質に対して感受性を示しました。4つのβラクタム薬がテストされました:アンピシリン、カルベニシリン、セファロチン、およびセフォタキシム。これらのうち、アンピシリンに対する14 mm阻害ハローを測定した。したがって、アンピシリンのCLSI解釈カテゴリー(感受性:≥17mm;中間:14-16mm;耐性:≤13mm) 32によれば、 大腸菌 ACM5はアンピシリンに対する中間感受性を示す。
大腸菌ACM5をベンチトップシーケンサーを用いてWGSに供した。したがって、DNAサンプルを調製し、マルチプレックス化し、記載されたプロトコルに従って配列決定した。全体として、中間出力構成...

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。

Aquaculture is one of the fastest-growing food-producing sectors worldwide and tilapia (Oreochromis spp.) farming constitutes the major freshwater fish ...

全ゲノムシーケンシング(WGS)は、ゲノム調査と抗菌薬耐性表現型の根底にある分子メカニズムの特定を通じて、抗菌薬耐性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ワールドゲノムシーケンシングは、DNA、細菌DNAの大規模な探索を改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にします。次世代シーケンシングは、臨床現場での病原体の診断、治療、監視、および発生源追跡のためのツールを考慮して、微生物とその抗菌薬耐性プロファイルの迅速な同定と特性評価を提供します。次世代シーケンシング方法論は、臨床環境だけでなく、環境環境、そして重要な食品の安全性においても、病原体の監視と発生源追跡において決定的な役割を果たすことができます。現在、これは日常的な手法ではありません。確かに、手順の少しはすべて、彼らが実験をどれほど成功させたかを理解しやすくするでしょう。手順を実演するのは、私たちのワーキンググループのゲノミクス技術者であるジュリッサエンシソイバラです。細菌DNAを抽出および定量した後、2.5マイクロリットルのタグメンテーションバッファーを追加します。0.2ミリリットルのチューブに2マイクロリットルの投入G D N Aを入れ、ピペッティングにより混合する。1マイクロリットルの増幅バッファーを加え、ピペットを上下に動かして混合します。次に、チューブを280Gで1分間回転させます。サンプルを摂氏55度のサーモサイクラーに5分間入れ、続いて摂氏10度で保持します。1マイクロリットルの中和バッファーをサンプルチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。チューブをスピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、各インデックスアダプター1.7マイクロリットルとインデックスPCRマスターミックス3マイクロリットルを追加します。成分を混合した後、室温で1分間280Gでスピンダウンする。サンプルをサーモサイクラーに入れ、原稿に記載されているように2回目のPCR反応を行います。次に、市販の磁気ビーズ溶液をボルテックスで混合します。メーカーのガイドラインに従って。タグ付きまたはインデックス付きG D N Aサンプルを新しいものに移し、G D N Aサンプルの最終容量の各マイクロリットルに0.6マイクロリットルの磁気ビーズを追加します。ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。上清がなくなるまで、サンプルチューブを磁気ラックに2分間置きます。ビーズを乱さずに上清を慎重に廃棄してください。次に、混合せずに200マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを追加します。溶出液が透明になるまで30秒間インキュベートし、ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除きます。この手順を繰り返し、ビーズを10分間風乾します。次に、ピペッティングで穏やかに混合したビーズに15マイクロリットルの10ミリモルトリスバッファーを加え、室温で2分間インキュベートします。サンプルチューブを磁気ラックに2分間置き、上清が透明になるまで待ちます。その後、14マイクロリットルの上清をサンプルチューブから新しい0.2ミリリットルのチューブに慎重に移し、クリーンアップしたライブラリを入手します。製造元の指示に従って試薬カートリッジを解凍します。正規化されたライブラリの5マイクロリットルを低結合の1.5ミリリットルのチューブに引き込み、プールされたライブラリを適切な量のRSBで4ナノモルに希釈します。次に、プールされたライブラリと0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットルずつ、新しい低結合の1.5ミリリットルチューブに追加します。プールされたライブラリをシングルストランドに変性させるには、ボルテックスによってチューブを混合します。1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの変性プールライブラリー990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーを加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。シーケンサーローディングの最終希釈が行われるまで、チューブを氷上に置きます。2マイクロリットルのコントロールライブラリと3マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を混合することにより、4ナノモルの濃度でコントロールライブラリを注ぎ、調製します。次に、コントロールライブラリと新たに調製した0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットル加えます。前述のように、コントロールライブラリを一本鎖に変性させます。10マイクロリットルの変性コントロールライブラリーと990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が完了するまで氷上に置きます。新しい低結合の1.5ミリリットルチューブで、594マイクロリットルの変性プールライブラリと6マイクロリットルの変性コントロールライブラリを組み合わせます。適切に混合し、プレチルドハイブリダイゼーションバッファーを使用して、最終ライブラリーミックスを600マイクロリットルの容量で1.2ペコモルの最終負荷濃度に希釈します。最終的なライブラリミックスを試薬カートリッジにロードする前に、追加の熱前処理を実行して、フローセルへの効率的なロードを実現します。最終的なライブラリミックスを摂氏96度で2分間インキュベートします。チューブを反転させて混合し、チューブを氷の上に5分間置きます。500マイクロリットルの最終ライブラリミックスを試薬カートリッジの設計リザーバーにロードします。シーケンサーを開始した後、試薬カートリッジをロードし、フローセル、シーケンシングランをセットアップした。データ解析のために、シーケンシングデータサーバーに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。生のシーケンスデータの初期品質をサードパーティのソフトウェアで評価します。未加工のシーケンスデータからレムナントアダプターシーケンス、低品質の塩基、およびショートリードを削除します。サードパーティのソフトウェアを使用して、品質チェックシーケンスデータをコンティグレベルまたはスキャフォールディングレベルにアセンブルします。アセンブルされたゲノムを含むPhasterファイルをRASTサーバーに送信することにより、ゲノムアノテーションを実行します。Phasterファイルをゲノム疫学センターとクレアモントタイピングWebプラットフォームにアップロードして、疫学的特徴を特定します。ARGS、VAGSおよびプラスミド。PhasterファイルをPhasterサーバーにアップロードして、プロファージシーケンスを特定します。ゲノムアノテーションは、5, 633のコードされた特徴を明らかにし、そのうち5, 524はタンパク質コーティング遺伝子であり、109はRNA関連配列である。予測された大腸菌株は、フィログループB1および配列タイプ40に属する。抗菌剤耐性決定基であるMDFをコードする遺伝子を広域スペクトル多剤排出ポンプに同定した。また、熱安定エンテロトキシンである血清耐性タンパク質および3型分泌系をコードする遺伝子とその分泌エフェクタータンパク質も同定された。コード配列は、サブシステムと呼ばれる機能的に関連するタンパク質のコレクション、特に炭水化物、タンパク質、アミノ酸、誘導体代謝および膜輸送において機能的役割を果たすものにグループ化されます。優れたラボプラクティスは、すべてのプロトコルを通じて基本です。ただし、断面DNAライブラリの調製中に複数のサンプルを処理する場合は、交差汚染を避けるために特別な注意を払う必要があります。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

ここでは、推定ファージ遺伝子の機能的特徴付けのための現象的アプローチを提示します。技術には、宿主の同化代謝を監視できる開発されたアッセイ、マルチ表現型アッセイプレート(MAP)、確立されたメタボロミクスの方法に加えて、異化代謝への影響を測定することができます。...

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル...

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

ここでは、協調検出およびサルモネラの quasimetagenomic シーケンスを通じてサブタイピングの食糧および環境内細菌叢解析からの DNA のサンプルを準備するためのプロトコルを提案する.併用文化濃縮、原因菌分離 (IMS)、複数の変位の増幅 (MDA) により、サルモネラ食糧および環境試料からゲノム DNA...

食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析

ここで提示されるマルチローカス可変数のたてがみ分析(MLVA)アッセイは、魚病原性細菌エルシニアラッケリの安価で堅牢でポータブルな高解像度ジェノタイピングを可能にします。純粋な培養から始まり、アッセイは多重PCRおよび毛細血管電気泳動を採用し、下流の適用のための10遺伝子座MLVAプロフィールを作り出す。...

多重PCRと毛細血管電気泳動による魚病原性細菌エルシニアラッケリの多軌変動数のカンデム繰り返し分析

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。...

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

この分析計算プラットフォームは、細菌集団ゲノミクスに関心のある微生物学者、生態学者、疫学者に実用的なガイダンスを提供します。具体的には、ここで提示された研究は、i)階層遺伝子型の系統発生誘導マッピングを実行する方法を示した。ii)遺伝子型の周波数ベースの分析;iii)親族関係とクローン性分析iv)系統鑑別補助遺伝子座の同定。...

細菌集団における階層遺伝子型とアクセサリゲノム遺伝子座のヒューリスティックマイニング

本研究では、染色体配列が既に知られている場合や興味がない場合のプラスミドのナノ孔シーケンシングのワークフローを記述しています。初期のプラスミドDNA濃縮ステップは、最適なプラスミド配列深度を確保し、フローセルあたりのシーケンス可能なサンプル数を最大化します。...

ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぶ全ゲノムシーケンス解析のバイオインフォマティクスパイプライン構築手法。抗微生物耐性メカニズムの解明と臨床・食品安全への応用可能性を探索する計算的手法です。

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション全ゲノムシーケンシングを使用する農場

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