オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場
2022年12月23日
ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。
全ゲノムシーケンシング(WGS)は、ゲノム調査と抗菌薬耐性表現型の根底にある分子メカニズムの特定を通じて、抗菌薬耐性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ワールドゲノムシーケンシングは、DNA、細菌DNAの大規模な探索を改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にします。次世代シーケンシングは、臨床現場での病原体の診断、治療、監視、および発生源追跡のためのツールを考慮して、微生物とその抗菌薬耐性プロファイルの迅速な同定と特性評価を提供します。
次世代シーケンシング方法論は、臨床環境だけでなく、環境環境、そして重要な食品の安全性においても、病原体の監視と発生源追跡において決定的な役割を果たすことができます。現在、これは日常的な手法ではありません。確かに、手順の少しはすべて、彼らが実験をどれほど成功させたかを理解しやすくするでしょう。
手順を実演するのは、私たちのワーキンググループのゲノミクス技術者であるジュリッサエンシソイバラです。細菌DNAを抽出および定量した後、2.5マイクロリットルのタグメンテーションバッファーを追加します。0.2ミリリットルのチューブに2マイクロリットルの投入G D N Aを入れ、ピペッティングにより混合する。
1マイクロリットルの増幅バッファーを加え、ピペットを上下に動かして混合します。次に、チューブを280Gで1分間回転させます。サンプルを摂氏55度のサーモサイクラーに5分間入れ、続いて摂氏10度で保持します。
1マイクロリットルの中和バッファーをサンプルチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。チューブをスピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、各インデックスアダプター1.7マイクロリットルとインデックスPCRマスターミックス3マイクロリットルを追加します。
成分を混合した後、室温で1分間280Gでスピンダウンする。サンプルをサーモサイクラーに入れ、原稿に記載されているように2回目のPCR反応を行います。次に、市販の磁気ビーズ溶液をボルテックスで混合します。
メーカーのガイドラインに従って。タグ付きまたはインデックス付きG D N Aサンプルを新しいものに移し、G D N Aサンプルの最終容量の各マイクロリットルに0.6マイクロリットルの磁気ビーズを追加します。ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。
上清がなくなるまで、サンプルチューブを磁気ラックに2分間置きます。ビーズを乱さずに上清を慎重に廃棄してください。次に、混合せずに200マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを追加します。
溶出液が透明になるまで30秒間インキュベートし、ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除きます。この手順を繰り返し、ビーズを10分間風乾します。次に、ピペッティングで穏やかに混合したビーズに15マイクロリットルの10ミリモルトリスバッファーを加え、室温で2分間インキュベートします。
サンプルチューブを磁気ラックに2分間置き、上清が透明になるまで待ちます。その後、14マイクロリットルの上清をサンプルチューブから新しい0.2ミリリットルのチューブに慎重に移し、クリーンアップしたライブラリを入手します。製造元の指示に従って試薬カートリッジを解凍します。
正規化されたライブラリの5マイクロリットルを低結合の1.5ミリリットルのチューブに引き込み、プールされたライブラリを適切な量のRSBで4ナノモルに希釈します。次に、プールされたライブラリと0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットルずつ、新しい低結合の1.5ミリリットルチューブに追加します。プールされたライブラリをシングルストランドに変性させるには、ボルテックスによってチューブを混合します。
1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの変性プールライブラリー990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーを加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。シーケンサーローディングの最終希釈が行われるまで、チューブを氷上に置きます。
2マイクロリットルのコントロールライブラリと3マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を混合することにより、4ナノモルの濃度でコントロールライブラリを注ぎ、調製します。次に、コントロールライブラリと新たに調製した0.2ノルマル水酸化ナトリウムをそれぞれ5マイクロリットル加えます。前述のように、コントロールライブラリを一本鎖に変性させます。
10マイクロリットルの変性コントロールライブラリーと990マイクロリットルのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が完了するまで氷上に置きます。新しい低結合の1.5ミリリットルチューブで、594マイクロリットルの変性プールライブラリと6マイクロリットルの変性コントロールライブラリを組み合わせます。適切に混合し、プレチルドハイブリダイゼーションバッファーを使用して、最終ライブラリーミックスを600マイクロリットルの容量で1.2ペコモルの最終負荷濃度に希釈します。
最終的なライブラリミックスを試薬カートリッジにロードする前に、追加の熱前処理を実行して、フローセルへの効率的なロードを実現します。最終的なライブラリミックスを摂氏96度で2分間インキュベートします。チューブを反転させて混合し、チューブを氷の上に5分間置きます。
500マイクロリットルの最終ライブラリミックスを試薬カートリッジの設計リザーバーにロードします。シーケンサーを開始した後、試薬カートリッジをロードし、フローセル、シーケンシングランをセットアップした。データ解析のために、シーケンシングデータサーバーに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。
生のシーケンスデータの初期品質をサードパーティのソフトウェアで評価します。未加工のシーケンスデータからレムナントアダプターシーケンス、低品質の塩基、およびショートリードを削除します。サードパーティのソフトウェアを使用して、品質チェックシーケンスデータをコンティグレベルまたはスキャフォールディングレベルにアセンブルします。
アセンブルされたゲノムを含むPhasterファイルをRASTサーバーに送信することにより、ゲノムアノテーションを実行します。Phasterファイルをゲノム疫学センターとクレアモントタイピングWebプラットフォームにアップロードして、疫学的特徴を特定します。ARGS、VAGSおよびプラスミド。
PhasterファイルをPhasterサーバーにアップロードして、プロファージシーケンスを特定します。ゲノムアノテーションは、5, 633のコードされた特徴を明らかにし、そのうち5, 524はタンパク質コーティング遺伝子であり、109はRNA関連配列である。予測された大腸菌株は、フィログループB1および配列タイプ40に属する。
抗菌剤耐性決定基であるMDFをコードする遺伝子を広域スペクトル多剤排出ポンプに同定した。また、熱安定エンテロトキシンである血清耐性タンパク質および3型分泌系をコードする遺伝子とその分泌エフェクタータンパク質も同定された。コード配列は、サブシステムと呼ばれる機能的に関連するタンパク質のコレクション、特に炭水化物、タンパク質、アミノ酸、誘導体代謝および膜輸送において機能的役割を果たすものにグループ化されます。
優れたラボプラクティスは、すべてのプロトコルを通じて基本です。ただし、断面DNAライブラリの調製中に複数のサンプルを処理する場合は、交差汚染を避けるために特別な注意を払う必要があります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、微生物ゲノム調査にベンチトップ機器を使用する全ゲノムシーケンシング（WGS）戦略の実現可能性について議論します。抗菌薬耐性理解におけるWGSの重要性を強調し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインを提示します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物ゲノミクス
- 抗菌薬耐性
- バイオインフォマティクス
背景
- 全ゲノムシーケンシング（WGS）は細菌DNAの探索を助けます。
- 近縁の病原性変異体の特徴付けを容易にします。
- 次世代シーケンシングは微生物の迅速な同定に不可欠です。
- WGSは臨床現場ではまだ日常的な技術ではありません。
研究の目的
- 細菌分析にWGSワークフローを適応させる。
- 微生物ゲノム分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインを提示する。
- 抗菌薬耐性研究におけるWGSの役割を探る。
使用された方法
- ベンチトップ全ゲノムシーケンシング戦略。
- バイオインフォマティクス分析パイプラインの開発。
- 微生物ゲノムの特徴付け。
- 抗菌薬耐性プロファイルの評価。
主な結果
- 実験室使用のためのWGS方法論の成功的な適応。
- 包括的なバイオインフォマティクスパイプラインの開発。
- 抗菌薬耐性メカニズムの理解の向上。
- 臨床診断と食品安全における潜在的な応用。
結論
- WGSは微生物ゲノム調査の強力なツールです。
- 抗菌薬耐性の理解に重要な役割を果たします。
- 日常診療へのWGSのさらなる統合が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Whole-genome sequencing (WGS) enables comprehensive genomic profiling of pathogenic and antimicrobial-resistant microbes from aquaculture, directly informing risk assessment and surveillance strategies in food safety and environmental health. Integrating WGS into early discovery pipelines enhances predictive confidence in identifying virulence and resistance determinants, supporting portfolio decisions for translational research and public health interventions. This approach strengthens enterprise capabilities for rapid response to emerging microbial threats in the food supply chain.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide interrogation of resistance and virulence mechanisms in environmental isolates.
- Supports functional target validation by identifying key genetic determinants relevant to pathogenicity.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the molecular basis of antimicrobial resistance.
- Improves predictive confidence for prioritizing microbial targets in surveillance and intervention programs.
Screening & Assay Development
- Provides validated genomic data for developing molecular assays targeting resistance and virulence genes.
- Enables standardization of detection workflows for high-throughput screening of environmental and foodborne pathogens.
- Delivers quantitative outputs for benchmarking assay sensitivity and specificity.
- Supports scalable screening platforms for ongoing monitoring of microbial threats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genomic findings with translational biomarker discovery for food safety and public health applications.
- Ensures continuity from environmental surveillance to preclinical risk assessment of microbial contaminants.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for intervention strategies targeting high-risk strains.
- Provides mechanistic insights to guide translational research on antimicrobial resistance dissemination.
Pipeline & Workflow Integration
WGS-based characterization integrates into the discovery-to-surveillance continuum, bridging early detection, target validation, and translational risk assessment for environmental and foodborne pathogens.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on resistance and virulence gene prevalence in aquaculture-derived microbes.
- Screening: Supplies genomic benchmarks for assay development and validation in environmental monitoring workflows.
- Analytics: Delivers quantitative genomic outputs for comparative analysis of microbial strains and resistance profiles.
- Translational Research: Connects environmental genomics to preclinical evaluation of food safety risks.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic surveillance capability for ongoing risk management.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in identifying and tracking antimicrobial resistance and virulence factors.
- Operational Value: Standardizes genomic workflows for reproducible and scalable pathogen characterization.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making for intervention and surveillance investments.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbial threats in food safety and public health portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomics, bioinformatics, and microbial ecology for data interpretation.
- Demands access to benchtop sequencers and robust computational infrastructure for data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and library preparation to prevent contamination.
- Must adapt workflows for diverse environmental and foodborne microbial samples.
- Dependent on quality control and data validation steps to ensure actionable outputs.
