Name: ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶ、ライム病病原体Borrelia burgdorferiにおけるファージ媒介DNA導入法。電気穿孔法に代わる遺伝子導入技術で、薬剤耐性遺伝子の転導とPCR確認法を含む完全プロトコルを解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、Shawna Reed、D. Scott Samuels、Patrick Secorの有益な議論と、技術支援を提供してくれたVareeon (Pam) Chonweerawongに感謝したいと思います。この研究は、生物医科学部とクイニピアック大学健康科学部のクリスチャンH.エガーズへの教員研究助成金によってサポートされました。

著者は開示するものは何もありません。

形質導入の使用は、B. burgdorferi 1,4,13,37の電気変換に関連する生物学的および技術的障壁の少なくともいくつかを克服する1つの方法を表すことができる。多くの系において、バクテリオファージは、一般化形質導入または特殊化形質導入のいずれかによって、細菌細胞間で宿主(非プロファージ)DNAを移動させることができる22、23、24、49、50。特殊な形質導入では、いくつかの宿主遺伝子が常にプロファージDNA49,50とともにファージ...

スピロヘータ細菌ボレリア・ブルグドルフェリの遺伝子操作のためのツールの開発は、ライム病の性質の理解に計り知れない価値を追加しました1,2,3,4。B. burgdorferiは、小さな線状染色体と直鎖状および環状プラスミドの両方からなる異常に複雑なゲノムを持っています5,6。自発的なプラスミド喪失、遺伝子内再配列(同じ生物内のあるプラスミドから別のプラスミドへの遺伝子の移動)、および遺伝子の水平移動(HGT、2つの生物間のDNAの移動)は、B. burgdorferiの間で目まぐるしい量の遺伝的不均一性を引き起こしました(例として、Schutzerら7を参照)。結果として生じる遺伝子型(または「株」)はすべて同じ種のメンバーですが、異なる哺乳類宿主に伝達し感染する能力に影響を与える遺伝的差異があります8、9、10、11。このレポートでは、「株」という用語は、特定の自然由来の遺伝的背景を持つB.ブルグドルフェリを指すために使用されます。用語「クローン」は、特定の目的のために、または実験的操作の結果として遺伝子改変された株を指すために使用されるであろう。
B. burgdorferiで使用できる分子ツールボックスには、選択マーカー、遺伝子レポーター、シャトルベクター、トランスポゾン突然変異誘発、誘導性プロモーター、および逆選択マーカーが含まれます(レビューについては、Drektrah and Samuels12を参照)。これらの方法論を効果的に使用するには、目的のB.ブルグドルフェリ株に異種(外来)DNAを人工的に導入する必要があります。B. burgdorferiでは、異種DNAの導入は、電気パルスを利用して細菌膜を培地に導入されたDNAの小片に対して一過性に透過させる方法であるエレクトロポレーションによってほぼ独占的に達成される1。大部分の細胞(≥99.5%と推定)はパルスによって殺されますが、残りの細胞は異種DNAを保持する頻度が高い13。細菌にDNAを導入する最も効率的な方法の一つと考えられていますが、B. burgdorferiへのエレクトロポレーションの頻度は非常に低いです(5細胞に1つの形質転換体×104から5×106細胞の範囲)13。より高い頻度の変換を達成するための障壁は、技術的および生物学的の両方であるように思われます。B. burgdorferiのエレクトロポレーションを成功させるための技術的障壁には、必要なDNAの量(>10μg)と、エレクトロコンピテントセルを調製する際のスピロヘータが正確に正しい成長段階(中ログ、2×10 7細胞・mL−1と7 × 107細胞・mL−1の間)の両方が含まれます12,13。ただし、これらの技術的障壁は、生物学的障壁よりも克服しやすい場合があります。
ライム病の研究者は、B.ブルグドルフェリクローンが遺伝的に操作される能力に関して2つの大きなカテゴリーに分けることができることを認識しています13,14。高継代、実験室適応分離株は、しばしば容易に形質転換されるが、通常は感染力に必須のプラスミドを失い、生理学的に異常な挙動を示し、哺乳類宿主に感染することも、ダニベクター内で持続することもできない12,13。これらのクローンは、実験室内でスピロヘータの分子生物学的に解剖するのに有用でしたが、風土病サイクルの生物学的文脈の中でスピロヘータを研究するためにはほとんど価値がありません。一方、低継代感染分離株は、感染状態を反映した生理学的に振る舞い、感染サイクルを完了することができますが、通常は異種DNAの導入に難解であるため、研究のために操作することは困難です12,13。低継代分離株の形質転換の難しさは、少なくとも2つの異なる要因に関連している:(i)低継代分離株は、特にエレクトロポレーションに必要な高密度条件下で、しばしば緊密に凝集し、したがって、多くの細胞が電荷の完全な適用または培地中のDNAへのアクセスのいずれかを遮断する13,15;(ii)B.ブルグドルフェリは、高継代分離株で失われる可能性のある少なくとも2つの異なるプラスミド媒介制限修飾(R-M)系をコードする14,16。R-Mシステムは、細菌が外来DNAを認識して排除できるように進化しました17。実際、B. burgdorferiのいくつかの研究では、DNAのソースが大腸菌ではなくB. burgdorferiである場合に形質転換効率が向上することが示されています13,16。残念ながら、エレクトロポレーションに必要な高濃度のDNAをB. burgdorferiから取得することは、費用と時間のかかる見通しです。エレクトロポレーションおよび低継代分離株を選択する際の別の潜在的な懸念は、このプロセスが、重要な病原性関連プラスミドlp2514,18,19を失った形質転換体に有利に働くように見えることです。したがって、エレクトロポレーションを介して低継代B.ブルグドルフェリ単離株を遺伝的に操作する行為そのものが、風土病サイクル20内の生物学的に関連する分析に適さないクローンを選択し得る。これらの問題を考えると、異種DNAを高継代B.ブルグドルフェリクローンに電気変換し、エレクトロポレーション以外の方法で低継代感染分離株に移すことができるシステムは、ライム病スピロヘータで使用できる分子ツールのコレクションの増加に歓迎すべき追加となる可能性があります。
形質転換(裸のDNAの取り込み)に加えて、細菌が異種DNAを定期的に取り込むメカニズムは他に2つあります:互いに直接物理的に接触している細菌間のDNAの交換であるコンジュゲーションと、バクテリオファージによって媒介されるDNAの交換である形質導入21。実際、HGTを媒介するバクテリオファージの能力は、多数の細菌系内の分子プロセスを解剖するための実験ツールとして使用されてきた22、23、24。B. burgdorferiは裸のDNAの取り込みに自然有能ではなく、B. burgdorferiが接合を成功させるために必要な装置をコードしているという証拠はほとんどありません。 しかし、以前の報告では、B. burgdorferi25,26,27,28の温帯バクテリオファージであるφBB-1の同定と予備的な特性評価が記載されている。φBB-1は、B. burgdorferi25内に見られる30 kbプラスミドのファミリーをパッケージ化します。このファミリーのメンバーはCP32に指定されています。Stevensonらは、B. burgdorferi株間のHGTへの参加におけるφBB-1の役割と一致して、他の点では異なるcp32を持つ2つの株で同一のcp32が見つかったことを報告し、おそらく形質導入を介して、これら2つの株間でこのcp32が最近共有されていることを示唆しています29。また、他の点では比較的安定したゲノム30,31,32,33のcp32の間でHGTを介した有意な組換えの証拠もあります。最後に、φBB-1がcp32sおよび異種シャトルベクターDNAの両方を、同じ株の細胞間および2つの異なる株の細胞間で形質導入する能力は、以前に実証されている27,28。これらの知見から、φBB-1はB. burgdorferiの分子生物学解剖のための別のツールとして提案されている。
このレポートの目的は、 B. burgdorferiからファージφBB-1を誘導および精製する方法を詳述し、 B. burgdorferi クローン間の形質導入アッセイを実行し、潜在的な形質導入物質を選択およびスクリーニングするためのプロトコルを提供することです。

<table><tbody><tr><td>1 Lフィルターユニット(PES、0.22 &micro;ミリ</td><td>ポアシグマ</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mmチューブ(デュアルポジションキャップ)(ポリプロピレン)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td>は<td>、低ボイドボリュームで4 mLを保持します(誘導用)</td></tr><tr><td>15 mL円錐遠心チューブ(ポリプロピレン)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-メチル-3-ニトロソ-ニトログアニジン(MNNG)</td><td>ミリポアシグマ</td><td></td><td>注意:潜在的な発がん性物質;もはや容易に入手できない、テストされていない代替</td></tr><tr><td>5.75インチパスツールピペット(綿栓/ホウケイ酸ガラス/非滅菌)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-8A</td><td>オートクレーブを使用する前に</td></tr><tr><td>50mL円錐形遠心分離チューブ(ポリプロピレン)</td><td>USAサイエンティフィ</td>ック<td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>無臭エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>LEドットサイエンティフィック株式会社</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>バクト ネオペプトン</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>バクト TC イェストレート</td><td>ギブコ</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (血清交換グレード)</td><td>ジェミニ バイオプロダクツ</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム (分子生物学用)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1145-1</td><td>注意:揮発性有機物、化学フュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>CMRL-1066 w/o L-グルタミン (粉末)</td><td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>エリスロマイシン</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン試薬溶液</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>グルコース (デキストロース無水)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0.22 &micro;M孔径)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLGSM33SS</td><td>抗生物質やその他の少量溶液をろ過滅菌</td></tr><tr><td>マイトマイシンC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP25312</td><td>注意:発がん性物質の可能性がある;化学ヒュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>N-アセチル-D-グルコサミン</td><td>MP バイオメディカルズ、LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド(PCR用プライマー)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (全ゲノム抽出キット)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 mm &times; 15 mm)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 計数チャンバー</td> ハウ<td>サー科学</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>ペトロフハウザー計数チャンバーカバーガラス</td><td>ハウサー科学</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 8000 (PEG)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ血清非滅菌微量溶血ヤング(NRS)</td><td>Pel-Freezバイオロジカルズ</td><td>31119-3</td><td>メーカーの指示に従って熱不活化セミ</td></tr><tr><td>ミクロUV透明キュベットUSA</td><td>サイエンティフィック</td><td>9750-9150</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S1804-500G</td><td>BSK用クエン酸ナトリウム</td></tr></tbody></table>

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

スピロヘータ ボレリア・ブルグドルフェリ への外来DNAの導入は、エレクトロポレーションを用いた形質転換によってほぼ独占的に達成されてきた。このプロセスは、他のよりよく特徴付けられたグラム陰性菌と比較して 、ライム病スピロヘータの効率が著しく低い。形質転換の成功率は、特定のバックグラウンドからの高品質のDNAが濃縮されていることに大きく依存し、株ごとに大きなばらつきがあります。外来DNA(すなわち、シャトルベクター、蛍光レポーター、および抗生物質耐性マーカー)を B.ブルグドルフェリ に導入するための代替手段は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のための有用なツールの兵器庫への重要な追加となる可能性があります。バクテリオファージは、形質導入と呼ばれるプロセスにおける細菌間のDNAの移動の自然なメカニズムとしてよく認識されています。本研究では、ユビキタスボレリアファージφBB-1を用いて、同じ遺伝的背景と異なる遺伝的背景の両方を持つ B.ブルグドルフェリ 細胞間でDNAを形質導入する方法を開発しました。形質導入されたDNAには、ボレリアDNAと異種DNAの両方が小さなシャトルベクターの形で含まれています。この実証は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のためのエレクトロポレーションの補完としてのファージ媒介形質導入の潜在的な使用を示唆している。本報告では、 B. burgdorferi由来のファージφBB-1の誘導および精製方法、形質導入アッセイにおけるこのファージの使用、および潜在的な形質導入物質の選択およびスクリーニングについて述べる。

より容易に形質転換可能なB. burgdorferi株または電気変換に抵抗性のあるクローン間でDNAを移動するためのバクテリオファージの使用は、ライム病の決定要因の継続的な分子調査のための別のツールを表しています。本明細書に記載される形質導入アッセイは、潜在的な形質導入物質の選択のために1つまたは2つの抗生物質のいずれかを使用して、目的の任意のクローン間のDNAの移動を容易にするために必要に応じて改変することができる。高継代株CA-11.2Aクローンと高継代株B31クローンおよび低継代毒性株297の両方との間のプロファージDNAと異種大腸菌/B.ブルグドルフェリシャトルベクターの両方の形質導入が以前に実証されています28。以下に示す結果は、2つの高継代病原性クローン間のプロファージDNAの移動を示しています。ドナークローンc1673は、プロファージDNA27,28上のカナマイシン耐性遺伝子をコードするB.ブルグドルフェリ株CA-11.2Aクローンであ...

細菌細胞間でDNAを移動するバクテリオファージの能力は、それらを細菌宿主の遺伝子操作のための効果的なツールにします。ここで紹介するのは、 ボレリア・ブルグドルフェリのバクテリオファージであるφBB-1を誘導、回収、および使用して、ライム病スピロヘータの異なる株間で異種DNAを形質導入するための方法論です。

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

このプロトコルは、ライム病剤ボレリア・ブルグドルフェリの分子生物学を解剖するための別の重要なツールを説明しているので重要である。この技術の主な利点は、ファージ形質導入を使用することにより、エレクトロポレーションのように電気パルスの適用を必要とせずにボレリア・ブルグドルフェリにDNAを導入するための代替方法を提供することである。この方法は、ボレリア・ブルグドルフェリがその風土病サイクルに持続し、最終的にヒトにライム病を引き起こすために使用する分子メカニズムへのさらなる洞察を提供するために使用できます。まず、150マイクロリットルの適切なボレリア・ブルグドルフェリクローンを、形質導入プロトコル用の密閉された滅菌円錐形遠心チューブ内の15ミリリットルのBSKに接種します。次に、ボレリア・ブルグドルフェリクローン内の異種DNAの選択と維持のために、適切な濃度の抗生物質または抗生物質の組み合わせを培地に補給し、摂氏33度でサンプルをインキュベートします。培養物が成長した後、適切な量の培養液を6, 000 Gで10分間遠心分離します。上清をデカントした後、新鮮なBSKでペレットを4ミリリットルに再懸濁し、最小限のヘッドスペースでサンプルを保持するために利用可能な最小の滅菌チューブにサンプルを移します。次に、ファージ産生を誘導するために、培養容量4ミリリットルに基づく推奨濃度に適量の誘導剤を添加し、チューブをしっかりと蓋をして、完全に混合します。サンプルを摂氏33度で2〜4時間インキュベートします。次に、サンプルを15ミリリットルの遠沈管に移します。サンプルを6, 000 Gで10分間遠心分離します。上清をデカントした後、細胞ペレットを15ミリリットルのBSKに再懸濁します。サンプルを摂氏33度で72〜96時間インキュベートしながら、原稿に記載されている適切な抗生物質濃度で準備した培養物を補充します。PEG沈殿用の溶液を調製するには、原稿に記載されているように、500ミリリットルの5モル塩化ナトリウム、500ミリリットルの40%PEG、および100ミリリットルの懸濁培地を準備します。滅菌するには、溶液をオートクレーブし、使用前に冷却し、室温または摂氏4度で保管します。ドナーのボレリア・ブルグドルフェリクローンからのファージのPEG沈殿の場合、72〜96時間のインキュベーション後、サンプルを摂氏4度で20分間8, 000 Gで遠心分離します。上清を清潔な50ミリリットルの円錐管にデカントし、細胞ペレットを廃棄します。5モルの塩化ナトリウムを1モルの最終濃度まで加えます。よく混ぜた後、室温で1時間穏やかに揺り動かします。サンプルを 8 , 000 G で摂氏 4 度で 10 分間遠心分離します。前に示したように上清をきれいな50ミリリットルの円錐管にデカントした後、上清に40%PEG-8000溶液を最終濃度10%まで加えますよく混ぜ、一晩まで1時間以上氷の上に置きます。前述のように、摂氏4度で20分間、8, 000 Gでサンプルに遠心分離します。上清を廃棄し、ファージ粒子を含むペレットを失うことなく、できるだけ多くの余分な液体を取り除きます。懸濁培地を使用してペレットを最小量の懸濁培地に再懸濁し、ボトルの側面を洗い流し、潜在的なファージ粒子を収集します。回収したファージサンプルを、再懸濁液の量に基づいて等量のクロロホルムで処理します。サンプルをよく混合し、8, 000 Gで10分間遠心分離します。次に、水層をきれいなチューブに除去し、厚い界面層のいずれかを避けます。回収された体積を決定した後、最初のクロロホルム処理に続いて、その体積の10%に等しい量のクロロホルムでサンプルを再度処理する。水層をきれいなチューブに移し、界面や有機層を避けます。ファージをすぐに使用するか、摂氏4度で保存してください。以前に実証したように、形質導入アッセイでレシピエントとして使用するボレリア・ブルグドルフェリ培養物を調製した後、培養液を6, 000 Gで10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを14.5ミリリットルの新鮮なBSKに再懸濁します。 500マイクロリットル以下のPEG沈殿ファージサンプルをレシピエントクローンの培養物に加えます。よく混合した後、摂氏33度で72〜96時間インキュベートします。原稿に記載されているようにPEG沈降ファージと混合した後に固相プレーティングによる形質導入体の選択を行う。レシピエントクローンのバックグラウンドに応じて、10〜21日間のインキュベーション後に、選択プレート上のアガロース内にコロニーが現れることを確認します。滅菌綿栓の5.75インチホウケイ酸ピペットを使用して、両方の抗生物質の存在下でプレート上で成長する少なくとも5〜10個のコロニーを選び、適切な抗生物質を含む1.5ミリリットルのBSKに接種します。遺伝子のPCR増幅は、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性をコードする10個のクローンに対して行った。カナマイシン耐性遺伝子は、ドナーc1673および潜在的な形質導入体から増幅することができたが、レシピエントc1706からは増幅できなかった。同様に、ゲンタマイシン耐性遺伝子は、レシピエントc1706および潜在的な形質導入体から増幅され得るが、ドナーからは増幅されず、形質導入事象を表す。カナマイシン耐性カセットがドナーからレシピエントへ5BB1によって形質導入されたことを実証する。形質導入体のバックグラウンドは、菌株特異的マーカーを用いて決定した。c1673クローンとCA-112Aバックグラウンドは特定のアンプリコン4、5、および6をエンコードしますが、高継代B31バックグラウンドを持つc1706はエンコードしません。同様に、形質導入体1および2はアンプリコン4、5および6を欠いており、クローンがc1706バックグラウンドを有し、c1673からカナマイシン耐性遺伝子を獲得したことを示している。ファージのPEG沈殿については、ファージの収量を最大化するためにすべてのステップを慎重に実行し、再懸濁したファージをクロロホルムで完全に処理して、ファージの使用および保存前にできるだけ多くのPEGおよび培地汚染物質を除去します。形質導入アッセイが正常に実行され、形質導入剤が検証されると、これらのクローンは、遺伝子組み換えボレリア・ブルグドルフェリを必要とする質問に答えるために利用可能になります。この技術の開発により、エレクトロポレーションによるDNAの導入が現在困難なボレリア・ブルグドルフェリ株を遺伝子操作できるようになることが期待されます。

phage-mediated-genetic-manipulation-lyme-disease-spirochete-borrelia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ライム病の調査研究は、多くの場合、病原体ボレリアブルグドルフェリ、通常は数週間かかるプロセスに感染したダニの発生を必要とする。ここでは、時間内で達成可能なマイクロインジェクションベースのダニの感染症の手順を示しています。我々はまた、ダニの中でB.ブルグドルフェリのin...

ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

出典: Eggers、CHライム病スピロヘータボ レリアブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作。 J. Vis. 経験。 (2022年)このビデオでは、抗生物質耐性遺伝子を保有する休眠バクテリオファージDNAで操作された遺伝子組み換えボ レリア・ブルグドルフェリ...

ウイルス粒子生産のための ボレリア・ブルグドルフェリ 培養物の調製と誘導

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Phage Purification from Borrelia burgdorferi

ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。...

ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

Nested pcr 法は、ライム病ライム病の病原のプローブ DNA を抽出し目盛りに適用できる敏感な具体的で、わかりやすい手法です。最初の PCR 実験は遺伝子特定のプライマーを使用し、内部のプライマーを使用して後続の反応のためのテンプレートとなる長い amplicons...

Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

インビトロ 転写アッセイは、 ボレリエラ・ブルグドルフェリにおける転写調節のメカニズムを解読することができる。このプロトコルでは、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼを精製し、 in vitro 転写反応を実行する手順について説明します。 in vitro 転写アッセイを用いた実験的アプローチでは、活性RNAポリメラーゼの信頼性の高い精製と保存が必要です。...

ボレリエラ(ボレリア)ブルグドルフェリの必須成分 in vitro転写アッセイ

体外培養は、生菌の存在を直接検出する方法です。このプロトコルは、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体、再発熱ボレリア種、およびボレリア・ミヤモトイのものを含む、多様なボレリア・スピロヘータの培養方法について説明しています。これらの種は潔癖で成長が遅いですが、培養することができます。...

ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト・コンプレックスと再発熱ボレリアからのスピロヘータの栽培方法

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。...

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

ここでは、タイプIとタイプIIを使用するための方法を報告する...

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。...

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

学ぶ、ライム病病原体Borrelia burgdorferiにおけるファージ媒介DNA導入法。電気穿孔法に代わる遺伝子導入技術で、薬剤耐性遺伝子の転導とPCR確認法を含む完全プロトコルを解説します。

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

さらに動画を探す