ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

蝸牛全体をデジタル化できるライトシート顕微鏡を開発しました。この顕微鏡は、小さなマウス蝸牛から大きな人間の側頭骨まで画像化できる長い作動距離のエアマウント対物レンズを備えています。それは、機械的破壊を引き起こすことなく、レーザービームで蝸牛を連続的に切断します。

私たちのイメージング法は、加齢による有毛細胞や螺旋神経節ニューロンの喪失など、蝸牛の病理学的変化を評価するために使用できます。マウスを安楽死させて斬首した後、脳を通して背腹切開を行い、頭蓋骨を半切除します。脳を取り除き、頭蓋骨の基底部にある丸い雄牛を特定します。

ロンジャーでブラを開きます。次に、蝸牛を視覚化して取り除きます。倍率5倍の解剖顕微鏡下で、楕円形の窓に穴を開け、鋭いピックでテープを取り除きます。

次に、丸い窓にピックを挿入して、膜に穴を開けます。固定を行うには、開いた丸い窓を、2ミリリットルのホルマリンで満たされた1ミリリットルの注射器に取り付けられた輸液セットのカットチップで覆います。2分間にわたって蝸牛の外リンパ腔からホルマリンをゆっくりと注入し、開いた楕円形の窓からホルマリンが蝸牛から出ていることを確認します。

蝸牛から余分な組織を取り除きます。10%ホルマリンを含むボトルに浸し、ローテーターに一晩置きます。脱灰のために、蝸牛をPBSでそれぞれ5分間3回すすいでください。

EDTAの10%溶液を含むボトルに浸します。ローテーションで4日間インキュベートし、毎日溶液を変えます。次に、蝸牛をPBSで3回灌流し、交換の間に15分間浸してすべてのEDTAを除去します。

洗浄後、各濃度で30分間エタノール濃度の上昇で蝸牛を脱水する。ローダミンB溶液に一晩回転しながら浸漬することにより、蝸牛全体を染色します。100%エタノールを2回交換し、交換ごとに5分間インキュベートして、蝸牛から余分な染料を取り除きます。

染色した蝸牛を2つの交換物に移します スパルテホルツ溶液 各変更で30分間。回転しながらクリアリングソリューションに一晩放置します。楕円形と丸い窓の膜の端にある標本棒に蝸牛を取り付けます。

透明化溶液が蝸牛内に残り、気泡が形成されていないことを確認してください。UV活性化接着剤を使用して、湿った蝸牛の楕円形と丸い窓の端を乾燥した標本ロッドに取り付けます。UV光で蝸牛の周りを移動して、UV接着剤を10秒間硬化させます。

X/Z平行移動ステージにも取り付けられている回転ホルダーに取り付けられた試料ロッドを使用して、Spalteholz溶液で満たされた光学的に透明な石英蛍光光度計セルのイメージングチャンバーに蝸牛を吊り下げます。次に、カスタム設計のプログラムを使用して、X軸とZステップでライトシートを介して標本を移動し、蝸牛全体に2D画像のスタックを作成します。画像を処理するには、画像スタックを別のコンピューターに転送し、3D再構成と定量化のために3Dレンダリングプログラムにロードします。

マウス蝸牛の直接ボリュームレンダリングは、楕円形と円形の窓、有毛細胞を持つコルティの器官を示し、ローゼンタール管はセグメント化され、ボリュームレンダリングされ、その長さに沿ってらせん状神経節ニューロン(SGN)を示しました。TSLIMを用いて、生後3ヶ月の若いマウスと23ヶ月齢のマウスの蝸牛を画像化し、SGNについてカウントした。 線形プロットに描かれたローゼンタールの運河距離の関数としてのSGN細胞数は、年配の動物と比較して、蝸牛の中央端と頂端の若い動物でより大きなSGNを示しました。

この SGN の明らかな損失は、クラスター分析と 3D レンダリング ソフトウェアを使用して視覚化されました。SGN濃度の違いは、高密度クラスターが黄色で、青が低密度領域を表すカラースケールで表されました。クラスター解析は、ローゼンタール管の長さに沿って細胞密度の低い領域を明確に示しました。

ライトシート顕微鏡は、構造の3Dボリュームレンダリングを生成できる画像の整列したスタックを生成するように設計されています。3Dレンダリングプログラムにより、構造と異なる構造間の解剖学的関係の定量的評価が可能になります。ただし、3Dレンダリングプログラムはさまざまなユーザーパラメーターを提供するため、これらのプログラムを効果的に使用するにはかなりの学習曲線があります。