Name: フラグメンテーション、ホモジナイズ、および連続ろ過の組み合わせを使用したウシ卵巣からの小さな前胞卵胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ、ウシ卵巣から前胞卵胞を分離する機械的手法。組織チョッパーとホモジナイザーを用いて、生存可能な初期前胞卵胞を効率的に収集する方法です。生殖生物学と不妊治療の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトは、USDAマルチステートプロジェクトW4112とカリフォルニア大学デービス校ジャストロシールズ賞によってSMに部分的に資金提供されました。
著者らは、すべての実験で使用されたウシの卵巣を提供してくれたセントラルバレーミート社に感謝の意を表したいと思います。著者らはまた、卵巣処理と卵胞の分離を支援してくれたオリビア・シルベラに感謝します。

著者は開示するものは何もありません。

本プロトコルは、ウシ卵巣から、特に一次および初期の二次段階で、初期段階の前胞状卵胞を回収するための再現可能な方法を詳述している。このプロトコルは、以前のレポート20、25、30、34、35、36に基づいており、個々の卵巣から意味のある数の卵胞を分離する最適化を提供します。この方法を使用して単離された前胞卵胞は実行可能であり、タンパク質の免疫局在化や遺伝子発現の分析のためのRNA抽出などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。この研究では、単離された卵胞の培養は試みられなかった。しかし、現在、小さなウシ前胞卵胞の長期培養を成功させるための取り組みが進行中であり、これはこのプロトコルの重要な下流アプリケーションであり、卵巣卵胞形成の理解を向...

卵巣卵胞は卵巣の機能単位であり、配偶子(卵母細胞)の産生、ならびに生殖機能と全体的な健康に重要なホルモンの産生に関与しています。原始卵胞は、種に応じて胎児の発育中または新生児期に卵巣に形成され1、女性の卵巣予備能を構成します。卵胞の成長は、休息プールを離れて成長期に入る原始卵胞の活性化から始まります。前胞形成は、前庭発育前のすべての卵胞段階を網羅し、これら2つの細胞型間の緊密なコミュニケーションによって駆動される、卵母細胞および周囲の顆粒膜細胞の同期形態学的および代謝的変化を必要とする非常に動的なプロセスです2,3。前胞卵胞は、いつでも卵巣に見られる卵胞単位の大部分を構成します4。卵胞形成の前期までの発達は、胞状発達よりも数週間長いと推定されており5,6、この時間は、卵母細胞と体細胞が発達の最終段階(すなわち、胞状段階)に入るのに十分な成熟を獲得し、排卵、受精、および胚発生の準備をするために必要な7,8,9。
卵巣前胞卵胞形成に関する現在の知識の多くは、マウスモデル10、11、12、13から来ており、これは、より小さく、線維性の低い卵巣からこれらの卵胞を多数回収することが容易であることに一部起因しています。ウシの卵巣から多数の前胞胞が分離されたという報告は約30年前にさかのぼりますが14、これらの初期段階の卵胞の発達を調節するプロセスに関するより完全な理解は、主に、特に発生の初期段階で、十分な数の生存可能な前胞卵胞を回収するための最適化され、効率的で、再現性のある方法がないため、実現されていません。ヒトの生殖補助医療における将来の使用のために卵巣予備能を保存することへの関心が高まるにつれ、牛は卵巣構造がより類似しているため、魅力的なモデルになります15。しかし、ウシ卵巣はマウス卵巣16と比較してコラーゲンが著しく豊富であり、マウスについて記載された方法を用いた機械的単離は非常に非効率的である。生殖能力保存技術を拡大するための努力には、前胞卵胞の胞状段階への完全なin vitro成長、それに続く囲まれた卵母細胞の体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)、および胚の生産と移植が含まれます17。これまでのところ、このプロセス全体はマウス18でのみ達成されています。ウシでは、in vitroでの卵胞成長への進行は、培養開始時の卵胞段階が変動し、プロトコル間の培養の長さが変動するいくつかの報告に限定されています17,19。
ウシ卵巣からの前胞卵胞の収穫のための文献に記載されている方法は、単離または組み合わせて、機械的および酵素的技術を主に使用してきた2,14,17,20。ウシ前胞卵胞単離のためのプロトコルの最初の報告では、組織ホモジナイザーと連続ろ過を使用して卵巣全体を処理しました20。この研究に続いて、コラゲナーゼ14を利用した機械的手順と酵素的手順を組み合わせた報告が続きました。卵巣組織を消化するためにコラゲナーゼを利用する際の繰り返しのテーマは、卵胞の生存率を損なう可能性のある卵胞基底膜の損傷の潜在的なリスクです14,21,22,23。したがって、組織チョッパーと繰り返しピペッティングの使用、または均質化と組み合わせた組織チョッパーの使用など、機械的方法のさまざまな組み合わせが採用されてきました20、24、25、26。記載されている別の機械的技術は、針を利用して卵巣組織から直接前胞卵胞を解剖し、これはより大きな(>200μm)二次卵胞を単離するのに特に有用である。ただし、このプロセスは時間がかかり、より小さな前胞卵胞を分離するには非効率的であり、ウシの卵巣で試みた場合のスキルセットに依存します19,27,28。
文献に記載されているさまざまな技術を利用して、このプロトコルは、酵素溶液でのインキュベーションを回避する、単純で一貫性のある効率的な方法で、単一のウシ卵巣からの前胞卵胞の分離を最適化することを目的としていました。前胞卵胞の単離方法を改善することは、卵胞形成のこの段階の理解を深め、前胞卵胞を前胞期に発達させるための効果的な培養システムの開発を可能にする機会を提供します。ウシ種などの大型哺乳類から前胞卵胞を単離するための本明細書に記載される詳細な手順は、ヒトに翻訳可能な非マウス種における初期の卵胞形成の研究を目指す研究者にとって不可欠であろう。

<table><tbody><tr><td>5-3/4 "ソーダ ライム 使い捨てガラス パスツールピペット</td><td>デュラン ウィートン キンブル</td><td>63A54</td><td>ペトリ皿内を検索しながら破片から卵胞を取り除くために使用できるパスツールピペット</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>4% に希釈; 免疫染色のための卵胞の固定</td></tr><tr><td>20 mL ルアーロック シリンジ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>Z116882-100EA</td><td>18 G針と一緒に使用して、40 &mu;m細胞ストレーナー</td></tr><tr><td>#21 滅菌メスブレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-365-023</td><td>卵巣を切断し、髄質を取り除くために使用されます</td></tr><tr><td>40 &mu;m セルストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>300 &mu;m細胞ス</td></tr><tr><td>トレーナー104 mmプラスチック漏斗</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-348C</td><td>サイズは異なる場合がありますが、チーズクロスが適切にカットされ、卵巣の均質性が</td></tr><tr><td>300 &mu以上こぼれないようにしてください。m Cell Strainer</td><td>pluri選択&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>チーズクロスから濾液をろ過するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>500 mL Erlenmeyer Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>の FB500500</td><td>チーズクロスから濾液を捕らえるために使用したフラスコ&nbsp;</td></tr><tr><td>エアタイト滅菌針18 G</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-817-151</td><td>18 Gは、40 &mu;m細胞ストレーナー</td></tr><tr><td>エアタイト滅菌針 27 G 13 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-817-171</td><td>卵胞が詰まっている破片を操作するために使用できる針</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 ソリューション</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BDB561908</td><td>蛍光 DNA 染色</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>卵胞洗浄培地の成分</td></tr><tr><td>チーズクロス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71748-00</td><td>卵巣ホモジネートの最初のフィルタリングステップは、大きな組織の破片を除去することを意味</td></tr><tr><td>クラシックダブルエッジ安全カミソリブレード</td><td>ウィルキンソンソード</td><td>N / A</td><td>カミソリブレードは、McIlwainティッシュチョッパーに最適に適合し、すぐに鈍くしない</td></tr><tr><td>ロバアンチウサギ二次抗体、アレクサフルオット488</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21206</td><td>免疫染色用二次抗体</td></tr><tr><td>アイスコ ラテックスピペットバルブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S29388</td><td>パスツールピペットで使用するゴム球</td></tr><tr><td>HEPESバッファー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H3375</td><td>卵胞洗浄培地の成分</td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>卵巣組織を均質化して卵胞を放出する&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>蛍光免疫局在の分析に使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>均質化に十分な大きさの卵巣組織を切断するために使用される</td></tr><tr><td>顕微鏡 - ステレオスコープ</td><td>オリンパス</td><td>SZX2-ILLT</td><td>濾液から卵胞を検索して収穫するために使用される解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡 - 倒立</td><td>ニコン</td><td>Diaphot 300</td><td>単離卵胞の高倍率明視野可視化に使用される倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡 - 倒立</td><td>エコー</td><td>Revolve R4</td><td>単離卵胞の高倍率明視野および落射蛍光可視化に使用される倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>卵胞洗浄媒体の滴を覆うオイルで、探索中の蒸発を防止します</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>卵胞洗浄培地の成分</td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-001</td><td>免疫染色ブロッキングバッファー用試薬</td></tr><tr><td>Nunc 体外受精用4ウェル皿</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>144444</td><td>卵胞単離および洗浄用4ウェル皿</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>卵胞洗浄媒体の成分</td></tr><tr><td>ペトリ皿 60 mm OD x 13.7 mm</td><td>テッド・ペラ</td><td>10184-04</td><td>マキルウェイン組織チョッパー</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td>に最適なペトリ皿 フィ<td>ッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP665-1</td><td>卵巣および卵胞用洗浄緩衝液</td></tr><tr><td>プラスチックまな板</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>09-002-24A</td><td>安全に切断するのに十分なサイズのまな板卵巣</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン(PVP)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP431-100</td><td>PBSにPVP(0.1%w / v)を添加すると、卵胞がプレートまたは互いに付着するのを防ぎます&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36930</td><td>蛍光標識細胞または組織用封入剤</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNAカラムクリーンアップキット</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 ポリクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 一次抗体免疫染色用</td></tr><tr><td>RevertAid RT 逆転写キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K1691</td><td>cDNA 合成キット</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液 (1N/認証済み)</td> <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS266-1</td><td>培地のpHを7.6-7.8に上昇させるために使用されます</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>毛包洗浄媒体スクエア</td></tr><tr><td>ペトリ皿の成分100 mm x 15 mm&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>60872-310</td><td>グリッドシャーレは、卵胞のより効率的な識別を可能にします&nbsp;</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix for PCR reaction</td></tr><tr><td>Steritop Threaded Bottle Top Filter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>卵胞洗浄培地の滅菌に使用</td></tr><tr><td>SYBRセーフDNAゲル染色</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S33102</td> アガロースゲルTCM199<td>上のビジュアルPCR産物への染色</td></tr> with <tr><td>Hank's Salt</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>卵胞洗浄培地の成分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>免疫染色透過化緩衝液用洗剤</td></tr><tr><td>Trizol 試薬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>RNA 単離試薬</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>単離卵胞の生存率試験に使用</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>免疫染色用洗剤 洗浄バッファー</td></tr><tr><td>ウォーマープレート ユニバーサル</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>卵胞を38.5°に保つためのウォームプレート。顕微鏡で</td></tr><tr><td>Wiretrol II較正マイクロピペット</td><td>Drummond</td><td>50002-005</td>卵<td>胞を操作するためのガラスマイクロピペット</td></tr>を検索しながら</tbody></table>C

フラグメンテーション、ホモジナイズ、および連続ろ過の組み合わせを使用したウシ卵巣からの小さな前胞卵胞の分離

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

哺乳類の卵胞形成の全過程を理解することは、家畜、ヒト、絶滅危惧種の生殖補助医療を向上させるために重要です。研究は、特にウシ種などの大型哺乳類では、より小さな前胞状卵胞の分離が困難であるため、主に前胞状および大型前胞状卵胞に限定されてきました。この研究は、単一のウシ卵巣から多数の小さな前胞胞を回収するための効率的なアプローチを提示します。個々のウシ卵巣の皮質を組織チョッパーを使用して500μmの立方体にスライスし、10mmプローブを使用して9,000〜11,000rpmで6分間ホモジナイズしました。大きな破片をチーズクロスを使用してホモジネートから分離し、続いて300μmおよび40μmのセルストレーナーで連続ろ過しました。40μmストレーナーに保持された内容物を検索皿にすすぎ、そこで卵胞を特定し、一滴の培地に集めた。採取した卵胞の生存率をトリパンブルー染色 により 試験した。この方法では、約90分で単一のウシ卵巣から多数の生存可能な小さな前胞胞を単離することができます。重要なことに、この方法は完全に機械的であり、卵胞を損傷する可能性のある組織を解離するための酵素の使用を回避します。このプロトコルを使用して得られた卵胞は、RT-qPCR用のRNAの単離、特定のタンパク質の免疫局在化、 in vitro 培養などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

概要と重要な手順 このプロトコルを使用すると、小さなウシ前胞胞を実験的に関連する数で単一の卵巣から確実に分離できます。合計30回の反復から、反復あたり平均41個の卵胞が得られ、11〜135個の卵胞の範囲でした(図4A)。14回の反復において、卵胞は、実体顕微鏡下で1μmの顕微鏡キャリブレーションスライドを使用して卵胞直径を測定することによって、前述のように発達段階について特徴付けられた26 。この方法を使用して、合計476個の卵胞が一次(40〜79μmの卵胞)、初期二次(80〜119μm)、または二次(≥120μm)の卵胞のいずれかに分類されました(図4B)。原始卵胞は40μmのろ過ステップのために除外されました。卵胞生存率は、前述のようにトリパンブルー排除試験を用いて評価した30。単離した卵胞を、0.2%PVPを含むPBS中の0.05%(v / v)トリパンブルー中で1分間短時間イン...

前胞形成の研究を進めるには、単一の卵巣から卵胞を分離する効率的な方法が必要です。ここに提示されているのは、組織チョッパーとホモジナイザーを使用してウシの卵巣から卵胞を分離するための合理化された機械的プロトコルです。この方法は、単一の卵巣から多数の生存可能な前胞卵胞の収集を可能にする。

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

このプロトコルは、単一のウシ卵巣からの初期段階の前胞状卵胞の効率的かつ再現性のある単離を可能にし、非ウシ種における卵巣卵胞形成の研究のための新しい機会を生み出します。この技術は、単一の卵巣からより多くの卵胞を使用することにより、卵巣摘出前のin vivo治療、または卵巣生検を介して同じ動物からの複数のサンプルの経時的な観察を可能にします。初期段階の前胞胞の単離と凍結保存は、化学療法などの性腺毒性治療を受けている若い女性の生殖能力温存や、絶滅危惧種からの生殖質保存のための貴重な選択肢となる可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるステファニー・マクドネル、アマンダ・モートン、ジュリアナ・カンデラリアです。まず、実験室で卵巣をPen-Strepを含む温かい滅菌PBSに移し、多くの小さな胞状卵胞があり、目立った黄体がない卵巣を選択します。ハサミを使用して卵巣から余分な結合組織と脂肪を取り除きます。1つの卵巣をベンチペーパーのまな板に移します。メスを使用して、卵巣を一方の靭帯付着部位から反対側の付着部位まで縦方向に半分に切断します。卵巣の半分をまな板に置いて処理し、残りの半分をペンストレプトを含む温かいPBSに戻します。髄質を除去するには、露出した髄質を上に向けて皮質を切断せずに、表面から約2ミリメートル離れた卵巣の湾曲に沿ってスライスします。切り口を切り開いて髄質の大部分を取り除きます。上皮が上を向くように卵巣を半分裏返し、メスを使用して髄質を皮質から切断し、靭帯に接続された卵巣片の端の周りに残っている白い結合組織を切り取ります。髄質の大部分が除去されたら、メスを使用して皮質を約1ミリメートルの厚さに切断し、メスを小さな前後の動きで操作して残りの髄質を削り取り、各卵巣皮質を半分に2つに切断します。切り刻む準備ができるまで、皮質片をペンストレプトを含む温かいPBSに保管してください。皮質の1つの部分をティッシュチョッパーのペトリ皿に移し、Pen-Strepを含む3〜4滴の温かいPBSで組織を濡らします。鉗子で組織片をしっかりと保持しながら、リセットボタンを1回押してティッシュチョッパーを始動します。皮質全体がストリップに切断されたら、ブレードホルダーノブを使用してブレードをペトリ皿から持ち上げ、鉗子を使用してブレードから組織を取り除きます。プレートホルダーを90度回転させた後、もう一度リセットボタンを押して、ブレードをティッシュストリップに完全に通します。ブレードホルダーノブを使用してブレードをペトリ皿から持ち上げ、鉗子を使用してブレードから組織を取り除きます。トランスファーピペットとPen-Strepを含む温かいPBSを使用して、刻んだ組織を事前に温めた50ミリリットルの円錐形のチューブに洗浄します。円錐形のチューブを水またはビーズバスに戻し、刻んだ組織を暖かく保ちながら、卵巣の他の3つの半分でチョッピング手順を繰り返します。最良の切断結果を得るには、ナットドライバーを使用してチョッピングアームからナットを取り外し、ワッシャーとブレードクラスプを取り外します。鉗子を使用して、チョッピングアームからブレードを取り外します。未使用の端がペトリ皿に面するように裏返し、チョッピングアームに戻します。ホモジナイザーユニットが接続され、速度が2番目のバーに設定されていることを確認したら、メーカーの仕様に従って10ミリメートルのジェネレータープローブをユニットに挿入します。次に、タイマーを1分に設定し、1つの卵巣から刻んだ皮質組織と、チューブを25ミリリットルのラインまで満たすのに十分なPBSを含むPen-Strepを含む50ミリリットルの円錐管にプローブを挿入します。プローブを挿入する深さは、チャンバーの底から測定した液体の高さの1/3である必要があります。タイマーが開始したら、ホモジナイザーの電源を入れ、プローブの底がチューブに触れないようにし、ホモジナイザーがオンになっている間チューブを静止させます。1分間の均質化後、プローブをチューブから取り外し、ローターナイフとローターチューブの間のスペースにある通気孔を詰まらせている結合組織、または鉗子を使用してプローブに詰まった皮質片を取り除き、チューブに戻します。分散した組織をチーズクロスで覆われた漏斗に注ぎ、三角フラスコに挿入し、温かいPBSを使用してチューブの内容物を漏斗にすすぎます。最後に、温かいPBSでチーズクロスを洗い流します。ティッシュフラグメントの周りにチーズクロスをひねり、余分な液体とティッシュがすべてチーズクロスから取り除かれるまで絞ることにより、小さな破片の液体を布の穴に通します。漏斗の上でチーズクロスを再度開いた後、トランスファーピペットを使用してPen-Strepを含むPBSでチーズクロスをすすぎ、再び布を通して残留組織片を絞ります。止血材を使用して、300マイクロメートルのセルストレーナーを200ミリリットルのビーカーにかざし、セルストレーナーを通して三角フラスコにろ液を注ぎます。セルストレーナーがティッシュで詰まった場合は、ビーカーにそっと軽くたたいてから、ストレーナーを逆さまにして、大きな組織の破片をベンチペーパーにタップアウトします。組織片がなくなるまで、Pen-Strepを含む温かいPBSを使用してフラスコの内容物をすすぎ、細胞ストレーナーに注ぎます。次に、止血剤付きの40マイクロメートルのセルストレーナーを2番目の200ミリリットルのビーカーにかざしながら、最初の200ミリリットルのビーカーに存在するすべての初期濾液をストレーナーに注ぎ、次に組織片がなくなるまでPen-Strepを含む温かいPBSを使用してビーカーの内容物をすすぎ、細胞ストレーナーに注ぎます。18ゲージの針を20ミリリットルのシリンジに取り付けた後、シリンジに卵胞洗浄媒体を充填します。止血剤を使用して、40マイクロメートルのセルストレーナーを正方形のペトリ皿の上に逆さまに持ち、シリンジを使用してセルストレーナーの内容物を皿に洗い流します。正方形のペトリ皿を、ウォームステージを摂氏38.5度に設定し、倍率を1.25〜3.2倍に設定したステレオスコープに移します。正方形のペトリ皿から卵胞を同定した後、マイクロピペットを使用して卵胞を洗浄培地滴に移す。6分間の組織ホモジナイゼーションを使用した反復あたりの単離された前胞状卵胞の総数は、反復あたり平均41個の卵胞を示し、11〜135個の卵胞の範囲です。476個の単離された卵胞の発生段階の評価は、大部分が発達の初期段階にあり、1層の立方体顆粒膜細胞を含む40〜79マイクロメートルであることを示しました。卵巣皮質の6分間の均質化は、同じ速度での5分間の均質化と比較して、より多くの前胞状卵胞をもたらした。卵胞における顆粒膜細胞マーカーFSH受容体および生殖細胞マーカーDAZLの転写産物発現を逆転写定量PCRを用いて評価し、一次卵胞および初期二次卵胞の両方がFSH受容体およびDAZL転写産物を発現したことを実証した。単離された前胞状卵胞におけるCX37の免疫蛍光局在は、初代および初期二次段階の両方で、CX37がOプラズマに局在し、O部位の核および顆粒膜細胞の膜には存在しないことを示しています。私たちの経験では、皮質組織の薄層の適切な解剖、組織を適切なサイズに切り刻むこと、および適切な均質化は、組織からの生存可能な卵胞の放出を確実にするための重要なステップです。単離された前胞状卵胞は、前胞状卵胞の成長の調節や顆粒膜細胞と卵母細胞の間の相互作用の性質などの質問に答えるために使用でき、より効率的な培養条件の開発を促進します。

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

3Dフィブリン-アルギン酸相互貫入ネットワークにおける卵胞のカプセル化のための新しい方法が記載されている。このシステムは、成熟した卵母細胞を生成するために未熟な卵胞の発達をサポートするためにタンパク質分解と構造的な支持を兼ね備えています。このメソッドは、拡張を制限することなく、細胞間接触を維持するために培養細胞の集合体に適用してもよい。...

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

このビデオでは、採取したばかりのマウス卵巣からの胞状卵子の分離について説明しています。これらの胞状卵母細胞は、さらなる特性評価および発生研究に使用できます。...

マウス胞卵子の単離:新たに収穫されたマウス卵巣から胞卵子を単離する方法

このビデオでは、ブタの卵巣から卵丘-卵母細胞複合体またはCOCを分離する技術について説明しています。単離された無傷のCOCは、不妊治療を開発するための生殖補助技術である体外受精を実施するために使用できます。...

ブタ卵管卵子複合体の単離:体外受精のためのブタ卵巣卵胞から卵雲卵母細胞複合体を単離する技術

ここでは、3D培養条件でのブタ卵母細胞のカプセル化のための2つのプロトコルを示します。第1に、cumulus-oocyte複合体(COC)はフィブリンアルギン酸ビーズにカプセル化される。第2に、フッ素化エチレンプロピレン粉末粒子(マイクロバイオリアクター)で封入される。両システムは、3D組織を維持するために最適な条件を保証します。...

ポルシン卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解アルギン酸ヒドロゲルおよび疎水性マイクロバイオリアクター

開発初期段階で卵巣卵胞から卵母細胞を分離する手順と、完全に成長した段階までの成長と分化をサポートできるインビトロ培養システムのセットアップについて説明する。...

牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

ここでは、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するための簡単な方法を提示し、ゼブラフィッシュにおける卵巣の発達の調査を容易にする。...

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

ここでは、胞状卵胞からの卵巣細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。皮質ストリップの凍結保存のために卵巣全体を処理すると同時に、顆粒膜、テカ、内皮、造血、間質細胞など、複数の卵胞常在細胞タイプを遊離させるために酵素的に処理される無傷の胞状卵胞を採取する方法について詳しく説明しています。...

ヒト胞状卵胞からの系統特異的細胞の抽出、標識、精製

ここでは、凍結融解皮質組織からヒト卵巣卵胞を単離して遺伝子発現解析を行う方法を概説するプロトコルについて説明します。...

ヒト卵胞の遺伝子発現解析

ここでは、鳥類の排卵前卵胞で卵黄、顆粒膜細胞、およびテカ細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。この精密な取り扱いにより、生殖機能におけるこれらの層の役割に関する重要な調査が可能になり、卵胞の発生、ホルモン調節、および農業収量と生物医学的洞察を向上させるための疾患研究の理解に役立ちます。...

ダウンストリームアプリケーションのための鳥類の排卵前卵胞顆粒膜およびテカ細胞層の分離

このプロトコールは、チラミン結合ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマウス卵巣から前胞状卵胞をカプセル化し、培養するための新しい3次元(3D)培養モデルについて述べています。また、ガラス化による卵巣卵胞凍結保存への2つのアプローチについても詳しく説明します。...

新規ヒアルロン酸ハイドロゲルの三次元卵胞培養への応用とマウス卵巣卵胞凍結保存の方法論

この記事では、ウシテカ細胞と顆粒膜細胞の共培養モデルを紹介します。この方法は、卵胞内の体細胞間のパラクリンコミュニケーションと基質輸送の研究に焦点を当てた分析の信頼できる基盤として機能する可能性があります。...

ウシ卵巣における顆粒膜‐テカ細胞相互作用を理解するための改良共培養システム

学ぶ、ウシ卵巣から前胞卵胞を分離する機械的手法。組織チョッパーとホモジナイザーを用いて、生存可能な初期前胞卵胞を効率的に収集する方法です。生殖生物学と不妊治療の研究に応用可能です。

フラグメンテーション、ホモジナイズ、および連続ろ過の組み合わせを使用したウシ卵巣からの小さな前胞卵胞の分離

さらに動画を探す