カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

このin vitroの96ウェルプレートベースのプロトコルを使用して、カンジダバイオフィルム中の真菌細胞の代謝活性に対する新規抗真菌剤に対する抗体の阻害効果を試験することができます。他の方法と比較して、これはカンジダバイオフィルムの発生に対する抗体または抗真菌剤の効果を評価するための高感度、正確、ハイスループット、再現性、ユーザーフレンドリー、および費用効果の高い技術です。このアッセイは、侵襲性カンジダ症の重症度に関連するカンジダバイオフィルムに対するワクチン候補だけでなく、新規薬物ベースまたは抗体ベースの治療薬の有効性を評価するために使用できます。

この方法は、異なる真菌株または抗体源を使用して、異なる設定でのバイオフィルム形成または成熟中の新規抗真菌剤または抗体の効果を試験するために適用することができる。この手順を実演するのは、私の研究室で働いている博士課程の研究員であるパンカジ・チャンドリー氏です。まず、100マイクロリットルのカンジダトロピカリス培養物を96ウェルマイクロタイタープレートに追加します。

マルチチャンネルピペットを使用して、最後の2列に100マイクロリットルのRPMI 1640 MOPS培地のみを入れます。マイクロタイタープレートを蓋とアルミホイルで覆い、定常条件下で摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して培地を注意深く吸引します。

プレートを吸い取りシート上でそっと反転させ、軽くたたいて残留培地を取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、200マイクロリットルの1X PBSでプレートを洗浄します。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを注意深く吸引し、PBSで2回洗浄します。

余分なPBSを除去するには、生物学的安全キャビネット内でプレートを室温で30分間風乾します。熱不活化血清サンプルの段階希釈液を滅菌RPMI 1640 MOPS培地で調製します。選択した血清希釈液100マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。

列10に、真菌のみのポジティブコントロール用のRPMI 1640 MOPS培地のみを追加します。11列目のすべてのウェルに1〜50希釈の血清を追加して、真菌なしと血清陰性対照として機能します。プレートを蓋とアルミホイルで覆った後、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。

翌日、マルチチャンネルピペットを使用して血清を注意深く吸引した後、倒立プレートを軽くたたいて残留血清を取り除きます。PBS洗浄を3回繰り返し、生物学的安全キャビネット内でプレートを室温で30分間風乾して、余分なPBSを乾燥させます。次に、25ミリグラムのXTTを50ミリリットルのフィルター滅菌リンゲル乳酸塩に溶解します。

別々のチューブに10ミリリットルを分注します。アルミホイルで覆い、マイナス80°Cで保管してください。次に、8.6ミリグラムのメナジオンを5ミリリットルのアセトンに溶かします。

そして、50マイクロリットルを100本の別々のマイクロチューブに分配した後、アリコートを摂氏マイナス80度で保管します。10ミリリットルのXTTを取り、1マイクロリットルのメナジオンを加えて1マイクロモルの作業溶液を得る。96ウェルマイクロタイタープレートのウェルあたり100マイクロリットルのXTTメナジオン溶液を追加します。

次に、プレートを蓋とアルミホイルで覆った後、暗所で摂氏37度で2時間インキュベートします。最後に、各ウェルから80マイクロリットルの着色上清を新しい96ウェルプレートに移し、490ナノメートルでプレートを読み取ります。Sap2-パラプシロシス免疫マウスの血清は、Sap2-アルビカンス由来の血清の45%、およびSap2-トロピカリス免疫マウスの55%と比較して、事前に形成されたカンジダトロピカリスバイオフィルムの成熟を65%防止することができました。

一般に、Sap2免疫血清によるバイオフィルム阻害は、偽免疫血清によるバイオフィルム阻害よりも有意に高く、免疫前血清では16%および13%でした。バイオフィルム阻害は、PBSを使用し、血清コントロールを使用しない場合、無視できる程度でした。バイオフィルムの破壊を防ぐために、洗浄手順を実行する際には細心の注意を払う必要があります。

XTT溶液は使用直前に調製し、すぐにプレートに追加する必要があります。この手順に続いて、ユーザーは、さまざまな真菌株を使用したさまざまな研究環境で、カンジダバイオフィルムの形成および成熟中の新しい抗真菌剤、ワクチン候補、または抗体の効果を評価できます。