Name: 植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ、キュウリを用いたAirIDベースの近接標識法による植物タンパク質間相互作用の解析手法。ベクター構築からビオチン標識タンパク質の精製までを含む詳細なプロトコルで、遺伝学研究への応用可能性を示す。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(助成金番号32000197 to X.H.)、中国ポスドク科学基金会の特別財政助成金(助成金番号2019T120467 to X.H.)の支援を受けました。

1.植物材料の準備
<ol><li>Cucumis sativus (キュウリ)は実験分析に用いられます。種子を水に入れ、50°Cで20分間インキュベートした後、種子をペトリプレート上の濾紙に12〜16時間置きます。</li>
	<li>その後、種子を土壌の入った鉢(市販で購入)に移し、23°Cの温度、16時間の明期と8時間の暗期の気候室で成長させます。</li>
	<li>植物が3〜4週間、葉の段階に達するまで、植物を気候チャンバーに維持して、農業浸透を成功させます。</li>
</ol>2. AirID構築
<ol><li>APRR2を標的タンパク質とし、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(p35S:APRR2-AirID)でAPRR2-AirIDを構築します。これをGateway互換バイナリベクターpEarleyGate1006(カンザス州立大学のKathrin Schrick博士提供)に導入し、 補足ファイル1に示された配列に従ってPL酵素を直接合成します。</li>
</ol>3. コンピテントセルの調製
<ol><li>DH5αコンピテントセルの調製<ol><li>2 mL の LB (10 g/L のトリプトン、5 g/L の酵母抽出物、10 g/L の NaCl; pH = 7.0.) に大 腸菌 DH5α 細胞を (融解せずに凍結ストックから直接) 接種し、37 °C で一晩 (O/N) 増殖させます。</li>
		<li>O/N培養液から0.1%〜0.5%の接種物を100mLのLB培地に新たに接種し、OD600 が0.4〜0.6に達するまで細胞を増殖させ、4°Cで30分間培養液をインキュベートします。</li>
		<li>培養液を2本の50 mL遠心チューブに入れ、2500 x gで4°Cで5分間遠心します。</li>
		<li>上清を廃棄し、細胞を10 mLの0.1 M氷冷CaCl2に再懸濁し、氷上に15分間置いた。2500 x g のスピンで細胞を4°Cで5分間ペレット化します。</li>
		<li>細胞を氷冷した0.1 M CaCl2 + 20%グリセロール1 mLに再懸濁し、各1.5 mLチューブに100 μLを分注し、直ちに-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>GV3101コンピテントセルの調製<ol><li>2 mL の LB (50 μg/mL のゲンタマイシンと 25 μg/mL のリファンピシンを含む) を 1 つの GV3101 コロニーに接種します。培養物O/Nを28°Cでインキュベートし、250rpmで振とうします。</li>
		<li>200 mL の LB に 1 mL の飽和一晩培養液を接種します。培養液を250rpmで振とうし、OD600 が0.5になるまで28°Cでインキュベートします。</li>
		<li>培養液を4本の冷やした滅菌済み50 mL遠心チューブに移し、氷上に30分間置きます。</li>
		<li>細胞を2500 x gで4°Cで10分間ペレット化します。 上澄みを捨て、ペレットを氷の上に置きます。</li>
		<li>細胞を10 mLの0.1 M氷冷CaCl2 溶液に再懸濁します。細胞を1本の冷やした50 mLのOakridgeチューブにプールします。</li>
		<li>細胞を1,000 x g で4°Cで5分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞を氷冷CaCl2 溶液10 mLに再懸濁します。氷の上に30分間置きます。</li>
		<li>細胞を1,000 x gで4°Cで5分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞を 2 mL の 0.1 M 氷冷 CaCl2 溶液に再懸濁します。</li>
		<li>細胞を50 μLのアリコートに入れ、あらかじめ冷やした滅菌ポリプロピレンチューブに分注します。細胞は-80°Cで保存してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. Agroinfiltration(アグロインフィルトレーション)
<ol><li>まず、プラスミドをアグロバクテリウムに移します<ol><li>ステップ2.1で生成したプラスミド2.5 μLをagrobacterium tumefaciens GV3101株のコンピテントセルに移し、氷上で30分間インキュベートします。</li>
		<li>プラスミドとコンピテントセルが入ったチューブを液体窒素に3分間移します。</li>
		<li>インキュベーターで37°Cで5分間ヒートショックした後、チューブを氷上に2分間置きます。</li>
		<li>1,000 μLのLB培地(トリプトン10 g/L、酵母抽出物5 g/L、NaCl 10 g/L;pH = 7.0)をアグロバクテリウムに加え、30°C、118 rpmで1時間インキュベートします。</li>
		<li>3,000 x g で4°Cで2分間遠心分離します。</li>
		<li>溶液の上部800μLを廃棄し、残りの溶液を混合します。次に、LBに播種します(ステップ4.1.4で説明したように、プラスミドには寒天と50 μg/mLのカナマイシンを、GV3010コンピテントセルには50 μg/mLのゲンタマイシンと25 μg/mLのリファンピシンを加えました)。プレートを30°Cで48時間インキュベートします。 注:いくつかのコロニーを選び、PCRを実行して目的の遺伝子を確認することをお勧めします7。</li>
	</ol></li>
	<li>プレートからいくつかの細菌コロニーを拾い上げ、LB培地と適切な抗生物質に入れます(ステップ4.1.6を参照)。30°C、218rpmで36〜48時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を3,000 x gで2分間、4°Cで遠心分離します。 細胞をアグロインフィルトレーションバッファー(10 mM MgCl2、10 mM MES、pH = 5.6、250 μM アセトシリンゴン)にOD600 = 1.0で再懸濁します。</li>
	<li>1 mLのニードルレスシリンジを使用して、(軸軸)表皮の接種物(ステップ4.3から生成)を浸潤させます。. 注:葉全体に浸透し、複製することを選択することをお勧めします。4〜5個の植物の場合は、1つのコンストラクトを使用します。各葉に対して、1.5 mLの再懸濁アグロバクテリアで十分です。</li>
	<li>23°Cで16時間の光(約75μmol·m-2·s-1)と8時間の暗日長の気候チャンバーで植物を36時間維持します。</li>
	<li>構築物に36時間浸潤した後、1 mLの5 μMビオチン(10 mM MgCl2 溶液中)を、すでにろ過された構築物の葉に浸潤します。</li>
	<li>葉の組織を収穫する前に、処理された植物をさらに4〜12時間維持します。 注:以前の研究によると、標的タンパク質は36時間でピークに達するため、36 hpiビオチン浸潤4,6を選択します。ビオチンのインキュベーション期間はターゲット研究によって異なりますが、現在の実験によると、タンパク質の標識には8時間のインキュベーション期間が適しています。</li>
</ol>5. サンプルの採取
注:ケラチン汚染を避けるために、サンプル収集用のすべての材料は無菌である必要があり、すべてのプロトコルステップは汚染のない環境で実行する必要があります。
<ol><li>浸透した葉を切り取り、タンパク質の分解を避けるために液体窒素にすばやく移します。</li>
	<li>イムノブロット分析によるタンパク質の事前検出6;これは、共免疫沈降(Co-IP)の前に強くお勧めします。</li>
</ol>6. 葉からの総蛋白質の抽出
<ol><li>乳棒と乳鉢を使用して葉を挽き、2 mLの1x PBS-BSA PH 7.4をすばやく加え、ゆっくりと挽きます。</li>
	<li>15 mLのコニカルチューブを用意し、コニカルチューブの上に急速ろ過材料フィルターを置き、サンプルミックスを急速ろ過材料フィルターを通してチューブに移し、氷上に保管します。</li>
	<li>サンプルを 2 mL チューブに移し、1% プロテインインヒビターカクテルを加えます。</li>
	<li>内容物を上下に7〜8回回して混合し、1,000 x g で4°Cで2分間遠心分離します。</li>
	<li>サンプルの上部溶媒を新しい 2 mL チューブに移し、10% β-D-マルトシド(β-D.M)を加え、氷上に 5 分間置きます。20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。</li>
</ol>7. 脱塩カラムの平衡化
<ol><li>カラムを 1,000 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。 注:カラムの片側に印を付け、すべての遠心分離プロセス中に印を付けた面が外側を向いていることを確認してください。</li>
	<li>カラムの上部カバーと下部カバーを取り外し、1,000 x g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。</li>
	<li>カラムの回収チューブから液体溶液を廃棄し、洗浄用に 5 mL の 1x PBS バッファーを加えます。</li>
	<li>カラムを 1,000 x g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。</li>
	<li>手順 7.3 と 7.4 を少なくとも 5 回繰り返します。</li>
</ol>8.磁気ビーズの洗浄
<ol><li>1.5 mLのチューブを用意し、50 μLのストレプトアビジン-C1標識磁気ビーズを加えます。</li>
	<li>洗浄用に1x PBS-BSAを1 mL加え、十分に混合し、マグネットスタンドに3分間置きます。上澄みを捨てます。</li>
	<li>手順 8.2 を少なくとも 3 回繰り返します。</li>
	<li>洗浄のたびに、チューブを磁気ラックに置き、ビーズをチューブの片側に吸着させて洗浄バッファーを除去します。</li>
</ol>9. ビオチン化蛋白質の濃縮
<ol><li>2 mL のサンプルをカラムに加え、1,000 x g で 4 °C で 8 分間遠心分離します。</li>
	<li>脱塩したタンパク質抽出物1 mLを50 μLのストレプトアビジン-C1標識磁気ビーズに加え、平衡化します。</li>
	<li>チューブを回転器に通常速度で置き、溶液が完全に混合し、室温(RT)で30分間インキュベートします。</li>
	<li>ビーズを磁気ラックに室温で3分間、またはチューブの片側に集まるまで置き、上清を静かに除去します。</li>
	<li>1 mL の洗浄バッファー I(2% SDS 水溶液)を加え、ローテーター上で室温で 2 分間回転させ、ステップ 9.4 を繰り返します。</li>
	<li>1 mL の洗浄バッファー II(50 mM HEPES:pH = 7.5、500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% デオキシコール酸 [w/v]、1% Triton X-100)を添加した後、チューブを室温で 2 分間ローテーター上に置きます。手順9.4を繰り返します。</li>
	<li>洗浄バッファーIII(10 mM Tris-HCl:pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1%デオキシコール酸[w/v]、1%NP40 [v/v])1 mLを加え、室温で2分間シェーカーを使用して回転させます。次に、手順9.4を繰り返します。</li>
	<li>界面活性剤を除去するには、1.7 mL の 50 mM Tris-HCl(pH = 7.5)を加え、ステップ 9.4 を繰り返します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
	<li>室温でビーズを 50 mM 重炭酸アンモニウム緩衝液 1 mL でそれぞれ 2 分間 6 回洗浄し、ステップ 9.4 を繰り返します。</li>
	<li>50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、12%(w/v)スクロース(Suc)、2%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、1.5%(w/v)ジチオスレイトールを含むタンパク質抽出物50 μLをビーズに加え、インキュベーターで100°Cで5分間ヒートショックし、ステップ9.4に従います。上清を-80°Cで保存し、LC-MS/MS分析を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言した。

今回の実験では、Kidoらが大規模なゲノムデータセットと5つの従来のBirA酵素5を用いて祖先酵素を再構築するアルゴリズムによって開発した近接標識にAirIDを用いた。ランダム突然変異は、ランダム突然変異が動的な配列変化を生み出すことができないため、活性を高めるために従来の進化的タンパク質工学で使用されました9,10。他のPL酵素と比較して、AirIDにはいくつかの利点があります。以前は、このPL法は動物系にのみ適用可能でした。この研究では、植物のタンパク質間相互作用を調べるために使用されました。このプロトコルでは、葉サンプルの調製、遊離ビオチンの除去、抽出タンパク質の定量、ビオチン化タンパク質の濃縮など、植物にAirIDベースのPLを段階的にセットアップする方法を概説しています。
このアプローチは、キュウリにおける確立されたアグロバクテリウムを介した一過性発現を使用して、キュウリの標的タンパク質のPPIを見つけるため...

さまざまな細胞タンパク質が生物学的に制御されたシステムの下で機能し、タンパク質間相互作用(PPI)はこのシステムの一部であり、多くの細胞プロセスの基礎です。天然タンパク質の機能は、PPI以外にも、複合体の形成、ユビキチン化、リン酸化などの様々な修飾 によって 翻訳後促進されます。したがって、PPIの研究は、標的タンパク質の可能な機能を理解する上で重要です。PPIは、免疫沈降後の質量分析(IP-MS分析)1、酵母ツーハイブリッドシステム(Y2H)2、無細胞ベースアレイ3など、さまざまな技術を用いて実施されています。これらの手法は、研究分野におけるさまざまな重要な発見を探求しました。ただし、これらの方法にはいくつかの欠点があります。例えば、Y2Hは時間と費用のかかる戦略であり、対象種のY2Hライブラリを構築する必要があります。
さらに、Y2H技術では、高等真核細胞の細胞状態を正確に反映できない異種の単細胞真核生物である酵母を使用します。IP-MSは疎水性が高いタンパク質には適さず、弱いPPIの捕捉効率も低いことが示されています。ヌクレオチド結合ドメインやロイシンリッチリピート含有(NLR)タンパク質、受容体様キナーゼ(RLK)など、植物のさまざまな必須タンパク質は低レベルで発現し、ほとんどが他のタンパク質と一過性に相互作用します。したがって、これらの方法を用いるだけでは、これらのタンパク質の調節の根底にあるメカニズムを理解するには不十分である3。
近接ビオチン化(PB)と呼ばれる新しい技術は、研究者がPPIを特定するのに役立ちます。PBは、目的のタンパク質(POI)に結合するPL酵素に依存しており、パートナータンパク質がPOIに近づくと、PLはパートナータンパク質に化学ビオチンタグを付加します。さらに、タグ付きタンパク質を同定することができ、どのパートナータンパク質が標的タンパク質に結合するかを迅速に知ることができる5。これまでの研究で、BioIDとTurboIDは、特に植物におけるPPIのツールとして成功することが証明されていますが、一定の限界があります4。BioID では、パートナータンパク質の標識に高レベルのビオチンが必要であり、これには 16 時間以上かかります。BioID と比較して、TurboID は 10 分でタンパク質を標識し、室温(RT)でパートナータンパク質を標識できるため、より有益です。また、特定の条件下では細胞に毒性があり、目的のタンパク質との相互作用を示さないタンパク質にタグを付けます。
これらの問題を克服するために、Kidoらによって開発されたAirIDは、BioIDとAirID5の配列類似性は82%ですが、他の標識酵素よりも効率的です。AirIDの効率性を確認するために、既知のアソシエイトとのPOIを使用して実験を行いました。この実験により、AirIDが植物細胞内の関連タンパク質を間違いなく標識できることが確認されました。AirIDは、 in vitro および細胞内のPPIを分析するための貴重な酵素です。TurboIDよりも毒性が少なく、非パートナーにタグを付けるのに時間がかかるプロセスでエラーが少なく、細胞を殺すことができます。これは、AirIDが近接ビオチン化において他の標識酵素よりも競争力が高いことを示しています。それはより正確で、時間のかかるプロセスでより多くの可能性を秘めており、 in vitro および生細胞での毒性が低くなります。現在のプロトコルでは、AirIDをPL酵素として使用したAPRR2の相互作用タンパク質の同定が記述されています。さらに、この方法を他のタンパク質に適用して、植物種のPPIを調べることができます。

<table><tbody><tr><td>Acetosyringone</td><td>北京solaribo科学技術 Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>アクリル/BIS 30%溶液</td><td>Sangon Biotech(上海)Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>tsingke(上海)Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sangon Biotech(上海)Co.Ltd</td><td></td><td></td>G313BA0018</tr><tr><td>ビオチン</td><td>BBI ライフサイエンス</td><td>G908BA0012</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI ライフサイエンス</td><td>E209BA0008</td><td></td></tr><tr><td>コンピュテントセル GV3101</td><td>現行実験</td><td></td><td></td>で製造</tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>サーモサイエンティフィ</td><td>ック WC321753</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G818BA0029</tr><tr><td>DH5&alpha; コンピテントセル</td><td>現在の実験</td><td></td>で作られ<td>ました 大腸菌 DH5&alpha;</td></tr><tr><td>&beta;-D-maltoside</td><td>北京スコラリオ科学技術 Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>三公生物技術(上海) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>三公生物技術(上海) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>北京ソラリボ科学技術 Co.Ltd</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LiCl 三公生物技術(上海)Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>北京ソラリボ科学技術 Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp/MERCK kgAa ダルムシュタット、ゲルメネイ 3429963</td><td></td><td>クイックろ過材料フィルター</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Beijing ソラリボ科学技術 Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd H324BA0003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (上海) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質阻害剤カクテル</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr> 5820172 <tr><td>SDS</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads</td><td>Enriching Biotechnology</td><td>7E511E1</td><td>磁気ビーズ</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (上海) Co.Ltd</td><td>GB03BA007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (上海) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo scientific</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

植物におけるタンパク質間相互作用のためのairidベースの近接標識

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

哺乳類の細胞や植物では、修飾アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)または大 腸菌 ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)アプローチが、タンパク質間相互作用(PPI)の同定に成功していることが証明されています。APEX、BioID、およびBioIDの改訂版であるTurboIDには、貴重な技術であることに加えて、いくつかの制限があります。最近開発されたAirIDは、タンパク質間相互作用における近接同定のためのBioIDの新規バージョンであり、これらの制限を克服しました。これまでは動物モデルでAirIDが用いられていましたが、今回の研究では植物におけるAirIDの利用が実証され、標的タンパク質の近位にあるタンパク質標識において、BioIDやTurboIDなどの他のPL酵素と比較して、植物系においてAirIDが優れた性能を発揮することが確認されました。ここでは、AT4G18020(APRR2)タンパク質をモデルとしてタンパク質相互作用パートナーを同定するためのステップバイステップのプロトコルを示します。この方法では、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチンの形質転換、タンパク質の抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の濃縮について説明します。この結果は、AirIDが植物のPPIを分析するための新規かつ理想的な酵素であると結論付けています。この方法は、植物の他のタンパク質の研究に適用できます。

これまでの研究によると、キュウリの遺伝子 APRR2 は、白色の未熟な果実の色を制御する候補遺伝子である8。ここでは、キュウリ中の APRR2 の相互作用パートナータンパク質を見つけるための近接標識酵素としてAirIDを使用したプロトコルを開発しました。構築物をキュウリの葉に転写し、浸潤後36時間後にビオチンを転写した。48時間後、ウェスタンブロット分析のためにサンプルを採取し、形質転換が成功したことを確認しました。蛋白質はウェスタンブロットのためのプロトコルで前述のように得られた。 図1 の代表的なデータは、浸潤したキュウリの葉におけるタンパク質発現とビオチン化を示しており、これは新しく改変された技術に基づいて予想される所見でした。その結果、対照群と比較して、標識タンパク質の発現レベルが高く、余分なバンドが見られました。これにより、AirIDが目的遺伝子(GOI)の標的タンパク質のタグ付けに成功したことが確認されました。また、抗フラグ抗体と抗マウス抗体を用いても結果を確認したところ、標的バンド...

ここでは、AT4G18020(APRR2)-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリ(Cucumis sativus L.)の近接標識(PL)実験を行うためのステップバイステップのプロトコルを紹介します。この方法は、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチン浸潤、タンパク質抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の精製を記述します。

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirIDは、タンパク質間相互作用のための貴重な酵素であり、他の近接標識酵素よりも時間のかかるプロセスで毒性やエラーが少なくなります。APRR2-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリまたはCucumis sativusの近接標識実験を実施するためのステップバイステップAT4G18020プロトコルが提示されます。この手順を実演するのは、私の研究室のAhmad Zada氏、Imran Khan氏、Yuting Cheng氏、Min Zhang氏です。Cucumis sativusまたはキュウリの種子を水中に移し、摂氏50度で20分間インキュベートし、種子をペトリプレートの濾紙の上に12〜16時間置きます。その後、種子を土の入った鉢に移し、摂氏23度の気候室で、光16時間、暗光18時間の撮影期間で3〜4週間育てます。2.5マイクロリットルのプラスミドEarleyGate 100をアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株のコンピテントセルに移します。チューブを氷上で30分間インキュベートしてから、液体窒素に3分間移します。ヒートショックを与えるには、チューブを摂氏37度のインキュベーターに5分間移します。次に、チューブを氷上に2分間置きます。熱ショックを受けたアグロバクテリウム細胞に1, 000マイクロリットルのLuria BertaniまたはLB培地を加えます。細胞を摂氏30度、118RPMで1時間インキュベートした後、3000Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。次に、800マイクロリットルの上清を捨て、残りの溶液を混合します。カナマイシンとゲンタマイシンをそれぞれ50マイクログラム/ミリリットル、リファンピシン/ミリリットルあたり25マイクログラムを添加したLB培地にプレートします。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。プレートからいくつかの細菌コロニーを拾います。それらを適切な抗生物質を添加したLB液体培地に入れ、液体LBを摂氏30度、218RPMで36〜48時間インキュベートします。摂氏4度で3、000 Gで2分間遠心分離した後、ペレットを農業浸潤バッファーに再懸濁して、光学濃度を600ナノメートルの波長で1に調整します。1ミリリットルの針なし注射器を使用して、1.5ミリリットルの再懸濁したアグロバクテリア接種物をアキシャル表面の表皮全体に浸潤させます。植物を摂氏23度に保ち、毎秒75マイクロモル/メートル平方の光で16時間、暗い条件で8時間、36時間後、すでにろ過された葉に5マイクログラムのビオチン1ミリリットルを浸透させます。ビオチンが4〜12時間浸潤した後、葉を刈り取り、タンパク質の分解を避けるために液体窒素にすばやく移します。乳棒と乳鉢を使用して葉を挽き、pH 7.4のPBS BSAを2ミリリットルすばやく加え、続いてゆっくりと粉砕します。サンプルミックスを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、その上に置かれた急速ろ過材料フィルターに通し、チューブを氷上に保持します。サンプルを2ミリリットルのチューブに移します。1%プロテインインヒビターカクテルを加え、チューブを7〜8回上下させて内容物を混合してから遠心分離します。完了したら、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、10%β-D-マルトシドを加えます。チューブを氷上に 5 分間置いてから、摂氏 4 度で 20 、 000 G で 10 分間遠心分離します。脱塩カラムを平衡化するには、カラムの片側に印を付け、印を付けた面を外側に向けて遠心分離します。カラムの上部カバーと下部カバーを取り外し、摂氏 4 度で 1, 000 G で 2 分間遠心分離します。カラムの回収チューブから液体溶液を廃棄し、前に示したように遠心分離でチューブを 5 ミリリットルの PBS バッファーで少なくとも 5 回洗浄します。1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのPBS BSAと50マイクロリットルのストレプトアビジン-C1結合磁気ビーズを加え、完全に混合します。チューブをマグネットスタンドに3分間置き、ビーズをチューブの片側に向けて吸収します。反対側から上清を捨て、このPBS BSA洗浄を3回繰り返します。ビオチン化タンパク質を濃縮するには、2 ミリリットルのサンプルをカラムに添加します。カラムを 1000 G で摂氏 4 度で 8 分間遠心分離した後、1 ミリリットルの脱塩タンパク質抽出物を 50 マイクロリットルのストレプトアビジン-C1 標識磁気ビーズに加えます。磁気ビーズの入ったチューブを回転子の上に常速および室温で30分間置いて、溶液を完全に混合します。次に、ビーズを磁気ラックに室温で3分間、またはチューブの片側に集まるまで置きます。上澄み液を静かに取り除き、1ミリリットルの洗浄バッファー1を加えます。回転子の上でチューブを2分間回転させ、磁気ラックで行ったステップを繰り返して上清を除去します。同様に、前述したように、1ミリリットルの洗浄バッファー2および3で洗浄を行います。次に、1.7ミリリットルの50ミリモルトリス塩酸塩を添加し、磁気ラックで行ったステップを繰り返して、洗浄バッファー中の界面活性剤を除去します。1ミリリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム緩衝液を使用して、それぞれ2分間の洗浄を6回行います。完了したら、50ミリモルのトリス塩酸塩、12%スクロース、2%ラウリル硫酸リチウム、および1.5%ジチオスレイトールを含む50マイクロリットルのタンパク質抽出物をビーズに加え、チューブを摂氏100度のインキュベーターに5分間入れてヒートショックを与えます。磁気ラックでこのステップを繰り返した後、LCMS/MS分析のために上清をマイナス80°Cで保存します。抽出したタンパク質のウェスタンブロット解析では、浸潤したキュウリの葉でタンパク質の発現とビオチン化が成功していることが示されました。対照群と比較して、標識タンパク質の発現レベルが高く、バンド数が多いことから、AirIDによる目的遺伝子の標的タンパク質のタグ付けに成功したことが確認されました。結果は、すべての形質転換サンプルでAnti-Flag抗体を含む標的バンドを示すAnti-Flag抗体およびAnti-Mass抗体を使用して確認されました。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン-C1結合磁気ビーズで濃縮した後、サイズの異なる複数のタンパク質が観察されました。すべての結果から、AirIDは植物のタンパク質間相互作用を分析するための新しい理想的な酵素であると結論付けられました。近接標識実験では、5マイクロモルのビオチンとHR持続時間が理想的であることを覚えておくことが重要です。このプロトコルでは、葉のサンプルの調製、プレビオチンの除去、抽出タンパク質の定量化、ビオチン化タンパク質の濃縮など、植物におけるAirIDベースの近接ラベリングの段階的なセットアップの概要を説明しています。AirIDは、PPIに依存しないビオチン化精度を向上させることが期待されています。AirIDはプラントのPPI分析に理想的であると結論付けられました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。...

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

私たちは、真と偽のタンパク質 -...

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

このビデオでは、線虫細胞におけるin...

In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

分割-BioID、近接ラベリング手法 BioID を用いたタンパク質断片否定回路試金のステップ バイ ステップのプロトコルを提供します。与えられた 2 つのタンパク質の相互作用活性化、彼らのネイティブ...

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

この研究では、ビオチン補給や卵巣解剖から、質量分析のためのビオチン化ペプチドの導入遺伝子発現検証や濃縮までのステップをカバーする、 D. melanogaster 卵巣におけるTurboIDベースの近接標識(PL)の詳細なプロトコルを確立します。...

インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

学ぶ、キュウリを用いたAirIDベースの近接標識法による植物タンパク質間相互作用の解析手法。ベクター構築からビオチン標識タンパク質の精製までを含む詳細なプロトコルで、遺伝学研究への応用可能性を示す。

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

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