Name: トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶトマト種子の透明化プロトコル。次亜塩素酸ナトリウム処理と真空処理により、Solanum lycopersicumの胚発生段階を鮮明に観察できます。植物発生生物学研究に有用です。

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著者らは、微分干渉コントラスト顕微鏡法と従来の透明化法に関する有益な提案をしてくれたJie Le博士とXiufen Song博士に感謝しています。この研究は、中国国家自然科学財団(31870299)と中国科学院青年イノベーション振興協会から資金提供を受けました。図 2 は BioRender.com で作成されました。

1.溶液の調製
<ol><li>50 mLの遠沈管に2.5 mLの37%ホルムアルデヒド、2.5 mLの氷酢酸、および45 mLの70%エタノールを加えて、FAA固定液を調製します。ボルテックスし、4°Cで保存します。 使用直前にFAA固定液を新たに調製してください。 注意: 37%ホルムアルデヒドは腐食性であり、暴露または吸入すると発がん性がある可能性があります。固定剤は、適切な個人用保護具を着用しながら、ヒュームフード内で実行する必要があります。</li>
	<li>スズ箔で包んだ100 mLのガラス瓶に5 mLの100%グリセロール、40 gの抱水抱き水、および10 mLの蒸留水を加えて、透明溶液を調製します。マグネチックスターラーを用いて室温で一晩溶解する。調製した溶液は、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。 注意: 抱水クロラールは発がん性があり、刺激臭があります。ドラフトで実験を行い、適切な個人用保護具を着用してください。抱水クロラールは空気中で潮解しやすく、大量に保管しないでください。透明溶液は光にさらされると分解する可能性があるため、光から遠ざける必要があります。</li>
	<li>50 mLの遠沈管に10 mLの6%次亜塩素酸ナトリウム、40 mLの蒸留水、および50 μLのTween-20を加えて消毒液を調製します。渦巻き、室温で保管します。使用直前に消毒液を新たに調製してください。 注:長期間配置された次亜塩素酸ナトリウムの有効塩素含有量は減少し、実際の状況に応じて6%次亜塩素酸ナトリウムの含有量を増やすことができます。</li>
</ol>2.種子収集
<ol><li>トマトの種を蒔きます(S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom、 材料表を参照)花の栄養土壌と基質(v / v)の1:1の混合物で満たされた8 cm×8 cm×8 cmの正方形の盆地( 材料の表を参照)、24 ± 2 °C(日)および18 ± 2 °C(夜)で16/8時間の明暗期間の成長室で成長します。 60%〜70%の相対湿度、および4,000ルクスの光強度。 約6週間後、植物は開花期に入りました。</li>
	<li>独立した花の開花日を開花時にタグ付けし(花びらの開口角度は90°)、開花の翌日(DAF)を記録します。</li>
	<li>3〜23個のDAFトマト植物から果物を収穫し、すぐに氷の上に置きます。果物(種子または胚)を3〜23 DAFから初期(3〜10 DAF)、中期(11〜16 DAF)、および後期(17〜23 DAF)の果物(種子または胚)に分けます。 注意: 一度に多くの果物を集めすぎず、各果物の種子がさらなる処理のために1時間以内に剥がされることを確認してください。</li>
	<li>初期の果物の場合は、果物を割ってスライドに置き、実体顕微鏡( 材料の表を参照)の下で1倍から4倍の倍率で精密鉗子で新鮮な種子を注意深く収集します。中期および後期の果物の場合は、果物を壊し、精密鉗子を使用して新鮮な種子を直接収集します。</li>
</ol>3.抱水クロラールベースの種子の除去
注:この研究では、従来の35 プロトコルと最適化されたプロトコルを、種子の除去効率について比較しました。
<ol><li>従来のプロトコルを使用したクリアリング
	<ol><li>新鮮な種子(ステップ2.4で得られた)を1.5 mLのFAA固定液を含む2 mLの遠沈管に直ちに入れ、オービタルシェーカー(5 rpm、 材料表を参照)で室温で4時間インキュベートします。</li>
		<li>これらの種子を70%、95%、および100%エタノール(v / v)のエタノールシリーズで、オービタルシェーカー(5 rpm)でそれぞれ1時間脱水します。</li>
		<li>スライド上の3〜5滴の透明化溶液(~100 μL)にシードを置き、カバーガラスでサンプルをそっと覆います。スライドを、中期および後期の種子用の単一の凹型スライド( 材料表を参照)に置き換えます。</li>
		<li>これらのスライドまたは単一の凹型スライドを室温で30分間(3 DAF)、2時間(6 DAF)、1日(9 DAF)、3日(12 DAF)、または7日間(14〜22 DAF)シード材料の開発段階に応じて保管します(材料が若いほど、クリア速度が速くなります)。</li>
		<li>デジタルカメラを搭載した微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡( 材料表を参照)で、10倍、20倍、40倍の倍率でサンプルを観察します。透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整・最適化し、画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
	<li>最適化されたプロトコルを使用したクリア
	<ol><li>新鮮な種子(ステップ2.4で得られた)を、1.5 mLの消毒液を含む2 mLの遠沈管に直接入れます(ステップ1.3)。 注:2 mL遠心チューブに収集される種子の数は、種子の発育段階によって異なります。詳細を 表1に示します。</li>
		<li>サンプルをオービタルシェーカー(30 rpm)で室温で3〜50分間、最も内側の種皮の輪郭がはっきりと見えるまでインキュベートします。消毒液を廃棄します。 注:必要なインキュベーション時間は、種子の発育段階によって異なります(シードが遅いほど、インキュベーション時間は長くなります)。詳細を 表1に示します。</li>
		<li>中期および後期の種子の場合は、種子をスライドに移し、実体顕微鏡で1倍から4倍の倍率で鉗子と解剖針で種子粘液を取り除きます。鉗子を使用して種子を元の遠心チューブに戻します。 注:この手順は、初期のシードには必要ありません。</li>
		<li>種子を1.5 mLの脱イオン水で5回、毎回10秒洗浄します。脱イオン水を廃棄します。</li>
		<li>種子の体積の2×の透明化溶液を加え、続いて真空ポンプで0〜50分間真空処理します(表1)。間欠真空処理は、各真空処理を10分間隔で10分間隔で行う。</li>
		<li>種子の2×量の新鮮な透明化溶液と交換してください。種子を入れた2 mL遠沈管を室温に保ち、透明化を容易にするために30分から7日間光から保護します(表1)。孵卵中、後期胚の場合は、毎日透明化溶液を新鮮な溶液に交換し、種子を10分間真空処理します。</li>
		<li>クリアした種子をスライドまたは単一凹スライドに準備し、デジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡で10倍、20倍、40倍の倍率で観察します。透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整・最適化し、画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

機械的切片化と比較して、透明化技術は、植物組織または器官の完全性を保持するので、三次元イメージングにとってより有利である16。従来の清澄処理プロトコルは、化学溶液の浸透が容易であるため、小さなサンプルに限定されることがよくあります。トマト種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさで、透過性障壁が高いため、組織透明化に問題のあるサンプルです。シロイヌナズナの種皮は、外皮と内外皮24に由来する4〜5個の生細胞層で構成されています。しかし、シロイヌナズナと比較して、トマト種皮6には22〜27個の実質細胞層(球状胚の段階)があります。トマト種皮の最内層はスベリンで構成されており、半透層として知られており、水溶性化合物の移動に対する障壁であることが示されている38。さらに、多糖類に富む種子粘液は、高い粘度および著しく低い透過性を示し、それが透明化溶液の浸透を妨げた。トマトの色素が豊富な種皮も画質を低下...

トマト(S. lycopersicum L.)は、世界で最も重要な野菜作物の1つであり、2020年には510万ヘクタールから1億8,680万トンの肉質の果物が生産されています1。ナス、ピーマン、ジャガイモ、タバコなどの多くの商業的に重要な作物を含む、約2,716種2の大きなナス科に属しています。栽培トマトは二倍体種(2n = 2x = 24)で、ゲノムサイズは約900 Mb3です。長い間、野生のナス属から望ましい形質を選択することにより、トマトの家畜化と育種に多大な努力が払われてきました。トマト遺伝学リソースセンターには5,000を超えるトマトのアクセッションがリストされており、世界中で80,000を超えるトマトの生殖質が保管されています4。トマト植物は温室内で多年生であり、種子によって繁殖します。成熟したトマト種子は、完全に成長した胚、残留細胞型胚乳、および硬い種皮の3つの主要な区画で構成されています5,6(図1A)。二重受精後、細胞型胚乳の発生は接合子の発生に先行する。開花後~5~6日(DAF)に、胚乳が6〜8個の核7からなるときに2細胞前胚が最初に観察される。Solanum pimpinellifoliumでは、胚は20 DAF後に最終サイズに近づき、種子は32 DAF8の後に発芽するために生存可能です。胚が成長するにつれて、胚乳は徐々に吸収され、少量の胚乳だけが種子に残ります。残留胚乳は、幼根先端を囲む小毛洞胚乳と、種子の残りの部分の外側胚乳9,10からなる。外側の種皮は、外皮の肥厚して木化した外側表皮から発達し、外皮の残骸の死んだ層とともに、胚と胚乳を保護するために硬い殻を形成します5。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg"> 図1:ソラナム・リコペルシカムとシロイヌナズナの成熟種子の模式図。 (A)成熟トマト種子の縦断的解剖学的構造。(B)成熟したシロイヌナズナ種子の縦断的解剖学的構造。成熟したトマトの種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさです。スケールバー = (A) 400 μm、(B) 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
高品質のトマト種子の生産は、胚、胚乳、および母体の種子成分間の調整に依存します11。種子発生における重要な遺伝子とネットワークを解剖するには、変異種子の深くフルトラックの表現型記録が必要です。半薄切片やパラフィン切片などの従来の包埋切片技術は、胚の局所的で微細な構造を観察するためにトマト種子に広く適用されています12、13、14、15。ただし、薄い切片からシードの発達を分析することは通常面倒であり、z軸の空間分解能が不足しています。それに比べて、組織クリアリングは、発生する可能性が最も高い胚の欠陥の発生段階を特定するための迅速かつ効率的な方法です16。透明化方法は、1つ以上の生化学物質16で屈折率を均質化することによって内部組織の不透明さを低減する。全組織クリアリングは、その完全性を損なうことなく植物組織構造の観察を可能にし、クリアリング技術と3次元イメージングの組み合わせは、植物器官の形態および発生状態に関する情報を得るための理想的なソリューションとなっている17,18。長年にわたり、種子除去技術は、シロイヌナズナ、尋常性ホルデウム、および尋常性ベータ19,20,21,22,23を含む様々な植物種で使用されてきた。これらのうち、ホールマウント胚珠除去技術は、サイズが小さく、種皮細胞の4〜5層、および核型胚乳24,25のために、シロイヌナズナの種子発達を研究するための効率的なアプローチでした。Hoyerの溶液26の出現など、さまざまな透明混合物の継続的な更新により、大麦胚珠の内部構造は、その胚乳が種子の大部分を占めているにもかかわらず、高度な明瞭さで画像化されました。テンサイの胚形成は、減圧処理と塩酸19を組み合わせた透明化によって観察できます。それにもかかわらず、上記の種とは異なり、トマト種子のプロトコルをクリアすることによる発生学的観察は報告されていません。これにより、トマトの胚発生と種子発生の詳細な調査が妨げられます。
抱水クロラールは、浸漬された組織および細胞を異なる光学面上に表示させることを可能にし、細胞または組織成分を実質的に保存する透明化溶液として一般的に使用される27、28、29。抱水クロラールベースのクリアリングプロトコルは、シロイヌナズナの胚と胚乳を観察するための種子のホールマウントクリアリングに使用されています21,28。しかし、この清澄化液は、シロイヌナズナの種子よりも不浸透性であるトマトの種子の除去には効率的ではありません。物理的障壁には、(1)トマトの外皮は3〜15 DAF 30,31で約20の細胞層を有する、(2)トマトの胚乳は核型ではなく細胞型である32、(3)トマト種子のサイズは約70倍大きい33,34、(4)大量の種皮粘液を生成し、透明化試薬の浸透をブロックし、胚細胞の可視化に影響を与える。
そこで本報告では、トマト種子をさまざまな段階で全マウントで除去するための最適化された抱水クロラールベースの透明化方法を提示し、胚発生過程の深部イメージングを可能にします(図2)。

<table><tbody><tr><td>1,000 & マイクロ;Lピペット</td><td>GILSON</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro;Lピペットチップ</td><td>コーニング</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>2 ml遠心分離管</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>37%ホルムアルデヒド</td><td>DAMAO</td><td>685-2013</td><td></td></tr><tr><td>5,000 & マイクロ;Lピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3120000275</td><td></td></tr><tr><td>5,000 &micro;Lピペットチップ</td><td>バイオシャープ</td><td>BS-5000-TL</td><td></td></tr><tr><td>50ml遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>BOYUAN</td><td>678-2002</td><td></td></tr><tr><td>ボトルガラス</td><td>フィ</td><td>ッシャーFB800-100</td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物</td><td>メ</td><td>イヤーM13315-100G</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>ライカ</td><td>384200</td><td></td></tr><tr><td>DIC顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオ イメージャー A1</td><td>10x、20x、40x 倍率</td></tr><tr><td>消毒剤</td><td>QIKELONGAN</td><td>17-9185</td><td></td></tr><tr><td>解剖針</td><td>Bioroyee</td><td>17-9140</td><td></td></tr><tr><td>花 栄養土壌</td><td>FANGJIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>HAIOU</td><td>4-94</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>BOYUAN</td><td>676-2007</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Solarbio</td><td>G8190</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>IKA</td><td>RET basic</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tom</td><td>Tomato Genetics Resource Center</td><td>LA3911</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-206</td><td></td></tr><tr><td>播種基質</td><td>PINDSTRUP</td><td>LV713/018-LV252</td><td>スクリーニング:0-10 mm</td></tr><tr><td>シングルコンケーブスライド</td><td>HUABODEYI</td><td></td><td></td>HBDY1895</tr><tr><td>スライド</td><td>ライカ</td><td>3800381</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>S8 APO</td><td>1倍から4倍の倍率</td></tr><tr><td>錫箔</td><td>ZAOWUFANG</td><td>613</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>SHIDING</td><td>SHB-III</td><td></td></tr><tr><td>渦計</td><td>Silogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(solanum lycopersicum l.)

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

トマト(Solanum lycopersicum L.)は、世界中の主要な換金作物の1つです。トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。トマト種子内のより微細な胚構造の可視化は、種皮粘液、多細胞層外皮、および厚肉胚乳によって妨げられることが多く、これは面倒な埋め込み切片によって解決する必要があります。より簡単な代替案は、化学薬品を使用して種子をほぼ透明にする組織透明化技術を採用することです。従来のクリアリング手順では、より薄い種皮で小さな種子を深く洞察することができますが、トマトの種子のクリアは、特に発育後期段階では、技術的に引き続き困難です。
ここに提示されているのは、胚の形態がほぼ完了する開花後3日から23日までのトマト種子の発達を観察するための迅速で省力化のクリアリングプロトコルです。この方法は、 シロイヌナ ズナで広く用いられている抱水クロラール系清澄液に、ホルマリン-アセト-アルコール(FAA)固定の省略、種子の次亜塩素酸ナトリウム処理の添加、軟化した種皮粘液の除去、洗浄・減圧処理などの改良を加えたものです。この方法は、さまざまな発生段階でトマト種子を効率的に除去するために適用でき、良好な空間分解能で変異種子の発生過程を完全に監視するのに役立ちます。このクリアリングプロトコルは、ナス科の他の商業的に重要な種のディープイメージングにも適用できます。

シロイヌナズナのように従来の方法でトマトの種子を駆除すると、密な胚乳細胞が3DAFと6DAFで初期トマト胚の可視化を妨げました(図3A、B)。胚の総体積が増加するにつれて、球状胚は9DAFでほとんど区別できませんでした(図3C)。しかし、種子のサイズが大きくなり続けるにつれて、その透過性は減少し、12 DAFでぼやけた心臓胚が生じました(図3D)。13 DAF以降、種子粘液と種皮は徐々に密度が高くなり、透明化剤の浸透が妨げられました。14-19 DAF種子内の胚の輪郭は、処理時間を7日間に延長しても非常にぼやけていました(図3E-G)。22個のDAFシードでは、シードの内部構造は完全に見えませんでした(図3H)。
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トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。このプロトコルは、さまざまな発生段階でトマトの種子をきれいにして、より細かい胚構造を観察するのに役立ちます。

トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

この方法は、研究がトマト胚発生の異常な期間を迅速かつ楽に見つけるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、トマト胚の観察の基礎を提供する次亜塩素酸ナトリウムによるトマト種子の処理です。開花またはDAFの3〜23日後にSolanum lycopersicum果実の化学的調製および収穫から始めます。すぐに果物を氷の上に置き、開花後の日数に基づいて、それらを早い、中期、遅い果物に分けます。初期の果物を割ってスライドに置き、実体顕微鏡の1倍から4倍の倍率で精密鉗子で新鮮な種子を注意深く集めます。中期および後期の果物の場合は、果物を壊し、精密鉗子を使用して新鮮な種子を直接収集します。従来の方法では、採取したばかりの種子を直ちに1.5ミリリットルのFAA固定液を入れた2ミリリットルの遠沈管に移し、チューブをオービタルシェーカーに5rpmで室温で4時間置きます。次に、種子を70%95%および100%エタノールで、オービタルシェーカーで5rpmでそれぞれ1時間脱水します。完了したら、スライド上にある3〜5滴の透明溶液に種子を入れ、カバースリップでそっと覆います。中期および後期の種子には単一の凹型スライドを使用します。種子の発育段階に応じて、透明化のために室温でそれらをインキュベートします。インキュベーション後、微分干渉コントラスト、またはデジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡で10倍、20倍、40倍の倍率でサンプルを観察します。透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをサンプルごとにリアルタイムで調整および最適化し、画像をキャプチャします。壊れた果物から集めた新鮮な種子を、1.5ミリリットルの消毒液を入れた2ミリリットルの遠沈管に移します。サンプルをオービタルシェーカーで30rpmで室温で3〜50分間インキュベートします。最も内側の種皮の輪郭がはっきりと見えたら、消毒液を廃棄します。中期および後期の種子の場合は、種子をスライドに移します。鉗子と解剖針を使用して、実体顕微鏡の1倍から4倍の倍率で種子粘液を除去します。鉗子を使用して種子を元の遠心チューブに戻します。1.5ミリリットルの脱イオン水でそれぞれ10秒間5回洗浄し、脱イオン水を廃棄します。次に、2倍量の透明化溶液を種子に加えます。シード段階に応じて、0〜50分間の間欠的な真空処理を行い、各真空処理の後に10分間隔で10分間の真空処理を行います。真空処理後、透明化液を交換してください。種子の除去を容易にするために、室温で30分から7日間光から保護された遠沈管を置きます。後期胚の場合は、毎日溶液を新鮮な透明化溶液と交換し、続いて種子を10分間真空処理します。クリアしたシードをスライドまたは単一の凹面スライドに置きます。デジタルカメラを搭載したDIC顕微鏡を用いて、サンプルごとに透過光の明るさ、DICスライダー、コンデンサーの絞りをリアルタイムで調整・最適化し、画像を撮影します。従来のS.lycopersicum種子の除去方法では、高密度の胚乳細胞が3および6DAFで初期胚の可視化をブロックしました。種子成長中の透過性の低下は、9DAF後にぼやけた画像をもたらしました。種子粘液と種皮は徐々に密度が高くなり、13DAF以降は透明化剤の浸透が妨げられました。14〜19個のDAF種子内の胚の輪郭は、7日間の延長された処理時間にもかかわらず、非常にぼやけていました。22個のDAFシードの内部構造は完全に見えませんでした。種皮表皮細胞が産生する剥ぎ取られた種皮粘液は、13DAF以降に顕著であった。次亜塩素酸ナトリウム処理により,種子損傷なしに内種皮の明確な同定と付着性粘液のほとんどの剥離が可能となった。最適化された清算プロトコルでは、種子はテストされたすべての発達段階で満足のいく透明性を示しました。3DAFでは種皮の明瞭な細胞層、5DAFでは識別可能な胚乳細胞、7DAFでは棒状胚、9DAFでは球状、11DAFでは心臓期が観察された。最適化されたプロトコルでは、子葉とシュート頂端分裂組織のカールの程度は、胚発生のさまざまな段階で非常に簡単に捕捉されました。滅菌により、種子粘液と種皮色素が除去され、種子の浸透と視覚化が向上します。真空処理は、透明化溶液の浸透を加速することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.)

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