Name: マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学ぶマウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイド確立法。酵素処理と機械的分離で高純度上皮を分離し、エストラジオール応答性の遺伝子発現変化を測定できます。子宮内膜関連疾患の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ステファニー・パンガス博士とマーティン・M・マツク博士(M.M.M.)には、私たちの原稿を批判的に読み、編集していただき、ありがとうございます。研究は、 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.)、R01-HD032067 (M.M.M.)、R01-HD110038 (M.M.M.)、およびNCI-P30 Cancer Center Support Grant(NCI-CA125123)の支援を受けた。ダイアナ・モンシバイス博士は、バロウズウェルカム基金から次世代妊娠賞を受賞しています。

マウスの取り扱いと実験的研究は、ベイラー医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルと、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドによって確立されたガイドラインの下で実施されました。
1.酵素的および機械的方法を用いたマウスからの子宮上皮の単離
注:このセクションでは、ゲルマトリックススキャフォールドを使用してマウスから上皮子宮内膜オルガノイドを確立、継代、凍結、および解凍するために必要な手順について説明します。以前の研究では、マウス子宮内膜オルガノイドの最適な培養物が発情期4の間にマウスから確立されることが決定されており、これは膣スワブ15の細胞学的検査によって決定することができる。成体雌WTマウス(6〜8週齢、ハイブリッドC57BL/6Jおよび129S5/SvEvBrd)を全ての実験に使用した。マウスは、IACUC承認のガイドラインに従って、イソフルラン鎮静とそれに続く子宮頸部関節脱離を使用して人道的に安楽死させた。マウスを安楽死させたら、次の手順に従う必要があります。このプロトコルで使用される材料とソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
<ol><li>使用前に、ゲルマトリックスを氷上で約1〜2時間解凍します。</li>
	<li>マウスを解剖するには、ハサミを使用して腹部を中線切開し、皮膚をそっと剥がして下にある腹膜層を露出させます。鉗子を使用して腹膜層を支え、ハサミで横方向を切開して腹部の内容物を露出させます。<ol><li>腹部の脂肪パッドをそっと脇に動かして、子宮角を見つけます。最初に頸部接合部でそれらを保持し、ハサミを使用して腸間膜脂肪に沿って切断することによってそれらを解剖します。マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。 注:使用前にすべての手術器具を滅菌することにより、細胞分離中の無菌性を維持し、マウスの腹部に70%エタノールをスプレーし、滅菌組織培養フードの下で解剖後のすべての手順を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>各子宮角をそれぞれ約4〜5 mmの小さな断片に切ります。</li>
	<li>1つの子宮からのすべての子宮断片を、0.5 mLの1%トリプシンを含む24ウェルプレートの1ウェルに入れます。酵素溶液が子宮内腔に入るのを許し、子宮内膜上皮を下にある間質から酵素的に分離させる。</li>
	<li>24ウェルプレートを37°Cの加湿組織培養インキュベーター内で約1時間インキュベートします。</li>
	<li>1時間のインキュベーション後、子宮の断片を、1 mLのダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS)を含む35 mm組織培養プレートに移します。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、細かい鉗子と1 mLピペットを使用して、子宮上皮を子宮管から機械的に分離します。子宮片片の一端を鉗子で押さえながら、ピペットチップを断片を縦方向にゆっくりと動かし、子宮管のもう一方の端から上皮を絞り出します。子宮断片から分離した上皮シートを解剖顕微鏡で観察する。</li>
	<li>1 mLピペットを使用して上皮シートを回収し、1.5 mLチューブに穏やかに移します。</li>
	<li>残りの子宮片についてもこのプロセスを繰り返し、すべての上皮シートを同じ収集チューブに移します。</li>
	<li>解離した上皮シートを375 × gで5分間遠心分離することによりペレット化する。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>細胞ペレットを0.5 mLの2.5 mg/mLコラゲナーゼ+ 2 mg/mLのDNase溶液に再懸濁します。ピペットで上下に約10倍、またはシングルセル懸濁液が得られるまで。</li>
	<li>0.5 mLのDMEM/F12 + 10%ウシ胎児血清(FBS)+抗生物質を加え、細胞を375 × gで5分間遠心分離します。 注:細胞培養に使用される広域抗生物質の詳細については、 材料表を参照してください。</li>
	<li>上清を注意深く除去し、1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に細胞を再懸濁します。細胞を375 × gで5分間遠心分離します。</li>
</ol>2.間質コンパートメントの処理
注:このセクションでは、マウス子宮内膜の間質コンパートメントを分離するために必要なプロトコルの概要を説明します。上皮/間質共培養実験への関心が高まっていることを考えると、オルガノイドを生成する上皮細胞に加えて、間質細胞集団を処理できることが重要です。
<ol><li>すべての上皮が子宮片から酵素的および機械的に分離されると、残りの管状構造は「間質/子宮筋層」コンパートメントです。この組織をHBSS溶液中の2.5 mg / mLコラゲナーゼ+ 2 mg / mLDNaseに集めます。</li>
	<li>間質/子宮筋層サンプルを37°Cのシェーカーで15分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、マウスあたり500 μLのDMEM/F12 + 10%FBS + 抗生物質を加え、解離していないフラグメントを40 μmのセルフィルターでろ過します。</li>
	<li>375 × gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。</li>
	<li>上清を注意深く除去し、細胞ペレットを1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に再懸濁します。混合物を10 cm細胞培養プレート内のDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質10 mLに滴下します。プレートを加湿した細胞培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>マウス子宮内膜上皮細胞および間質細胞の共培養を生成するには、スキャフォールドフリーまたはコラーゲンマトリックス系を使用するヒト子宮内膜オルガノイドについて記載された方法に従う6、8。 注:これらの技術はまだマウスに対して公開されていませんが、ヒト子宮内膜で公開されているプロトコルに基づいて適応させることができます。</li>
</ol>3. 子宮上皮をゲルマトリックスに封入し、オルガノイドを樹立
注意: 使用する準備ができるまで、ゲルマトリックスを氷の上に置いておきます。
<ol><li>上清を除去し、細胞ペレットの20倍の量のゲルマトリックスに細胞ペレットを再懸濁します(すなわち、細胞ペレットが20 μLの場合は、400 μLのゲルマトリックスで細胞を再懸濁します)。気泡が発生しないように、ペレットを注意深く再懸濁します。</li>
	<li>ゲルマトリックス/細胞懸濁液を室温で~10分間沈降させます。</li>
	<li>ゲルマトリックス/細胞懸濁液が半固体ゲルになったら、200 μLのワイドボアチップを備えたP200マイクロピペットを使用して、25 μLのゲルマトリックス/細胞懸濁液を穏やかに吸引します。12ウェルプレートのウェルごとに3つの別々の25 μLドームを分注し、37°Cの加湿組織培養インキュベーターでゲルマトリックスを15分間硬化させます。</li>
	<li>ゲルマトリックスが硬化したら、ゲルマトリックスドームを含む各ウェルに750 μLのオルガノイド培地を追加します。加湿した組織培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。 注:オルガノイド培地の処方は、 材料の表に記載されています。オルガノイドは通常、最初の培養から4日以内に形成されます。</li>
</ol>4. エストラジオール投与後の子宮内膜オルガノイドの遺伝子発現解析
注:このセクションでは、エストラジオールによる処理後のリアルタイムqPCRを使用して子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現をプロファイリングするために使用される方法について説明します(E2;表1を参照)。子宮内膜は卵巣ホルモンE2の周期的な制御下にあるため、E2に対するオルガノイドの反応性をテストすることは、生理学的機能の重要な尺度です。高品質のRNAを取得し、子宮内膜上皮オルガノイドからqPCRおよび/またはRNAシーケンシングを使用して遺伝子発現をプロファイリングするのに十分なmRNAを生成しました。このセクションでは、オルガノイドを収集し、遺伝子発現のダウンストリーム解析のためにそれらを処理する方法について説明します。選択された処理培地は、培養子宮内膜細胞を処理するために使用されるものを反映しています。しかしながら、この治療培地は、ホルモン8、16、17によるヒト子宮内膜3D培養物の治療のために行われるように、それに応じて最適化され得ることに留意すべきである。
<ol><li>上記のように子宮内膜オルガノイドを培養する。</li>
	<li>オルガノイド培地を取り出し、播種の4日後に750 μLの飢餓培地と交換します。一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌朝、飢餓培地を取り除きます。ビヒクルまたは10 nM E2を含む750 μLの治療培地を追加します。48時間インキュベートします。</li>
	<li>キットメーカーのプロトコルに従ってRNA単離を進めてください。</li>
</ol>5. 子宮内膜オルガノイドの組織学的解析
注:子宮内膜オルガノイドの形態学的特徴を画像化することは、成長因子、遺伝子操作、または低分子阻害剤の細胞効果を評価するために重要です。このセクションでは、組織学的染色と抗体免疫蛍光染色を使用して子宮内膜上皮オルガノイドを固定、処理、および画像化するために使用される技術について説明します。
<ol><li>1 mLの4%パラホルムアルデヒドを1x PBSで含む1.5 mLの微量遠心チューブを準備します。それらを氷の上に置きます。</li>
	<li>オルガノイドを含む12ウェルプレートのウェルから培地を吸引する。</li>
	<li>チップをカットした1 mLピペットチップを使用して、500 μLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに移し、ゲルマトリックスドームをプレートの底から静かに取り外します。</li>
	<li>ゲルマトリックスドーム全体をピペットチップに静かに吸引し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>オルガノイドを4°Cのローテーターに一晩置き、固定します。</li>
	<li>翌朝、チューブを600 × g で5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。4%パラホルムアルデヒド溶液をピペットで静かに取り除き、廃棄します。オルガノイドを70%エタノールで2回洗浄します。</li>
	<li>最後の洗浄後、50〜100μLを除くすべてのエタノールをチューブから取り除きます。チューブを脇に置きます。</li>
	<li>試料処理ゲルのチューブを水浴に入れ、電子レンジで~30秒間マイクロ波でゲルを溶かします。ゲルの粘稠度を監視して、検体処理ゲルが沸騰しないようにします。 注:試料処理ゲルが溶けても熱く沸騰しなかったら、オルガノイドをカプセル化するために迅速に作業します。</li>
	<li>金型の表面全体を覆うのに十分な試料処理ゲル(約250μL)を移します。</li>
	<li>検体処理ゲルがまだ溶融している間に、オルガノイドを含む50 μLの70%エタノール溶液を素早く移します。オルガノイドが沈んでいるか、金型の底部に押し込まれていることを確認します。</li>
	<li>組織学型を氷の入ったバケツの上に置き、標本処理ゲルを冷まして固化させます。</li>
	<li>検体処理ゲルが完全に乾いたら、オルガノイドが配置されている平面を追跡しながら、標本処理ゲルの正方形を標本バッグに慎重に移します。</li>
	<li>バッグを組織学カセットに入れ、組織のホルマリン固定およびパラフィン包埋に使用される標準的な方法を用いて処理する18。</li>
	<li>パラフィンに固定および包埋した後、ミクロトーム19を用いて5μm切片に切片化する。以下に概説するように、標準的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色または免疫染色手順を進めてください。</li>
</ol>6. ヘマトキシリン&エオジン染色
<ol><li>次のように切片を脱パラフィンする:キシレン、2 x 10分;100%エタノール、2 x 3分;80%エタノール、3分;60%エタノール、3分;dH 2 O,2x 3 分;ヘマトキシリンで1分;水道水(3 x 5秒);エオシンで1分。</li>
	<li>次のように切片を脱水する:60%エタノール、3分;80%エタノール、3分;95%エタノール、3分;100%エタノール、2 x 3分;キシレン、2 x 15分</li>
	<li>封入剤を使用してマウントします。</li>
</ol>7. 免疫蛍光染色
<ol><li>手順6.1の説明に従ってセクションをパラフィン除去します。</li>
	<li>抗原賦活化の実行<ol><li>スライドをマイクロ波対応容器の抗原賦活化溶液に浸します。</li>
		<li>溶液が沸騰しないように5分間隔を使用して、強火で20分間電子レンジで加熱します。</li>
	</ol></li>
	<li>20分間の抗原賦活化ステップが完了したら、抗原賦活化バッファーに浸したまま、スライドを氷上で40分間冷却します。</li>
	<li>スライドを1x TBSTで3分間洗浄します</li>
	<li>TBST中の3%BSA中で室温で1時間インキュベートすることにより、スライドをブロックします。</li>
	<li>一次抗体インキュベーション<ol><li>抗体をTBSTの3%BSAで希釈します(Abに応じて1:50-1:1,000)。</li>
		<li>加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>TBSTで3 x 5分洗ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>二次抗体インキュベーション<ol><li>抗体を3%BSA(TBST)(1:250)または5%正常ロバ血清で希釈します。</li>
		<li>抗体は蛍光色素に結合しているため、暗所で室温(RT)で1時間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>核染色<ol><li>4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をTBSTで1:1,000に希釈します。</li>
		<li>RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>TBSTで2 x 5分洗ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>マウンティング<ol><li>1滴の封入剤を使用してカバーガラスを取り付けます。</li>
		<li>翌日、マニキュアを使用してカバーガラスを密封します。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

ここでは、マウス子宮内膜から子宮内膜上皮オルガノイドを生成する方法と、それらのダウンストリーム分析に日常的に使用されているプロトコルについて説明します。子宮内膜オルガノイドは、子宮内膜症、子宮内膜がん、着床不全などの子宮内膜関連疾患を制御するメカニズムを研究するための強力なツールです。2017年に発表された画期的な研究では、マウスおよびヒト上皮由来の子宮内膜オルガノイドの長期および再生可能な培養物を培養する条件が報告されています4,5。オルガノイドは他の系における生物学的経路の研究に広く使用されてきたが、in vitroでの子宮内膜組織の研究は、培養中の非形質転換初代上皮を研究するための適切なモデルがないために制限されてきた26。ヒトおよびマウスの子宮内膜由来の子宮内膜オルガノイドは、腸、腎臓、肺などの他の臓器組織からのオルガノイドを培養するために通常使用される条件を使用し、それらをゲルマトリックス4で構成さ...

子宮内膜 - 子宮腔の内層粘膜組織 - は、女性のリプロダクティブヘルスに重要な役割を果たすユニークで非常に動的な組織です。生殖寿命の間、子宮内膜は卵巣ホルモン - エストロゲンとプロゲステロンの協調作用によって調整されて、増殖、分化、および分解の数百サイクルを経験する可能性を秘めています。遺伝子操作マウスの研究により、ホルモンに対する子宮内膜の反応と、胚着床、間質細胞の脱落膜化、妊娠の制御を支える基本的な生物学的メカニズムが明らかになりました1。しかし、in vitro研究は、従来の2D細胞培養で形質転換されていない初代マウス子宮内膜組織を維持することが困難であるため、制限されていました2,3。3D臓器系(オルガノイド)としての子宮内膜組織の培養における最近の進歩は、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する生物学的経路を研究する新しい機会を提供します。マウスおよびヒトの子宮内膜オルガノイドシステムは、さまざまなマトリックスに封入された純粋な子宮内膜上皮から開発されており4,5、ヒト子宮内膜は足場のない上皮/間質共培養6,7として、最近ではコラーゲンカプセル化された上皮/間質集合体として培養されています8。.上皮オルガノイド培養の成長と再生の可能性は、オルガノイドの成長と再生を最大化するように経験的に決定された成長因子と低分子阻害剤の定義されたカクテルによってサポートされています4、5、9。さらに、子宮内膜オルガノイドを凍結および解凍する能力により、将来の研究のためにマウスおよびヒト由来の子宮内膜オルガノイドの長期的なバンクが可能になります。
遺伝子操作マウスは、妊娠初期と脱落膜化を制御する複雑なシグナル伝達経路を明らかにし、妊娠喪失、子宮内膜がん、子宮内膜症のモデルとして使用されています。これらの遺伝学的研究は、女性の生殖組織で特異的に活性なcreリコンビナーゼを使用して、loxP隣接対立遺伝子(「floxed」)の細胞特異的欠失によって大部分達成されました。これらのマウスモデルには、広く使用されているプロゲステロン受容体-cre10(子宮内膜上皮組織および間質組織で強力なリコンビナーゼ活性を有する)、成体マウスにおいて子宮内膜上皮組換えを誘導するラクトフェリンi-cre11、またはミュラー管由来組織において上皮特異的欠失を引き起こすWnt7a-creが含まれる12。.遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜組織を3Dオルガノイドとして培養することは、子宮内膜生物学を調査し、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する成長因子とシグナル伝達経路の同定を容易にする絶好の機会を提供しました13,14。マウス子宮内膜組織の単離および培養のための方法は文献に記載されており、その後の子宮内膜上皮オルガノイドの培養のための子宮上皮の単離のための様々な酵素戦略の使用を報告している4。以前の文献は子宮内膜上皮オルガノイド培養プロトコル4,5,6の重要なフレームワークを提供しますが、この論文はこれらのオルガノイドを生成、維持、処理、および分析するための明確で包括的な方法を提供します。これらの技術の標準化は、女性の生殖生物学の分野における進歩を加速させるために重要です。ここでは、ゲルマトリックス足場での子宮内膜オルガノイドのその後の培養のためのマウス子宮内膜上皮組織の酵素的および機械的精製のための詳細な方法論を報告します。また、ゲルマトリックス封入マウス子宮内膜上皮オルガノイドの下流組織学的および分子学的解析の方法論についても説明します。

<table><tbody><tr><td>オルガノイド培地 製剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>ウシ膵臓からのトリプシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade;サプリメント(50X)、ビタミンAを差し引いた</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Σ</td><td>Aldrich N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 阻害剤, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr> 組<tr><td>換えヒト HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R&D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>その他の消耗品および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のmLデオキシリボヌクレアーゼI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>14170112 1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;ポリスチレンマイクロプレート(24ウェル)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;ポリスチレンマイクロプレート(12ウェル)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, 40 & micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>ダイレクトゾールRNA MiniPrep (50 &micro;g)</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 16% 水溶液ソリューション、EMグレード</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Eprediaカセット1スロットティッシュカセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>エプレディアステンレス鋼埋め込みベースモールドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ(100%)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia ナイロン生検バッグ</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Specimen Processing Gel</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (黄色がかった) 溶液 プレミアム</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS バッファー、20X、pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X)、pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>クエン酸&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI溶液(1 mg / mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr>希釈<tr><td>VECTASHIELD退色防止マウンティング媒体</td><td>ベクターラボ</td><td>H-1000-10クリア</td><td></td></tr><tr><td>ネイルポリッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1849418</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーScientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR マイクロ カバー グラス</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 抗体 (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>トロマ-I&nbsp;</td><td>1:50希釈</td></tr><tr><td>ビメンチン アントボディ</td><td>細胞シグナル</td><td>5741S</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>Donkey 抗ラット IgG (H+L) 高交差吸着 二次抗体 抗体、Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 希釈</td></tr><tr><td>Donkey、抗ラビン IgG (H+L) 高交差吸着 二次抗体 抗体、Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:250 希釈</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 ステレオ顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 デジタルカメラ付き倒立ルーチン顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>ラクトフェリン (LTF)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン (PGR)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス子宮からの3d子宮内膜オルガノイドの確立

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

子宮内膜組織は子宮の内腔を裏打ちし、エストロゲンとプロゲステロンの周期的な制御下にあります。これは、管腔および腺上皮、間質コンパートメント、血管網、および複雑な免疫細胞集団で構成される組織です。マウスモデルは子宮内膜を研究するための強力なツールであり、着床、胎盤形成、および癌を制御する重要なメカニズムを明らかにしています。3D子宮内膜オルガノイド培養の最近の開発は、子宮内膜生物学の根底にあるシグナル伝達経路を解剖するための最先端のモデルを提示します。遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜オルガノイドを確立し、それらのトランスクリプトームを解析し、単一細胞分解能でそれらの形態を視覚化することは、子宮内膜疾患の研究にとって重要なツールです。本論文では、マウスの子宮内膜上皮の3D培養を樹立する方法を概説し、遺伝子発現を定量化し、オルガノイドの組織像を解析する技術について説明します。目標は、子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現と形態学的特徴を確立、培養、および研究するために使用できるリソースを提供することです。

マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像 添付のプロトコルに記載されているように、WTマウス子宮内膜上皮からオルガノイドを樹立しました(図 1の図を参照)。マウス子宮内膜上皮の酵素的解離に続いて、上皮シートを子宮間質細胞から機械的に分離し、さらにコラゲナーゼで解離して単一細胞懸濁液を生成した。この上皮細胞と間質細胞分離の方法を正しく実行すれば、反対の細胞タイプの10%〜15%以下の汚染を持つサンプルが得られるはずです( 図2の免疫蛍光画像を参照)。次に、上皮細胞ペレットをゲルマトリックスに再懸濁し、室温でゲル化させ、組織培養プレート上の25 μLドームに播種しました。ゲルマトリックスドームが固化した後、それらをオルガノイド培地で覆い、成長させた。通常、図3に示すように、子宮内膜上皮細胞が 3〜4日以内にオルガノイドに集合することが観察されました。オルガノイドは培養中に維持され、培地の交換は3日ごとに発生し、継代は5〜7日ご...

このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

このプロトコルは、子宮内膜オルガノイドの培養のためにマウスの子宮から高純度の子宮上皮を分離するための段階的な方法論を示すため、重要です。この方法は、酵素的および機械的解離を効率的に利用して子宮上皮を単離する。これらの技術は、単離された上皮に由来する子宮内膜上皮オルガノイドを確立、治療、および分析するために合理化されました。使用前にゲルマトリックスを氷上で約1〜2時間解凍することから始めます。次に、ハサミを使用して腹部を正中線切開し、皮膚をそっと剥がして下にある腹膜層を露出させることにより、安楽死させたマウスを解剖します。腹部脂肪パッドをそっと脇に動かして子宮角を見つけ、子宮頸管接合部で子宮角を保持してから、腸間膜脂肪に沿って切断します。マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。完了したら、各子宮角をそれぞれ約4〜5ミリメートルの小さな断片に切ります。1つの子宮からのすべての子宮片を、0.5ミリリットルの1%トリプシンを含む24ウェルプレートの1ウェルに入れる。次に、24ウェルプレートを摂氏37度の加湿組織培養インキュベーターで約1時間インキュベートし、下にある間質から子宮内膜上皮を酵素的に分離します。インキュベーション後、子宮の破片を1ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝溶液またはDPBSを含む35ミリメートルの組織培養プレートに移します。次に、子宮片片の一端を鉗子で保持し、ピペットチップを断片を縦方向に静かに走らせ、子宮管のもう一方の端から上皮を絞り出すことにより、解剖顕微鏡下で子宮上皮を子宮管から分離します。次に、子宮片から分離した上皮シートを解剖顕微鏡で観察します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、すべての上皮シートを同じ1.5ミリリットルのチューブに静かに移します。解離した上皮シートを375 x gで5分間遠心分離することによりペレット化した。細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去し、細胞ペレットを0.5ミリリットル/ミリリットルのコラゲナーゼと1ミリリットルあたり2ミリリットルのDNA溶液に再懸濁します。ピペットで上下に約10回、または単一細胞懸濁液が得られるまで行います。次に、0.5ミリリットルのDMEM F / 12と10%ウシ胎児血清またはFBSと抗生物質を加え、細胞を375 x gで5分間遠心分離します。上清を除去し、1ミリリットルのDMEM/F12と10%FBSと抗生物質で細胞を再懸濁し、細胞を遠心分離します。準備ができるまでゲルマトリックスを氷の上に置きます。次に、遠心分離機細胞から上清を取り除き、気泡を導入せずにゲルマトリックスの20倍の体積を用いて細胞ペレットを再懸濁した。ゲルマトリックス細胞懸濁液を室温で約10分間沈降させます。ゲルマトリックス細胞懸濁液が半固体ゲルになったら、先端が200マイクロリットルのワイドボアを有するP200マイクロピペットを使用し、25マイクロリットルのゲルマトリックス細胞懸濁液を穏やかに吸引します。12ウェルプレートのウェルあたり3つの別々の25マイクロリットルのドームを分注し、ゲルマトリックスを15分間硬化させ、摂氏37度の加湿組織培養インキュベーターで硬化させます。ゲルマトリックスが硬化した後、ゲルマトリックスドームを含む各ウェルに750マイクロリットルのオルガノイド培地を加え、加湿組織培養インキュベーター内で摂氏37度でインキュベーターします。マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像は、上皮細胞と間質細胞分離により、反対の細胞型の汚染が10%〜15%以下のサンプルが得られることを示しました。子宮内膜上皮細胞は、3〜4日以内にオルガノイドに組み立てられました。切片化したホルマリン固定パラフィン包埋子宮内膜オルガノイドをヘマトキシリン染色とエオジン染色で可視化し、オルガノイドの内腔である上皮と中空中心の単層を表示しました。蛍光顕微鏡イメージングは、オルガノイド中のすべての細胞がサイトケラチン8陽性であり、DAPIを含むことを示し、子宮内膜オルガノイドの固定、埋め込み、および処理が抗体ベースの免疫染色に適合することを示しています。リアルタイム定量PCRは、10ナノモルのエストラジオールによる刺激が上皮オルガノイドにおけるリポカリン2、ラクトフェリン、およびプロゲステロン受容体の発現を増加させることを示し、子宮内膜上皮オルガノイドを使用してエストラジオールに応答する遺伝子発現変化を測定することに成功したことを示しています。機械的解離ステップ中に子宮内膜上皮の明確な分離が得られるようにすることが重要です。子宮管から出てくる上皮を観察できるはずです。他の方法には、ゲルマトリックスへの封入による上皮オルガノイドの樹立が含まれる。必要に応じて、間質コンパートメントをさらに消化して、3D上皮間質共培養を作成することができます。この方法は、子宮内膜の再生を制御するシグナルに関する質問に答えるのに役立ちます。子宮内膜症、妊娠喪失、癌などの女性の病気の治療に役立つ可能性があります.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

腸間膜動脈カスケードに子宮組織の自動移植によるマウスおよびラットにおける子宮内膜症の外科的誘導の説明。...

子宮組織の自動移植による外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデル

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。...

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

子宮内膜症の多くのげっ歯類モデルは、技術的な複雑さ、再現性、および/または免疫不全動物または特別なレポーターマウスの必要性によって制限されています。我々は、独立して検証可能な客観的なスコアリングシステムを有し、卵巣切り出しまたは生存手術の要件を持たない任意の実験マウスを使用して、病変誘導の簡略化されたシステムを提示する。...

自然サイクリングマウスを用いた子宮内膜症のシンジニアスマウスモデル

この研究では、臨床的に重要な子宮内膜症のサブタイプである子宮内膜腫をシミュレートするために特別に設計された新しいマウスモデルを紹介します。C57BL/6Jマウスを用いることで、子宮内膜腫関連不妊症の病態生理学的メカニズムを解明し、現在の生殖医療の知見ギャップを埋める精緻なツールを提供することを目指します。...

子宮内膜腫に関連する不妊症を研究するための実験的モデルマウスの確立

ここでは、ラット子宮内膜上皮幹細胞(reESC)を単離して培養し、ラット子宮内膜オルガノイドを作製するプロトコールを紹介します。この方法は、子宮内膜疾患の in vitro...

ラット子宮内膜上皮幹細胞からのラット子宮オルガノイドの作製と特性評価

この記事では、95%エタノールをマウスの子宮に1〜3分以内に注入することにより、死亡率が非常に低く、子宮内癒着が最小限に抑えられた、信頼性と再現性のある薄い子宮内膜を作製するための詳細なプロトコルについて説明します。...

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo...

高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

硝子体内注射、眼の疾患のためのまたは局所治療の直接的な応用として、視覚科学の研究に広く使用されている技術です。このビデオでは、ガラスピペットで1ミリリットル注射器を使用して硝子体内注射のためのプロトコルを示した。大量出血し、レンズの損傷を避けることについての有用なヒントが与えられている。...

眼疾患モデルを確立するための硝子体内注射

この記事では野生のげっ歯類の皮膚および肺組織からの初代線維芽細胞培養物の分離および保守のためのプロトコルについて説明します。...

げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立

学ぶマウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイド確立法。酵素処理と機械的分離で高純度上皮を分離し、エストラジオール応答性の遺伝子発現変化を測定できます。子宮内膜関連疾患の研究に応用可能です。

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

さらに動画を探す