Name: 刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー構築法。SKOV3細胞の脂質滴動態を24時間観察し、細胞代謝研究に応用可能です。

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ビンガムトン大学の2019年学部シニアデザインチーム(Suk Chul Yuon、Ian Foxton、Louis Mazza、James Walsh)に、顕微鏡エンクロージャーボックスの設計、製造、テストを行ったことに感謝します。有益な議論をしてくれたビンガムトン大学のスコット・ハンコック、オルガ・ペトロワ、ファビオラ・モレノ・オリバスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の支援を受けて、受賞番号R15GM140444で行われました。

1.顕微鏡環境エンクロージャを構築する
注:この大型顕微鏡環境エンクロージャは、顕微鏡本体の温度とイメージング環境を37°Cで安定させるために使用されます(図1A)。
<ol><li>SRS顕微鏡フレームの足の位置と電動ステージの位置を、光学テーブルのマーカーペンでマークします。顕微鏡のガルバノスキャナーの前に2つのアイリスダイアフラムを取り付け、ポンプとストークスのレーザービームがアイリスダイアフラムの中心を通過するように調整します。</li>
	<li>顕微鏡フレームとステージを光学テーブルから取り外します。</li>
	<li>シリコーンゴムシート(サイズ:31 x 29インチ、厚さ:1/8インチ)を光学テーブルに置きます(図1B)。</li>
	<li>ナイフを使用してマークに沿ってシリコーンゴムを切断し、小さなゴム片を取り除き、正方形のMICAセラミックシート(サイズ:6 x 6インチ、厚さ:1/4インチ)を同じ場所に配置します。 注:MICAセラミックは機械加工が容易な材料です15。アルミニウムと同じくらい硬いですが、優れた断熱材です。MICAセラミックシートを使用して、金属顕微鏡フレームとステージからステンレス鋼の光学テーブルへの熱伝達を停止しました。フレームとステージの脚を取り付けるために1 / 4-20ネジを使用できるように、MICAシートにいくつかの貫通穴を開ける必要があります。</li>
	<li>顕微鏡フレームとステージを光学テーブルに戻し、マーカーラインに沿って脚をMICAセラミックシートに慎重に合わせます。1 / 4-20ネジを使用して、フレームとステージをテーブルに取り付けます。</li>
	<li>SRS 光路を再調整します。ミラー1とミラー2のミラーマウントを調整して、レーザービームが2つの事前に取り付けられたアイリスダイアフラムの中央を通過するようにします(図2)。 注:現在の生細胞イメージング作業に使用されているラボ製のSRS顕微鏡の技術的な詳細は、前述の16に記載されています。ポンプとストークスビームのパルス幅は、ガラスロッド分散で~3-4psです。システムは、ScanImage17 ソフトウェアを使用して制御されます。</li>
	<li>この断熱基礎の上に、5枚の大きなポリカーボネートシート(サイズ:31 x 29 x 28インチ、厚さ:0.25インチ)を使用して、顕微鏡フレーム全体を覆うように環境エンクロージャを組み立てます。 注意: エンクロージャボックスのサイズは、顕微鏡フレームとステージの寸法に基づいて決定されます。顕微鏡エンクロージャボックスのフロントパネルは、フレキシブルチャンバーを設置し、細胞培養皿をロードするために一時的に取り外す必要があります。<ol><li>エンクロージャーを組み立てるには、ポリカーボネートシートの両端にねじ穴を開ける、穴あけ、タッピングなどの簡単な機械加工作業を実行します。エンクロージャーの右側と左側のシートに直径2.6インチの2つの大きな穴を開けて、それぞれ入口チューブと出口チューブに合います。背面シートに直径5 mmの小さな穴を開けて、レーザービームがエンクロージャーに入るようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>アルミホイルテープを使用してボックスの端とインターフェースをシールします。</li>
	<li>フレキシブルダクトホースをエンクロージャボックスの入口ポートと出口ポートに接続して、ヒーターモジュールによってポンプで送られて制御される温風の流れを循環させます。ヒーターモジュールの熱センサーを、細胞を培養して画像化するフレキシブルチャンバーに配置します。目標温度を37°Cに設定します。 注意: ディフューザーを使用して、環境エンクロージャ内の気流分布をより均一にすることができます。</li>
</ol>2.フレキシブルチャンバーを組み立てます
<ol><li>3本の止めネジを使用して、機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片1(材質:アルミニウム6061)を対物レンズのノーズピースに取り付けます(図2)。</li>
	<li>機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片2を、4本の1 / 4-20ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます(図2)。 注:サンプルホルダーは、50 mmのカバーガラス底細胞培養皿を保持するように変更する必要があります。1-7 / 8インチのホールソーを使用して、サンプルホルダーの中央に貫通穴を開けます。50mmのホールソーを使用して穴をぐるぐりし、貫通穴の深さを~1mmに保ちます。</li>
	<li>アルミニウム片2を備えたサンプルホルダーを電動ステージに取り付け、ネジを使用して取り付けます。</li>
	<li>天然ゴムフィルムスリーブ(厚さ:0.01インチ、シアノアクリレート接着剤で接着)を2つの機械加工されたアルミニウム片の間に置き、両端に輪ゴムを使用して取り付けます。</li>
	<li>適切なチューブとコネクタを使用して、圧縮されたCO2シリンダーをガスミキサーモジュールに接続します。CO2入力圧力を20〜25psiに設定します。内蔵のCO 2センサーとコントローラーを使用して、エアミキサーモジュールが5%のCO2を調整して気流に混合できるようにします。インライン フィルタを使用して、エアフローをクリーンアップします。</li>
	<li>適切なチューブとコネクタを使用して、混合空気(5%CO2を含む)をホットプレートに置かれた滅菌済みウォーターボトルに導き、加湿された空気をフレキシブルチャンバーに導きます。ホットプレートを37°Cに設定します。 温水で気流を泡立てて、気流の湿度を上げます。</li>
</ol>3. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の準備
<ol><li>ノーズピース、水浸対物レンズ、サンプルホルダーなど、フレキシブルチャンバーのすべての部分を70%エタノールで拭きます。</li>
	<li>エンクロージャー内に20〜30分間配置したUVランプを使用して、エンクロージャシステム全体を除染します。 注意: 安全のため、UV消毒プロセス中は実験室にとどまらないでください。</li>
	<li>SKOV3細胞を50mmガラス底シャーレに入れて、通常のインキュベーター内で通常の生理条件下で12時間培養します。 注:SKOV3細胞培養18 は、標準のバイオセーフティキャビネットで開始します。</li>
	<li>ネジを外して、機械加工されたアルミニウム片2をサンプルホルダーから外します。 注:これは、細胞培養皿をロードするために柔軟なチャンバーを開く方法です。</li>
	<li>細胞培養皿をロードします。細胞培養皿を置く前に、コンデンサーの上部に浸漬油を追加することを忘れないでください。皿のカバーを取り外し、クランプを使用して皿を固定します。 注意: 汚染を避けるために、すべての操作は手袋で実行する必要があります。</li>
	<li>対物レンズを細胞培養培地に下げて、粗い焦点を合わせます。アルミニウム片2を下げてフレキシブルチャンバーを囲み、ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます。 注意: 2 mmのシリコーンゴムクッションパッドがアルミニウム片2の底に取り付けられ、隙間をしっかりと密閉します。</li>
	<li>通常の細胞培養用に5%CO2および19%O2の空気供給を200cc/minのエアフローレートで設定します。 注意: より低い空気流量を使用できます。それは、フレキシブルチャンバーがどれだけうまく密閉されているかによって異なります。</li>
</ol>4. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の実施
<ol><li>レーザー波長を805 nmに調整して、CH2化学結合の振動に起因する2854 cm-1ラマンシフトをターゲットにします。低レーザー出力を使用して、細胞への光損傷を減らします。このプロトコルに従うには、ポンプレーザーの平均出力~15 mWとストークスレーザーの~7.5 mW(1,045 nmに固定)を使用して、長期の生細胞イメージングを行います。 注意: レーザー出力が高いほど、SRSイメージング品質が向上します。ただし、レーザー出力が高すぎると、生細胞に光損傷が誘発されます。画質とフォトダメージの間にはトレードオフがあります。</li>
	<li>対物レンズを調整して焦点を合わせ、ソフトウェアのメインコントロールパネルにあるFOCUSボタンを使用して、細胞の良好なSRSイメージングを実現します。高速フォーカスを実行するには、CONFIGURATIONパネルでピクセル数を512ピクセル×512ピクセルに設定し、ピクセル滞留時間を4.8μsに設定します。</li>
	<li>ロックイン・アンプの入力範囲(通常5mV)を最大信号電圧の2倍に設定します。ローパスフィルタをピクセル滞留時間(4.8μs)と同じに設定します。 注意: ラボで構築されたSRSシステムが異なれば、使用するデータ取得設定も異なる場合があります。</li>
	<li>良好なピント合わせを実現した後、175μm2の視野に対して2,048×2,048ピクセルの画像解像度に設定して、高品質の画像を取得します。メインコントロールパネルのSAVE機能を確認し、チャンネルパネルのSRSチャンネルを確認します。 メインコントロールチャンネルで2つのフレーム間の間隔時間を180秒(3分)に設定します。取得番号を480に設定して、24時間以上のタイムラプスイメージングを行います。 注:実験の目的に基づいて、より低い画像解像度を使用できます。</li>
	<li>メインコントロールパネルのLOOP機能を使用して自動画像取得を開始します。 注意: イメージングの最初の1時間に温度の不安定性による焦点ドリフトがあるかどうかを確認してください。最初の1時間のイメージングは安定していない可能性があります。タイムラプスイメージングセッション中は、2〜3時間ごとにフォーカスを確認してください。</li>
	<li>収集した画像をImageJ19で処理します。LDの定量化には、(i)LD /細胞体面積比、および(ii)総LDの平均SRS強度の2つの方法を使用します。 SRS画像の非細胞ピクセルを2,854 cm-1で閾値化およびゼロにすることにより、細胞本体面積を測定します。SRS画像の非LDピクセルをしきい値化およびゼロにして、LD面積と強度を測定します。 注:SRS画像処理の詳細については、以前に報告されています16。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

タイムラプス生細胞SRS顕微鏡は、ラベルフリーの方法で分子追跡を行うための代替イメージング技術です。蛍光標識と比較して、SRSイメージングは光退色がなく、分子の長期モニタリングが可能です。しかしながら、今日まで、正立SRS顕微鏡上の生細胞イメージングシステムは市販されていない。本研究では、安定した断熱顕微鏡エンクロージャボックスと柔軟な内部ソフトチャンバーを備えたライブセルイメージングシステムを開発し、透過SRSタイムラプスイメージングを可能にしました。このセットアップでは、大型のエンクロージャボックスが37°Cで温度安定性を維持し、内部のソフトチャンバーが加湿空気を供給して最適な細胞培養環境を確立します。この研究で実証された柔軟なオープンチャンバーは、生細胞の長期SRSイメージングのためのシンプルなワークフローを可能にします。ガラス底皿に播種された細胞は、まず通常のインキュベーターで調製および培養してから、イメージングのために柔軟なステージ上のチャンバーに移すことができます。生細胞SRSイメージングを実行するための代替ソリューションは、マイクロ流体およびフローサイトメトリープラットフォームを含むクローズドフローセルを使用することである...

光学顕微鏡は、サンプルの微細構造を観察するために使用されます。光学イメージングは、他の技術よりも迅速で、侵襲性が低く、破壊的ではありません1。光学顕微鏡による生細胞イメージングは、培養生細胞の動態を長期間にわたって捉えるために開発されています2。異なるタイプの光学コントラストは、生物学的サンプルに関する異なる情報を提供します。例えば、光学位相顕微鏡は、試料3全体の屈折率の微妙な違いを示す。蛍光顕微鏡は、特定の生体分子や細胞小器官の画像化に広く使用されています。しかしながら、蛍光の広帯域励起スペクトルおよび発光スペクトルは、通常、多色イメージングが行われるときにスペクトルオーバーラップをもたらす4。蛍光分子は光に敏感であり、長期間の定期的な光曝露後に漂白することができます。さらに、蛍光標識は、細胞5における分子の生体分布を変化させ得る。SRS顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です6。SRSのコントラストは、特定の化学結合の振動遷移に依存しています。化学結合の振動周波数は狭いスペクトル帯域幅を示すことが多く、同じサンプル内の複数のラマンバンドを画像化することが可能になります7。SRS顕微鏡は、生細胞イメージングのためのユニークなツールであり、ラベルフリーの方法で複数の化学的コントラストを提供します8。
染色されていない細胞のSRSイメージングは多くの研究に使用されていますが、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。その理由の1つは、市販のオープンチャンバーは厚さ9,10,11,12が大きいため、SRSイメージングに直接使用できないことです。ガラス蓋付きのこれらのチャンバーは、主に、後方検出スキームを備えた単一の高NA対物レンズを使用した明視野または蛍光イメージング用に設計されています。ただし、SRSイメージングでは、高NA対物レンズと高NAコンデンサーの両方を使用した透過検出が好まれるため、対物レンズとコンデンサーの間に非常に短いギャップ(通常は数ミリメートル)しか残されません。この問題を克服するために、我々は、正立顕微鏡フレームを使用して生細胞のタイムラプスSRSイメージングを可能にするために、柔らかい材料を使用して柔軟なチャンバーを設計しました。この設計では、水浸対物レンズはソフトチャンバーに封入されており、焦点合わせとイメージングの目的で3次元で自由に移動できます。
ほとんどの哺乳類細胞を培養するのに最適な温度は37°Cですが、室温は常にこれより10°C低くなっています。37°Cより高いまたは低い温度は、細胞増殖速度に劇的な影響を及ぼします13。そのため、生細胞イメージングシステムにおいては細胞培養環境の温度制御が求められている。温度の不安定性は、長期イメージング中に焦点ぼけの問題につながることが知られています14。37°Cの安定した環境を実現するため、顕微鏡下の断熱層を含む顕微鏡フレーム全体を覆う大型の筐体チャンバーを構築しました(図1)。大きな温度制御チャンバー内では、小さな柔軟なチャンバーは、5%CO2を補充した調整された空気の流れを介して生理学的湿度とpHを正確に維持するのに役立ちます(図2)。チャンバーの温度と湿度を測定し、ダブルチャンバー設計が長期の定期的なSRSイメージング下での細胞増殖に最適な細胞培養条件を提供することを確認しました(図3)。次に、SKOV3がん細胞のタイムラプスイメージングと脂肪滴(LD)の追跡へのシステムの応用を実証しました(図4、図5、および図6)。

<table><tbody><tr><td>A lab-built SRS microscope</td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>HF2LI 50 MHz ロックインアンプ</td><td>Zurich Instruments</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>Iris diaphragm</td><td>Thorlabs</td><td>Inc SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>キネマティックミラーマウント</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡フレーム</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>電動顕微鏡ステージ</td><td>Prior Scientific</td><td>Z-Deck</td><td></td></tr><tr><td>油浸コンデンサー (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>水浸対物レンズ (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon Inc</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡筐体用材料および部品 (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアサームヒーターモジュール</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)</td><td>エアサーム・SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>エアサーム・ヒーター・コントローラー、CO<サブ>2</サブ>・湿度モニター</td><td>ワールド・プレシジョンズ(WPI)</td><td>エアサーム-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>エア/CO<サブ>2</サブ>ミキサーモジュール</td><td>ワールド・プレシジョンズ(WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルダクトホース(2-1 / 2 '' ID、2-3 / 4 '' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>56675K71</td><td></td></tr>高温<tr><td>ガラスマイカセラミック、機械加工が簡単(6 '' x 6 ''、1/4 ''厚さ)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートシート(厚さ0.25 '')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴムシート(36インチ×36インチ、厚さ1/8インチ)</td><td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルチャンバー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td>ホットプレートの材料と部品</tr> <tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>高純度インラインフィルター、1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>ホールソー(切断直径1-7 / 8インチ)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>穴鋸(切断直径50 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr>高温<tr><td>シリコーンゴムチューブ、ソフト、内径2 mm、外径5 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr>インライン<tr><td>フィルター(1/4 NPT、40ミクロン)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>多目的6061アルミニウム丸管(1/8 ''壁厚、4 '' OD)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>多目的 6061 アルミニウム丸管 (3/4 '' 壁の厚さ、3-3/4 '' OD)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>多目的 6061 アルミニウム棒 (12 インチ x 12 インチ、厚さ 1/4 )</td> <td>McMaster-Carr</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>多目的 6061 アルミニウム棒 (8 インチ x 8 インチ、厚さ 3/8 )')</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズノーズピース(シングル)</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>サンプルホルダー(変更)</td><td>Prior Scientific</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>超薄型天然ゴムフィルム(厚さ0.01'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr>真空<tr><td>シール可能なガラス瓶</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td>imagej.net</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>SRS イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>Materials for live-cell imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底部滅菌培養皿 (Dia.x H,50 x 7 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 細胞培養培地</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor 蛍光色素 DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>ミリポアSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>SKOV3細胞株</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です。SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的用途で実証されています。しかし、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。SRS顕微鏡では、高解像度のイメージングを実現するために、高開口数(NA)水浸対物レンズと高NA油浸コンデンサーを使用することがよくあります。この場合、対物レンズとコンデンサーの間のギャップはわずか数ミリメートルです。したがって、ほとんどの市販のステージトップ環境チャンバーは、剛性のあるガラスカバーで厚さが大きいため、SRSイメージングには使用できません。この論文では、正立顕微鏡フレーム上で送信されたSRS信号検出を備えたタイムラプスライブセルイメージングに使用できる柔軟なチャンバーの設計と製造について説明します。チャンバーの柔軟性は、柔らかい素材(薄い天然ゴムフィルム)を使用することで実現されます。新しいエンクロージャとチャンバーの設計は、既存のSRSイメージングセットアップに簡単に追加できます。試験と予備的な結果は、フレキシブルチャンバーシステムにより、生細胞の安定した長期タイムラプスSRSイメージングを可能にし、将来のさまざまなバイオイメージングアプリケーションに使用できることを示しています。

タイムラプスSRSイメージング用のフレキシブルチャンバーシステムを作製して組み立て(図1 、 図2)、システムの性能を評価しました。顕微鏡環境エンクロージャ内の温度は1時間以内に予想される37°Cに達し、室温に大きな影響を与えませんでした(図3A)。フレキシブルチャンバー内の温度は1.5時間で37°Cに達し、少なくとも24時間37°Cで安定に維持されました(図3B)。フレキシブルチャンバー内の相対湿度は、1時間で85%に達し、その後少なくとも24時間維持される可能性があります(図3C)。測定された温度と湿度のデータは、このシステムが長期的な細胞増殖に最適な環境を提供できることを裏付けています。
SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的研究に適用されている<sup...

我々は、送信シグナル検出を備えた直立刺激ラマン散乱顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングのためのステージトップの柔軟な環境チャンバーについて報告する。脂肪滴は、オレイン酸で処理したSKOV3細胞で最大24時間、3分の時間間隔で画像化されました。

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

柔軟な環境チャンバー技術により、手術中の顕微鏡フレーム上で送信信号を検出するSRSイメージングとしてタイムラプスが可能です。SRS顕微鏡は、高開口数対物レンズとハイエンドコンデンサーを使用し、従来のチャンバーでは収まらない数ミリメートルのギャップしか残しませんでした。柔軟なチャンバーはこの問題を解決します。SRS顕微鏡を使用する研究者は、この技術を簡単に採用できます。フレキシブルチャンバーは、解剖顕微鏡や滅菌顕微鏡に使用して、標本を最適な生理学的条件下で維持することもできます。まず、SRS顕微鏡フレームの足の位置と電動ステージの位置を、光学テーブルのマーカーペンでマークします。光学テーブルから顕微鏡フレームとステージを取り外した後、シリコーンゴムシートをテーブルに置きます。ナイフを使用してマークに沿ってシリコーンゴムを切ります。小さなゴム片を取り除き、正方形の雲母セラミックシートを同じ場所に置きます。次に、顕微鏡フレームとステージを光学テーブルに戻し、マーカーラインに沿ってマイカセラミックシートに足を慎重に合わせます。SRS光路を再調整した後、5枚の大きなポリカーボネートシートを使用して、断熱基礎の上に環境エンクロージャを組み立てて顕微鏡フレーム全体をカバーします。アルミホイルテープを使用してボックスの端とインターフェースをシールします。フレキシブルダクトホースをエンクロージャボックスの入口ポートと出口ポートに接続して、ヒーターモジュールによってポンプで送られて制御される循環式の暖かい空気の流れを可能にします。3本の止めネジを使用して、機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片1を対物レンズのノーズピースに取り付けます。次に、機械加工された中空円筒状のアルミニウム片2を4本のネジを使用してサンプルホルダーに取り付ける。アルミニウム片2のサンプルホルダーを電動ステージに取り付け、ネジを使用して取り付けます。天然ゴムフィルムスリーブを2つの機械加工されたアルミニウム片の間に置き、両端に輪ゴムを使用して取り付けます。適切なチューブとコネクタを使用して、圧縮されたCO2ボンベをガスミキサーモジュールに接続します。CO2入力圧力を20〜25psiに設定します。内蔵のCO2センサーとコントローラーを使用して、エアミキサーモジュールが5%のCO2を調整して気流に混合できることを確認します。インライン フィルタを使用して、エアフローをクリーンアップします。適切なチューブとコネクタを使用して、混合空気をホットプレートに置かれた滅菌済みのウォーターボトルに導き、加湿された空気をフレキシブルチャンバーに導きます。ホットプレートを摂氏37度に設定します。温水で気流を泡立てて、気流の湿度を上げます。ネジを外して、機械のアルミニウム片2をサンプルホルダーから外します。ノーズピース、サンプルホルダー、水浸対物レンズなど、フレキシブルチャンバーのすべての部分を70%エタノールで拭きます。エンクロージャー内に20〜30分間置いたUVランプを使用して、エンクロージャシステム全体を除染します。次に、細胞培養皿をロードします。皿のカバーを取り外し、クランプを使用して固定します。対物レンズを細胞培養培地に下げて、粗い焦点を合わせます。アルミニウム片2を下げてフレキシブルチャンバーを囲み、ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます。次に、センサーを挿入します。通常の細胞培養では、5%CO2と19%O2の空気供給量を、空気流量を毎分200立方センチメートル、温度を摂氏37度に設定します。レーザー波長を805ナノメートルに調整して、CH 2化学結合の振動に起因する2, 854センチメートルの逆ラマンシフトをターゲットにします。低レーザー出力を使用して、細胞への写真の損傷を減らします。ソフトウェアのメインコントロールパネルにあるフォーカスボタンを使用して、細胞の良好なSRSイメージングを実現するために、対物レンズを調整して焦点を合わせます。高速フォーカスを実行するには、構成パネルでピクセル数を 512 x 512 ピクセル、ピクセル滞留時間を 4.8 マイクロ秒に設定します。良好なピント合わせを実現した後、高品質の画像を取得するために、175マイクロメートルの正方形の視野に対して、イメージング解像度を2048 x 2048ピクセルに設定します。メインコントロールパネルの保存機能を確認し、チャンネルパネルのSRSチャンネルを確認してください。メインコントロールチャンネルで2つのフレーム間の間隔時間を180秒に設定します。取得番号を480に設定して、24時間以上のタイムラプスイメージングを行います。メインコントロールパネルのループ機能を使用して自動画像取得を開始します。タイムラプスSRSイメージングのためのフレキシブルチャンバーシステムの性能を評価した。顕微鏡環境エンクロージャ内の温度は予想摂氏37度に達し、室温に大きな影響を与えませんでした。フレキシブルチャンバー内の温度は1.5時間で摂氏37度に達し、少なくとも24時間安定に維持されました。フレキシブルチャンバー内の相対湿度は1時間で85%に達し、少なくとも24時間維持することができました。生きたSKOV3細胞のタイムラプスSRSイメージングは、3分間の時間分解能で細胞内脂肪滴の迅速かつ活発な動きを示しました。24時間のイメージングセッションの終わりまでに、細胞はまだ正常な形態と密度を示し、細胞が健康であることを示しています。次に、オレイン酸で処理したSKOV3細胞を画像化し、脂肪滴の蓄積を10時間にわたって追跡した。脂肪滴量を、脂肪滴の細胞体面積比および総SRS強度に対する脂肪滴を用いて定量した。結果は、脂肪滴の量が10時間にわたって増加し続けたことを示しています。脂肪滴の同時前方SRSイメージングと、蛍光色素DND-189で標識されたリソソームの後方2光子蛍光イメージングも実証されました。脂肪滴およびリソソームの非常に低い程度の共局在が観察された。このプロトコルを試みるときは、焦点ドリフトが生細胞イメージングの一般的な問題であることに注意してください。約2時間のタイムラプスイメージング後に再フォーカスが必要になる場合があります。タイムラプスSRSイメージングは、その開発後、生細胞中のラベルフリー分子またはラマンテキストで標識された分子を追跡するためのさまざまな研究に使用されてきました。

a-flexible-chamber-for-time-lapse-live-cell-imaging-with-stimulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp.

誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

出典:エスピノーザ、R.、他.組織診断のためのマウス脳のリアルタイム2色刺激ラマン散乱イメージング. J. Vis. Exp.

マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

この記事は、全反射蛍光照明(TIRF-SIM)で動作する構造化照明顕微鏡の組み立てと操作のための詳細なガイドを提供します。これにより、複数の色の光学超解像でダイナミックな生物学的プロセスをイメージングすることができます。...

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

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回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。...

刺激されたラマン散乱に基づく非線形顕微鏡の実施

刺激されたラマン散乱(SRS)顕微鏡検査は、特定の化学部分の選択的でラベルフリーなイメージングを可能にし、生体内の脂質分子を画像化するために効果的に採用されています。ここでは、SRS顕微鏡の原理を簡単に紹介し、...

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

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刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。...

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

この論文では、同じ顕微鏡プラットフォームに統合された誘導ラマン散乱(SRS)とコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)の解像度、感度、イメージングコントラストを直接比較します。結果は、CARSの空間分解能が優れており、SRSはコントラストとスペクトル分解能が優れており、どちらの方法も感度が類似していることを示しています。...

化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較

我々は、広帯域刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡で化学画像を取得するためのプロトコルを提示する。差動マルチチャンネルロックイン検出で動作するSRS顕微鏡に基づいて、このプロトコルは、サンプル調製、SRS装置の調整、および化学的に不均一なサンプルの異なる成分を解きほぐすためのケモメトリックスを記述しています。...

広帯域刺激ラマン散乱顕微鏡に基づく多重化学イメージング

学ぶ刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー構築法。SKOV3細胞の脂質滴動態を24時間観察し、細胞代謝研究に応用可能です。

刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー

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