Name: 圧力過負荷誘発心肥大をモデル化するためのOリング大動脈バンディングと従来の横大動脈狭窄の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶOリング大動脈バンディング法によるマウス圧力過負荷誘発心肥大モデルの作成。固定径ゴムリングを用いることで、従来法より再現性の高い実験結果が得られ、心血管研究の標準化に貢献します。

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この作業は、ドイツ連邦共和国(BMBF)からL.L.、N.F.、O.J.M.(IVOLADMT-HF;FKZ 01KC2006A)。

動物実験は、地域委員会(シュレースヴィヒ・ホルシュタイン州エネルギー大臣、ラントヴィルトシャフト、環世界、シュレースヴィヒ・ホルシュタイン州自然・デジタル協会、許可番号:V242-21249/2020 [38-4/20])の原則に基づいて実施されました。本研究に用いたマウスは、市販の供給源から入手した( 資料表参照)。動物を12時間の光、12時間の夜間サイクルで標準的な条件下で飼育した。水と食べ物は 自由に提供されました。
1.動物の世話
<ol><li>寝具、巣作り材料、隠れ場所、飲料水や食物への適切なアクセスを備えた特殊なケージにマウスを収容します。</li>
	<li>動物を継続的に専門の獣医管理と治療下に置いてください。 注意: 外部サプライヤーから注文されたマウスの場合、手順を開始する前に7日間の順応を確認してください。</li>
</ol>2. Oリングの準備
注:2週間後に心肥大を誘発するには、直径0.4mmの固定Oリングが推奨されます。誘発される心臓表現型の程度および重症度は、Oリング直径の大きさに依存する。
<ol><li>まず、顕微鏡下でOリング( 材料表を参照)をハサミまたはメスで1回切断し、大動脈の周りに配置できるようにします(図1A、B)。</li>
	<li>8-0で接続された針でカットに近い各リング側を突き刺します非吸収性の縫合糸と糸を引っ張ります。片側を2〜3 cm、反対側に2 cmカットして残し、最後のステップで大動脈の周りにOリングを固定します(図1C、D)。</li>
	<li>手術の前に、結紮補助具(種の器具、 材料の表を参照)を取り、片方のリング側の糸の端(長く保たれている)をくびれの穴に通します(図1E、F)。Oリングが取り付けられたライゲーションエイドを、次のステップ(ステップ6)に配置するために脇に置きます。</li>
	<li>糸でリングを消毒するには、リングをアルコール溶液に30分間入れます。その後、セルロースの上に置いて乾かします。使用するまで、乾燥したリングを密閉された浴槽またはケースに保管してください。手術中、結紮補助具を通して糸を引っ張った後、使用するまでリングをきれいな面に置きます。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig01.jpg"> 図1:結紮のためのOリング調製を行う 。 (A)直径が固定されたOリングを片面をハサミまたはメスで切断します。(B)Oリングの画像。(C)各Oリング側に8-0が突き刺さっていますプロレンスレッド。(D)2本の糸で穴を開けたOリング。(E)Oリングの片方のリング側のねじ山をライゲーションエイドの穴に通します。(F)配置前の最終位置:片側の糸はライゲーションエイドの穴を通して配置され、反対側の糸は緩んだままになります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.マウスの前投薬と手術野の準備
<ol><li>手術中に十分な鎮痛を受けるには、手術に進む20分前に鎮痛剤ブプレノルフィン(0.1 mg / kg、 材料表を参照)を腹腔内に注射します。 注:本研究では、鎮痛剤は、実験動物科学協会(GV-SOLAS)の推奨に従って使用されました。</li>
	<li>前投薬後、マウスを誘導チャンバーで麻酔し、2%〜4%イソフルランを0.5〜1.0 L / minの100%O2と混合します。</li>
	<li>鎮静マウスの左胸部の毛皮を剃ります。剃毛後、マウスをイソフルラン充填チャンバーに戻し、十分な鎮静を待ってから動物に挿管します。 注:鎮静の適切な時点は、ゆっくりとした呼吸を示しますが、スナップ呼吸を回避します。イソフルランガスの設定に応じて、適切なレベルの鎮静を達成するのに2〜3分かかります。</li>
	<li>動物の体温(37°C)を維持するために、手術前に加熱パッドをオンにします。加熱パッドを直腸プローブ( 材料表を参照)に接続して、マウスの体温を自動的に維持します。</li>
</ol>4.マウスの挿管
<ol><li>必要な機器を準備します(図2A)。手術前に喉頭鏡をアルコールに約1〜3分間入れてから、一晩乾燥させて消毒します。</li>
	<li>加熱パッドの周りに輪ゴムを伸ばして、前歯をプレートに固定します。鎮静マウスを仰臥位の加熱パッドに置きます。</li>
	<li>動物の前歯の上に輪ゴムを置き、プレートの首を伸ばします。</li>
	<li>気管内挿管のための気管の開口部の視認性を高めるために、光源を喉に焦点を合わせます(図2B)。</li>
	<li>挿管補助具(手作りの喉頭鏡、 資料表を参照)を片手でそっと口を開けます(図2A[3])。</li>
	<li>もう一方の手と小さな鉗子で、舌をそっと動かして気管の開口部をきれいにします。</li>
	<li>この手を使用して、気管内チューブを気管に導入します。一方、挿管補助剤をまだ保持します。挿管には、22 Gのカニューレを使用します( 材料表を参照)(図2A[1])。</li>
	<li>気管内チューブの位置を3方向活栓 を介して マウスの人工呼吸器( 材料の表を参照)に接続し、正しい気管内チューブの位置(気管内)を確認します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、適切な換気を監視します(一回換気量200μL、呼吸数100〜150呼吸/分)(図2C)。</li>
	<li>足指挟み反射チェックで十分な麻酔深度を確認(反射反応なし)。</li>
	<li>麻酔設定を0.5-1.0 L / min 100%O 2と混合した2%イソフルランに変えます。</li>
	<li>手術中の乾燥を避けるために、眼科用軟膏を目に塗ります。</li>
	<li>綿棒を使用して、市販の消毒液で手術部位を3回消毒します( 材料の表を参照)。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig02.jpg"> 図2:マウスの挿管。 (A)挿管器具: (1)22 G i.v.カニューレは気管内チューブとして使用されます(マンダリンなし)。(2)鉗子;(3)手作りの喉頭鏡(変形/平らにしたカニューレを木の棒とテープで接着)。(B)配置された加熱パッドに挿管を行う。(C)人工呼吸器に接続された挿管マウス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5.手術とリングポジショニングの準備
注意: 感染を避けるために、滅菌材料と器具を使用してください。
<ol><li>はさみを使用して、剣状突起と左腋窩の間の線の中央に長さ0.5〜1 cmの皮膚切開を行います。鉗子を使用して筋肉層を下にある肋骨から分離し、2つの開創器(長さ5 mm、 材料の表を参照)を切開部に配置して胸郭を露出させます。</li>
	<li>左開胸術を開始するには、マイクロスプリングハサミを使用して、第2肋骨と第3肋骨の間の肋間筋を小さく切開(~1〜2 mm)します。胸腔を開き、45°の角度の鉗子で切開を広げます。</li>
	<li>胸部開創器(長さ1.0〜2.5 mm)を3つ切開部に配置し、胸腔を開き、視覚化を改善します。</li>
	<li>大動脈弓を露出させるには、胸腺と脂肪組織を持ち上げて、細い先端の45°の角度の鉗子で胸腺と脂肪組織をアーチからそっと分離してみてください。</li>
</ol>6.横行大動脈とOリングの結紮
<ol><li>片手で45°の角度の鉗子で大動脈弓を露出させます。位置は、他方の手で、片側の糸 を介して 結紮助剤と接続されたOリングである(ステップ2)。</li>
	<li>大動脈弓の下の結紮補助具を使用して、腕頭動脈と左総頸動脈の間の横大動脈の尾側から頭蓋側に糸を通します(図3A)。</li>
	<li>結紮補助具と大動脈弓の間の両方の糸を鉗子で慎重に取ります。結紮補助具を引っ込めて取り外し、両側のねじ山を引っ張って、Oリングをアーチの周りにそっと配置します(図3B)。</li>
	<li>位置決めが成功したら、Oリングを糸と外科用結び目で固定します。両側の結び目が開かないように、追加の結び目を作成します(図3C)。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig03.jpg"> 図3:Oリング移植を行う 。 (A)大動脈弓は、1.0〜2.5mmの3つの開創器によって露出している。片方のリング側の両方の長い糸が大動脈の下を通過します。(B)Oリングは、リングをそっと押して糸を引っ張ることによって配置されます。(C)Oリングは正しい位置にあり、1本の頭蓋糸が両側に尾糸で結ばれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
7.縫合と術後の回復
<ol><li>3つの胸部開創器(長さ2.5 mm)を切開部から取り外します。</li>
	<li>必要に応じて、温かい0.9%等張塩溶液で胸郭を満たすことにより、胸部から残留空気を除去します。</li>
	<li>縫合のために胸郭切開部を露出させるには、再び2つの開創器(長さ5 mm)を取り、皮膚を側面に保持します。</li>
	<li>2つまたは3つの6-0非吸収性縫合糸( 材料の表を参照)で胸部を閉じ、人工呼吸器の流出を2秒間つまんで肺を再膨張させます。</li>
	<li>2つの開創器を取り外し、3〜5本の4-0-吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。</li>
	<li>イソフルランとモニターをオフにします。動物が自己呼吸を始め、ひげが動いていて、つま先のつまみ反射が引き起こされると、マウスを抜管します。ケアユニットのヒートランプの下の左側にマウスを置き、完全に目覚めるまで観察します。</li>
	<li>十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。 注:手術を受けた動物は、より良い回復のために独自のケアユニット(ケージ)を取得する必要があります。</li>
	<li>必要に応じて、飲料水中のトラマドール(1 mg / mL)を7日間、ブプレノルフィン(0.1 mg / kg、1日3回)を腹腔内注射で必要に応じて3日間疼痛管理します。. 注:術後鎮痛については、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。</li>
	<li>毎日水筒の重さを量って薬をチェックし、動物の行動を観察します。</li>
</ol>8.リングのくびれと正しい位置の確認
<ol><li>手術の1日後、狭窄の最大流速を測定し、超音波を使用して狭窄を確認します。</li>
	<li>測定には、超音波システムと周波数30 MHzのトランスデューサープローブを備えた心エコー検査を使用します(材料の表を参照)。</li>
	<li>上記のように、1.5%〜2%イソフルランのマスクを使用して麻酔を維持し、0.5〜1.0 L / minの100%O2を使用します。</li>
	<li>麻酔をかけた動物を仰臥位の加熱パッドに置きます。加熱パッドを直腸プローブに接続して体温を37°C±1°Cに維持し、4つのマウス足センサーを使用してECGで心拍数を監視します( 資料表を参照)。</li>
	<li>より良い視覚化のために、脱毛クリームを使用してください。</li>
	<li>ORABが正常に実行されると、超音波(~2,400 mm / s)で測定された狭窄上の流速が増加します(図4C)。この測定では、トランスデューサーヘッドを右胸郭側に傍胸部に配置し、2次元(2D)イメージング(「Bモード」)によって大動脈弓を局在化させます。<ol><li>カラードップラーを使用して大動脈の血流を視覚化し、狭窄上の血流速度をパルス波ドップラーで測定します。 注:偽手術マウス(狭窄のない対照手術)は、~600-900 mm / sの血流速度を示します。さらに、ORABが成功すると、マウスの右頸動脈(~150 mm/s)(RC、図 4A)と左頸動脈(~300 mm/s)LC、図4B)の速度流量比も増加します。</li>
	</ol></li>
	<li>左右の動脈内動脈を2次元(2D)イメージング(Bモード)で可視化します。探触子ヘッドを首の左右に45°の角度で水平に配置し、パルス波ドップラーを使用して血流速度を決定します。 注:偽手術マウスでは、両方の動脈の速度の流れは似ています。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig04.jpg"> 図4:頸動脈における脈波ドップラー速度測定による横行大動脈結紮の確認 。 (a)右頸動脈の代表的なパルス波ドップラー速度信号。(B)狭窄により、右頸動脈は左頸動脈よりも流速が速くなります。(C)狭窄によって誘発される狭窄は、下行大動脈の流速が2,400mm/sを超える結果となる。偽マウスは600-900 mm / sの流速を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

糸/縫合ベースの大動脈バンディングは、マウスの圧力過負荷心肥大を誘発するために長年使用されてきました。生体内での心臓リモデリングや疾患進行の病態メカニズムを調べるための確立された方法です 。 制限は、狭窄の程度の比較的高い分散であり、その結果、リモデリングです。Mellebyらによって最初に記述された最近導入されたORAB技術は10 、ゴム製のOリングを使用して従来の方法を最適化します。
この技術の最も価値のある利点は、Oリングの固定直径であり、これは狭窄の程度の変動性を少なくし、その結果、手術後の心肥大の表現型をより再現性のあるものにします。もう一つの利点は、この方法での学習が速く、配置が簡単なことです。糸/縫合ベースのプロセスでは、大動脈の周りの適切な結紮の程度を見つけるには、通常、時間と経験が必要です。対照的に、これは固定直径またはOリングのためにOリングアプローチで同じ程度に必要ではない。
開胸手術はORAB技術の重要なポイントであり、動物にとっては痛み...

生理的心肥大は発達、運動、妊娠中に観察できますが、病的心肥大は動脈性高血圧、心臓弁膜症、遺伝子変異などの血行動態ストレス状態に反応します。最初に、心臓は、心筋細胞サイズの増加と心室壁の肥厚を特徴とするリモデリングを受け、心機能を維持します1,2。一方、病的心臓リモデリングは、不整脈、突然死、および高い死亡率のリスクの増加と関連しています。最後に、時間の経過とともに、心室拡張、収縮機能の大幅な低下、そして最終的には心不全(HF)への進行をもたらし、これは高い罹患率、死亡率、および社会的コストに関連しています3。したがって、新しい治療戦略を開発するためには、分子背景を理解することが急務である4。
大動脈バンディングは、マウス5において圧力過負荷誘発性左心室(LV)肥大および心不全を模倣するモデルである。この方法を用いることにより、生体内の圧力過負荷誘発心臓リモデリングの病態メカニズムを調べることができる。マウスにおける最初の大動脈バンディング手順は、Rockmanらによって報告された6。圧力過負荷は、大動脈の周り(腕頭動脈と左総頸動脈の間)の糸縫合ベースの結紮によって誘発されます。直径0.4 mmの狭窄を作成するには、27 Gの針と大動脈の周りに縫合糸を配置します。結紮後、針を取り外し6,7。
針の直径は固定されていますが、糸の締め付けは外科医に大きく依存しているため、誘発された心肥大の表現型に影響を与えます。さらに、糸/縫合ベースの方法では、手術後の狭窄直径の程度が変動し、死亡率の分散が大きい8,9。さらに、この方法のトレーニングは、特に糸を締める際の適切なレベルと一貫性を見つけることに関して、困難です。最後に、訓練の開始時に、大動脈の破壊または他の組織損傷による術中および術後の高い死亡率、ならびに生存動物における狭窄の程度における高い変動が起こる。
最近、大動脈バンディングの最適化された手順がMellebyらによって記述されました10。内径0.71mm、0.66mm、0.61mmに固定された滑り止めゴム製Oリングを用いて、狭窄のばらつきが少なく、圧力過負荷の再現性が高いORAB(Oリング大動脈バンディング)法を発表した。要するに、Oリングは切り開かれ、上行アーチの周りに置かれ、そして糸によって再び閉じられる。これらのOリングを使用している他の科学者は、誘発された心肥大の変動性が少ないと報告しました9。彼らはまた、術中および術後の死亡率、ならびに誘発された肥大表現型の再現性の向上と変動の減少を観察しました9,11。本稿では、この独自の戦略の手順を段階的なプロトコルで説明します。このレポートで共有されている専門知識は、他の科学者がこの分野での技術を向上させるのに役立ちます。
6週間後に心不全を引き起こす心肥大を誘発するために、12週齢のC57BL / 6N雄マウスが手術に推奨されます。マウス亜系統C57BL / 6NとC57BL / 6Jの間の大動脈バンディングの2週間後の比較は、C57BL / 6Nマウスで重度の心機能障害と関連する死亡率の増加を示しました。したがって、これらは心不全のモデルにより適しています12。12週齢のオスとメスのマウスは、大動脈の露出と特別な器具によるOリングの配置に最適なサイズを持っています。

<table><tbody><tr><td>1 x ロングフィクセーター、6 cm</td><td></td><td>&nbsp;18200-01</td><td></td></tr><tr><td>2 x ブラントレトラクター、幅5 mm&nbsp;</td><td></td><td>18200-11</td><td></td></tr><tr><td>2 x ショートフィクセーター、3 cm</td><td></td><td>&nbsp;18200-02</td><td></td></tr><tr><td>2 x 細目先端 45°; 角度付き鉗子&nbsp;</td><td>FST (ファインサイエンスツール)</td><td>11160-10</td><td></td></tr><tr><td>3 x ブラントレトラクター 2.5 mm幅&nbsp;</td><td></td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>3 x リトラクターワイヤー&nbsp;</td><td></td><td>18200-05</td><td></td></tr><tr><td>4-0吸収性縫合糸(Vicryl)</td><td>ETHICON</td><td>SABBKLT0</td><td>皮膚の縫合に使用</td></tr><tr><td>6-0縫合糸(Prolene)、針サイズ:13 mm</td><td>ETHICON</td><td>JDP879</td><td>胸筋</td></tr><tr><td>8-0縫合糸(Prolene)、針サイズ:6.5 mm</td><td>ETHICON</td><td>RHBECH</td><td>リングを速くするために使用&nbsp;</td></tr><tr><td>麻酔ボックス、小型</td><td>ハーバード装置&nbsp;</td><td>50-0108</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6Nマウス</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluosorber 活性炭フィルターキャニスター</td><td>Havard 装置&nbsp;</td><td>34-0415</td><td>麻酔を誘発し維持するために使用されます</td></tr><tr><td>手作り喉頭用&nbsp;</td><td></td><td></td><td>挿管ヘルプ</td></tr><tr><td>ハーバード装置麻酔気化器ハーバー</td><td>ド装置&nbsp;</td><td></td><td>麻酔の誘導と維持に使用</td></tr><tr><td>加熱パッド+直腸プローブ (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 )</td><td>Panlab/ Havard apparatus&nbsp;</td><td></td><td>体温をコントロールし、維持するために使用&nbsp;</td></tr><tr><td>i.v. カニューレ ブルー 22 ゲージ (Vasofix Braun&uuml;le 0.9 x 25 mm)</td><td>B/Braunsharing Expertise&nbsp;</td><td>4268091B</td><td>挿管&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td>麻酔</td></tr><tr><td>コダン(ベタジン溶液)</td><td>Sch&uuml;lke</td><td>20003960-A</td><td>消毒&nbsp;</td></tr><tr><td>結紮助剤</td><td>FST(ファインサイエンスツール)</td><td>18062-12</td><td>Oリングとのリエーションを行うために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡照明:Schott VisiLEDセットMC1500 / S80-55(+コントローラー)</td><td>SCHOTT</td><td></td><td>Ligth</td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;カメラ&nbsp;(ライカIC80 HD)</td><td>ライカ</td><td></td><td>ビジュアリエーション操作分野に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>MiniVac完全麻酔システム&nbsp;小さなげっ歯類の場合</td><td>ハーバード装置&nbsp;</td><td>75-0233</td><td>麻酔の誘導と維持に使用</td></tr><tr><td>マウス人工呼吸器 MiniVent Type 845</td><td>Havard Apparatus&nbsp;</td><td>73-0044</td><td>手術時の換気に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ニードルホルダー&nbsp;</td><td>FST(ファインシエンスツール)</td><td>&nbsp;TE-10804</td><td></td></tr><tr><td>Oリング滑り止めゴム(0.0018mm×0.020mm)</td><td>りんごゴム製品&nbsp;</td><td></td><td>大動脈弓のリエイション</td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>FST (ファイン サイエンス ツール)</td><td>14040-09</td><td>皮膚と糸を切るために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>小動物用収納システム(200gまでの動物用キット)</td><td>FST(ファインサイズツール)</td><td>18200-20</td><td></td></tr>スモール<tr><td>ベースプレート、20 x 30 cm&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp;18200-03</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド+直腸プローブ+心電図および&nbsp;トランスデューサー三脚</td>付きテーブル富士<td>フイルムビジュアルソニックスイメージングシステム</td><td></td><td>心エコー&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic(ブプレノルフィン)</td><td>Indivior UK Limited</td><td>997.00.00</td><td>Pain pre-medication&nbsp;</td></tr><tr><td>三方止めコック(青)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トラマル(タマドール)</td><td>Gr&uuml;nental</td><td></td><td>投薬後の痛み&nbsp;</td></tr><tr><td>トランスデューサープローブ MS400 (Visual Sonics)&nbsp;</td><td>富士フイルム Visual Sonics イメージングシステム</td><td></td><td>心エコー検査&nbsp;</td></tr><tr><td>カーディオリジーパッケージ付き超音波装置&nbsp;</td><td>富士フイルム Visual Sonics イメージングシステム</td><td></td><td>心エコー検査&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td><td>FST (fine sience tools)</td><td>15000-08</td><td>肋間胸部の筋肉を切断するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>獣医軟膏&nbsp;</td><td>べぱんてん</td><td></td><td>目の乾燥を防ぐために使用されます</td></tr></tbody></table>

圧力過負荷誘発心肥大をモデル化するためのoリング大動脈バンディングと従来の横大動脈狭窄の比較

O-Ring Aortic Banding Versus Traditional Transverse Aortic Constriction for Modeling Pressure Overload-Induced Cardiac Hypertrophy

マウスの大動脈バンディングは、心圧過負荷誘発性心肥大および心不全の誘発に最も一般的に使用される実験モデルの1つです。以前に使用された技術は、狭窄を引き起こすために鈍い27Gの針の上に結ばれた大動脈弓の周りのねじ付き縫合糸に基づいています。この方法は、外科医が手動で糸を締めることに依存し、したがって、直径サイズの大きな変動をもたらす。Mellebyらによって記述された新しく洗練された方法は、手術後の変動が少なく、再現性が高いことを約束します。新しい技術であるOリング大動脈バンディング(ORAB)は、糸付きの縫合糸の代わりに滑り止めのゴムリングを使用しているため、圧力過負荷の変動が減少し、心肥大の再現可能な表現型が得られます。手術中、Oリングは腕頭動脈と左頸動脈の間に配置されます。成功した狭窄は心エコー検査によって確認されます。1日後、リングを正しく配置すると、Oリング誘発狭窄に対する横行大動脈の流速が増加します。2週間後、駆出率の低下と壁の厚さの増加によって心機能障害が証明されます。重要なことに、直径サイズのばらつきが少ないことに加えて、ORABは横行大動脈狭窄(TAC)と比較して術中および術後の死亡率が低いことに関連しています。したがって、ORABは、一般的に使用されているTAC手術よりも優れた方法であり、より再現性の高い結果をもたらし、必要な動物の数を減らすことができます。

一般に、大動脈バンディングはヒトの大動脈弁狭窄症を模倣し、マウスに心肥大を誘発する。成功した手順は、心肥大と心機能の低下に反映される心臓組織のリモデリングによって特徴付けられます5,6。
手術後1日目に直接、横行大動脈のOリング狭窄の影響は、心エコー検査13によってin vivoで判定することができる。大動脈弁狭窄症の誘導の成功は、パルス波ドップラー超音波によって測定された大動脈の狭窄に対する血流速度の増加によって示される(図4C)。さらに、上記のように、ORABの機能マーカーとして左右の内頸動脈の血流速度比を決定します(図4A、B)。
0.4 mm Oリングを配置してから2週間後、心肥大の誘導...

本プロトコールは、圧力過負荷心肥大を誘発するマウスにおける大動脈バンディングの新しい技術を記載する。バンディングには、内径が固定されたゴムリングが使用されます。この新しい手法は、将来の実験のために分散が少なく、再現性の高いデータを約束します。

圧力過負荷誘発心肥大をモデル化するためのOリング大動脈バンディングと従来の横大動脈狭窄の比較

Aortic banding in mice is one of the most commonly used experimental models for cardiac pressure overload-induced cardiac hypertrophy and the induction of ...

大動脈バンディングのこの新しい技術は、より少ない変動とより高い再現性でマウスの圧力過負荷心肥大の誘発を可能にします。大動脈の周りに固定直径のゴムリングを配置すると、横方向大動脈の流速が一貫して増加し、再現性のある心肥大が発生します。この手順は、げっ歯類の麻酔と顕微手術の技術をすでに経験している人、またはガイドできる経験のある人がいる人が実行する必要があります。まず、顕微鏡下でOリングをハサミまたはメスを使用して1回カットし、大動脈の周りに配置できるようにします。8-0で接続された針でカットに近い各リング側を突き刺します非吸収性縫合糸、および糸を引っ張ります。カットし、片側に2〜3センチメートル、反対側に2センチメートルを残して、最後のステップで大動脈の周りにOリングを固定します。手術の前に、結紮助剤を取り、片方のリング側の糸の端を結紮助剤の穴に通します。Oリングが取り付けられたライゲーションエイドを脇に置いて配置します。麻酔をかけたマウスの左胸部の毛皮を剃ります。次に、挿管前にマウスをイソフルラン充填チャンバーに戻し、十分な鎮静を行います。動物の体温を摂氏37度に維持するために、手術の前に加熱パッドをオンにします。加熱パッドを直腸プローブに接続して、マウスの体温を自動的に維持します。加熱パッドの周りに輪ゴムを伸ばして、前歯をプレートに固定します。麻酔をかけたマウスを加熱パッドの仰臥位に置きます。動物の前歯の上に輪ゴムを置き、プレートの首を伸ばします。気管内挿管のための気管の開口部の良好な視認性のために、喉に光源を集中させる。片手で口をそっと開き、もう一方の手で挿管補助具と小さな鉗子を配置します。舌をそっと動かして気管の開口部をきれいにします。気管内チューブを気管に導入し、一方、挿管補助具を保持し続けます。気管内チューブの位置を3方向活栓を介してマウスの人工呼吸器に接続し、正しい気管内チューブの位置を確認します。製造元の指示に従って、適切な換気を監視します。足指挟み反射チェックで十分な麻酔深度を確認します。手術中の乾燥を避けるために、眼科用軟膏を目に塗ります。市販の消毒液を使用して手術部位を消毒します。はさみを使用して、剣状突起と左腋窩の間の線の中央に0.5〜1センチメートルの長さの皮膚切開を行います。鉗子を使用して筋肉層を下にある肋骨から分離し、2つの5ミリメートルの開創器を切開部に配置して胸郭を露出させます。左開胸術を開始するには、マイクロスプリングハサミを使用して、第2肋骨と第3肋骨の間の肋間筋を1〜2ミリメートル切開します。胸腔を開き、45度の角度の鉗子で切開を広げます。胸部開創器を3本入れて胸腔を開き、視認性を向上させます。大動脈弓を露出させるには、細かい先端の45度の角度の鉗子で胸腺と脂肪組織をアーチから持ち上げて穏やかに分離してみてください。片手で45度の角度の鉗子で大動脈弓を露出させます。一方、ライゲーション補助剤に接続されたOリングを、先ほど取り付けた片側のネジ山を介して配置します。大動脈弓の下の結紮補助具を使用して、腕頭動脈と左総頸動脈の間の横大動脈の頭蓋側に尾から糸を通します。結紮補助具と大動脈弓の間の両方の糸を鉗子で慎重に取ります。結紮補助具を取り外し、両側の糸を引っ張って、Oリングをアーチの周りにそっと配置します。位置決めが成功したら、Oリングを糸と外科用結び目で固定します。両側で開かないように、追加の結び目を作ります。Oリングの結紮後、3つの胸部開創器を切開部から取り外します。必要に応じて、胸部を温かい0.9%等張塩溶液で満たして、胸部から残留空気を取り除きます。縫合のために胸郭切開部を露出させるには、2つの5ミリメートルの開創器をもう一度取って皮膚を側面に保持します。2つまたは3つの6-0非吸収性縫合糸で胸部を閉じます。2つの開創器を取り外し、3〜5本の4-0吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。次に、イソフルランとモニターをオフにします。人工呼吸器の流出を2秒間つまんで、肺を再膨張させます。手術の1日後、狭窄の最大流速を測定し、超音波を使用して狭窄を確認します。測定には、超音波システムと30メガヘルツの周波数のトランスデューサープローブを備えた心エコー検査を使用します。麻酔をかけた動物を仰臥位の加熱パッドに置き、加熱パッドを直腸プローブに接続して体温を摂氏37度に維持し、4つのマウス足センサーを使用してECGで心拍数を監視します。正常に実行されたOリング大動脈バンディングは、超音波によって測定されるように狭窄上の流速を増加させる。この測定では、トランスデューサーヘッドを胸骨傍右側に配置し、2次元イメージングによって大動脈弓を局在化させます。カラードップラーを使用して大動脈の血流を視覚化し、狭窄上の血流速度をパルス波ドップラーで測定します。左右の総頸動脈を2次元イメージングで可視化します。トランスデューサーヘッドを首の左右に45度の角度で水平に配置し、パルス波ドップラーを使用して血流速度を決定します。大動脈弁狭窄症の誘導の成功は、パルス波ドップラー超音波によって測定された大動脈の狭窄上の血流速度の増加によって見られました。さらに、左右の総頸動脈間の血流速度比をOリング大動脈バンディングの機能マーカーとして決定した。術後2週間で左室後壁と拡張期の脳室内中隔径の増加を認めた.さらに、心機能の進行性の悪化は、左心室駆出率の低下を測定することによって文書化されました。.大動脈弓の周りにOリングを固定しながら、最適な結果を得るには、両側のリングを結び目で閉じることが重要です。

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Medicine

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